CN103102404B - 日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫含鞘脂激活蛋白B结构域蛋白(SjSap)重组抗原蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，包括日本血吸虫SjSap基因序列的扩增、日本血吸虫SjSap重组质粒的构建和鉴定、重组蛋白的诱导表达和纯化等步骤。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。经过酶联免疫吸附试验(ELISA)的验证，本发明的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断候选靶标，可以作为日本血吸虫病诊断的目的抗原。

Description

日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及分子、细胞生物学研究领域，具体涉及日本血吸虫含鞘脂激活蛋白B结构域蛋白(SjSap)的重组抗原蛋白及其制备方法。此外，本发明还涉及该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。

背景技术

血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosoma)感染所引起的一种寄生虫病，广泛分布于非洲、中东、南美和东南亚的76个国家和地区。全球至少有2.4亿人受感染，7亿人受威胁，严重影响着人类的健康并阻碍流行区社会经济的发展。血吸虫病至今仍然是世界范围内的主要公共卫生问题之一；疫情严重的地区主要分布在非洲撒哈拉以南的国家，血吸虫感染的人数占全球总数的85％以上。全球每年死于血吸虫病的人数达28万。

血吸虫也称为裂体吸虫或住血吸虫，隶属于吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属。寄生于人体的血吸虫主要有6种，分别为曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)、日本血吸虫(S.japonicum)、埃及血吸虫(S.haematobium)、马来血吸虫(S.malayensis)、间插血吸虫(S.intercalatum)和湄公血吸虫(S.mekongi)。在世界范围内流行于感染人群的血吸虫有3种即曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫。在我国仅有日本血吸虫病的流行，它是我国5种主要的寄生虫病之一。由于日本血吸虫感染所导致的病情最为严重，也是防治难度最大的。主要原因在于日本血吸虫动物宿主多；成虫存活时间长；感染后宿主的伴随免疫以及治愈后的免疫力差；中间宿主钉螺分布广泛且难以消灭等等。

在血吸虫感染宿主的过程中，尾蚴、童虫、成虫和虫卵均可对宿主造成损害。其主要原因是血吸虫不同的发育时期可以释放不同的抗原诱导宿主的免疫应答，这些特异性免疫应答的结果是一系列免疫病理变化的出现，日本血吸虫对终末宿主的主要危害是虫卵肉芽肿反应和肝纤维化。目前，普遍认为血吸虫病是一种免疫性的疾病；根据病程和临床症状，血吸虫病可分为急性、慢性和晚期三种。

诊断是确定血吸虫感染率以及感染度的有效手段。诊断不仅为流行区的划分提供判断标准，还为血吸虫病防治活动的各个环节提供必不可少的信息和科学依据，在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果，还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病控制效果和评估流行趋势等等，均需要以诊断结果作为评判依据之一。

传统的病原学方法(粪便检查)是诊断血吸虫病最为经典和可靠的途径，是判断血吸虫感染与否的“金标准”。但是病原学方法工作强度大、诊断周期长，而且流行区人群的依从性逐年下降，收集病人粪便的难度不断增加。此外随着血吸虫病大规模防治规划的实施，流行区病人的感染度和感染率明显下降，病原学方法在血吸虫病低度流行区的敏感性有限，粪检查出病原的难度增大。因此，单纯依靠病原学的诊断方法已经不能适应大规模血吸虫病防治工作的需要。

免疫学的诊断方法具有操作简便、敏感性较高、特异性较好和流行区群众的依从性较高等优点，已逐渐为广大血防工作人员以及流行区群众所接受，并且在流行区化疗对象的大规模筛查、血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面起到了极为重要的作用。目前，血吸虫病免疫诊断最常用的抗原是成虫和虫卵抗原，但抗原成分复杂，制备步骤繁琐，来源有限且不易质控，难以适应大规模现场疾病普查的需求。依靠基因工程方法生产的重组抗原分子可为现场推广应用提供大量的抗原材料，且成分明确、特异性好。

鞘脂激活蛋白(Saposin)是由其前体蛋白(Prosaposin)产生的热稳定性蛋白家族，包括鞘脂激活蛋白A、B、C、D。其功能是作为鞘脂糖水解途径中所涉及到的溶酶体酶的激活剂，参与带有短的寡糖链的脂类的代谢。四种鞘脂激活蛋白的结构相似，均有形成二硫键以稳定结构的6个半胱氨酸、一个糖基化位点以及同一位点的保守脯氨酸残基。鞘脂激活蛋白B(SaposinB)是最早被发现和研究的鞘脂激活蛋白，该蛋白可以活化芳香基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶、酸性β-半乳糖苷酶等多种酶类，参与部分糖脂和甘油脂的代谢等，因此被认为是一种非特异性的激活蛋白。

鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-likeprotein，SAPLIP)是一大类具有saposin结构域的蛋白家族，广泛存在于原生动物到哺乳动物的体内，并发挥各种生物学作用。Espino等采用肝片吸虫的重组SAPLIP蛋白(rFhSAP-2)免疫兔子，初次免疫后2周即可产生高水平的rFhSAP-2特异性抗体，两次免疫后攻击感染获得了81.2％的减虫率，在粪便和肝脏中分别获得了83.8％和73.0％的减卵率，表明该蛋白是一种很好的疫苗候选分子。

Lee等使用重组的华支睾吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(clonorin)分别对华支睾吸虫病人(20份)、后睾吸虫病人(9份)、并殖吸虫病人(20份)、日本血吸虫病人(20份)、裂头蚴病人(20份)、猪囊尾蚴病人(20份)和正常人(40份)进行ELISA试验，结果显示该重组蛋白用于免疫诊断具有34％的敏感性和99％的特异性；clonorin特异性的IgG抗体水平在囊蚴感染后8周显著升高，并维持较长时间。

Don等表达了曼氏血吸虫的鞘脂激活蛋白样蛋白Sm-SLP-1(包含1个SAPLIP结构域)和Sm-SLP-2(包含2个SAPLIP结构域)，免疫定位试验显示该蛋白主要表达于消化道内皮，推测可能与血红蛋白的消化相关。重组的Sm-SLP-1蛋白不仅可以被感染的小鼠血清识别，还可以被病人血清识别，提示该蛋白可能具有潜在的诊断价值。

张纯等克隆并表达了日本血吸虫12kDa的鞘脂激活蛋白样蛋白(Sj-SLP)，纯化的重组蛋白(rSj-SLP)能被感染兔血清识别，而不被正常兔血清识别；rSj-SLP免疫新西兰大白兔可产生1∶12800的特异性抗体，表明该蛋白具有较强的免疫原性和抗原性。

日本血吸虫含鞘脂激活蛋白B结构域蛋白(SjSap)是一种含有SaposinB的结构域的蛋白，与SAPLIP具有类似的疏水氨基酸的分布、具有形成二硫键以稳定结构的6个半胱氨酸以及保守的脯氨酸残基。该蛋白与已报道的SAPLIP家族成员的氨基酸序列同源性低于30％，是血吸虫新的蛋白序列。本发明通过PCR扩增出日本血吸虫SjSap全基因，并在大肠杆菌中重组表达此基因，得到大小约为20kDa的重组蛋白，经ELISA试验确认所得重组蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断抗原候选靶标，从而完成了本发明。

在本发明之前，还没有出现涉及本发明日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白及其用于日本血吸虫病诊断的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之二是提供一对用于日本血吸虫SjSap基因PCR扩增的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之三是提供该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供该日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。

本发明通过生物信息学技术分析获得了日本血吸虫SjSap的编码基因序列(如SEQIDNO.1所示序列(GenbankFN315902.1))。利用分子生物学技术对日本血吸虫SjSap基因进行PCR扩增，纯化扩增产物，将所得产物、质粒载体pET-28a(+)分别进行酶切、回收，连接构建成SjSap基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjSap，通过转化筛选，抽提重组质粒，经PCR、测序及酶切鉴定确认后，转化至宿主细胞大肠肝菌中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，鉴定重组蛋白的溶解性；由于表达的重组蛋白为包涵且难溶于变性剂中，因此直接将全菌体进行SDS-PAGE，经卡马斯亮蓝染色后切下目的条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收纯化目的蛋白，最终得到纯化的重组蛋白SjSap，完成了SjSap基因的体外克隆表达及纯化。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一个方面是提供一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白，其具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。

本发明第二个方面是提供了一对用于日本血吸虫SjSap基因PCR扩增的特异性引物，其序列为：

上游：5′-CCGATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG-3′(如SEQIDNO：3所示)或其互补链；

下游：5′-CCGTTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC-3′(如SEQIDNO：4所示)或其互补链。

本发明第三个方面提供了一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)日本血吸虫SjSap基因序列的扩增(用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA中获得SjSap的DNA片段)；

2)日本血吸虫SjSap重组质粒的构建和鉴定：用pET-28a(+)载体构建日本血吸虫SjSap重组表达质粒pET-28a(+)-SjSap；

3)将pET-28a(+)-SjSap重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达的重组蛋白SjSap；

4)PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收纯化表达的重组蛋白SjSap。

步骤1)日本血吸虫SjSap基因序列的扩增，具体为：

以含有日本血吸虫SjSap基因序列的cDNA克隆为模板，SEQIDNO.3(CCGATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG)或其互补链为5’引物，SEQIDNO.4(CCGTTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC)或其互补链为3’引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(GelExtractionKit)回收纯化。所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，72℃延伸10min，30个循环；最后保存于4℃。

步骤2)构建可在宿主细胞中表达SjSap编码基因的重组质粒pET-28a(+)-SjSap，具体为：

将纯化的SjSap基因PCR产物片段和质粒载体pET-28a(+)分别用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行酶切，用胶回收试剂盒(GelExtractionKit)回收纯化。纯化后的目的基因片段和载体酶切片段按照3∶1(摩尔比)的比例进行连接，构建成SjSap编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjSap。将此质粒通过CaCl₂法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，用AxyPrep质粒小量制备试剂盒抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定及酶切鉴定。

步骤3)重组质粒pET-28a(+)-SjSap在大肠肝菌(宿主细胞)中的表达，具体为：

通过钙转化将上述抽提所得pET-28a(+)-SjSap重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上。随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂(IPTG)继续培养。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。

步骤4)纯化SjSap重组蛋白：

取表达重组蛋白SjSap量较高的冻存菌种划线于含卡那霉素的LB琼脂平板上，培养过夜之后，随机挑取上述平板上的菌落接种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入BugBuster蛋白抽提剂裂解细菌，离心后保留上清液与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果。根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，沉淀难溶于变性剂。将表达重组蛋白的全菌体进行SDS-PAGE，凝胶经考马斯亮蓝染色后，切下目的条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒进行回收纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。

本发明第四个方面提供了一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在检测日本血吸虫病人血清抗体中的应用。本发明以纯化的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白包被酶标板，4℃过夜。加入封闭液，100μl/孔，封闭酶标板上的非特异性结合位点。分别加入1∶100稀释的血吸虫病人血清、其他常见人体寄生虫病人血清和正常人血清，100μl/孔，每份样品均做复孔，于37℃反应2小时。每孔加入100μl的HRP标记羊抗人IgG全分子(Sigma-Aldrich，适当的稀释度)，37℃反应1小时。加入100μl/孔的TMB底物溶液，室温显色后加入100μl/孔的2MH₂SO₄终止反应。用酶标仪读取OD450_nm的数值。以上各步骤之间分别用PBST(磷酸盐吐温缓冲液)进行洗涤。

经上述日本血吸虫SjSap重组蛋白的间接ELISA试验的验证，本发明的日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断抗原候选靶标，可以作为日本血吸虫病免疫诊断的目的抗原。

附图说明

图1是实施例1中日本血吸虫SjSap基因序列的扩增结果示意图。图1中，M：DNA分子量标准；1：SjSap；2：空白对照。

图2是实施例3中日本血吸虫SjSap基因重组质粒菌落PCR鉴定结果示意图。图2中，M：DNA分子量标准；1-4：SjSap；5：空白对照。

图3是实施例4中日本血吸虫重组蛋白(SjSap)的SDS-PAGE分析结果示意图。图3中，M：蛋白分子量标准；1：未诱导对照；2：诱导后4h(1mM/LIPTG)；3：菌体裂解后上清；4：菌体裂解后沉淀。

图4是实施例5中SjSap重组蛋白纯化效果的SDS-PAGE分析结果示意图。图4中，M：蛋白分子量标准；1：未诱导对照；2：诱导后4h(1mM/LIPTG)；3：菌体裂解后上清；4：菌体裂解后沉淀；5纯化后SjSap重组蛋白。

图5是实施例6中SjSap重组蛋白用于血清抗体检测的敏感性和特异性试验结果示意图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

主要试剂如表1所示：

表1

主要仪器设备如表2所示：

表2

PCR仪	美国Bio-Rad
		蛋白电泳仪	美国Bio-Rad
台式高速冷冻离心机	德国eppendorf
		高速冷冻离心机(CR22F)	日本日立
Milli-Q纯水系统	美国Millipore

试验材料：

日本血吸虫成虫(安徽省池州市贵池区阳性钉螺本实验室感染昆明鼠收集)cDNA、宿主菌株大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)，均由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供。

实施例1日本血吸虫SjSap基因的克隆

1.1SjSap基因片段的扩增和纯化：

1.1.1根据SjSap基因(GenbankFN315902.1)的序列(如SEQIDNO.1所示序列)，利用PrimerPremier5.0软件设计一对特异性引物，如下：

PF：5′-ATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG-3′(如SEQIDNO.3所示)；

PR：5′-TTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC-3′(如SEQIDNO.4所示)；

斜体部分表示的是上下游引物的保护性碱基，粗体部分是上游引物的EcoRI酶切位点和下游引物的XhoI酶切位点。特异性引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.1.2以日本血吸虫成虫cDNA为模板，进行PCR反应，扩增SjSap基因，反应体系如下：

反应条件：

用1.2％琼脂糖凝胶(GoldView^TM核酸染料)电泳检测PCR产物，观察是否存在目的条带，结果如图1所示，M：DNA分子量标准，1：SjSap，2：空白对照。PCR反应的结果显示，约534bp处有一条清晰的条带，与预期片段的大小相符，表明成功从cDNA中扩增出SjSap基因。

1.1.3PCR产物的纯化回收(QIAGEN公司的胶回收试剂盒)

1)电泳结束后，用干净、锋利的刀片将DNA目的片段从琼脂糖凝胶上切割下来。

2)将切下的凝胶块捣碎置于离心管中并称重，加入3倍于凝胶体积的BufferQG(100mg的凝胶约折合为100μl的体积)。

3)离心管于50℃水浴中孵育10min，为加速凝胶溶解，每隔2-3min将离心管取出上下颠倒混匀。

4)待凝胶完全溶解后，观察离心管内液体颜色是否与BufferQG未溶胶前的颜色基本一致；若管内液体变为橙色或紫色，需加入10μl3M的醋酸钠(pH5.0)调节pH值。

5)向离心管中加入1倍于凝胶体积的异丙醇，混匀。

6)试剂盒中的QIAquickspincolumn置于2ml收集管中；将离心管中的液体加入QIAquickspincolumn中，13000rpm，离心1min，弃滤液。

7)将QIAquickspincolumn置回原离心管中，加入500μlBufferQG，13000rpm，离心1min，弃滤液。

8)向QIAquickspincolumn中加入750μlBufferPE洗柱，静置2-5min，13000rpm，离心1min，弃滤液。

9)于13000rpm，再次离心2min，以除去残留的BufferPE。

10)将QIAquickspincolumn置于新的1.5ml离心管中；加入30μlBufferEB于QIAquickspincolumn的膜中央，静置4min，13000rpm，离心1min，收集洗脱液，保存于-20℃。

11)用琼脂糖凝胶电泳检测回收效率，并估算DNA片段的浓度。

实施例2SjSap基因重组质粒pET-28a(+)-SjSap的构建

2.1PCR产物双酶切及回收

将回收的PCR目的片段于37℃水浴双酶切过夜，酶切反应体系如下：

酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶(GoldView^TM核酸染料)电泳，切下目的条带，再次回收DNA分子，回收方式同实施例1中1.1.3，回收产物保存于-20℃。

2.2pET-28a(+)空载质粒的制备(AxyPrep质粒小量制备试剂盒)

在LB平板(含50μg/ml的卡那霉素)上挑取含pET-28a(+)质粒的单菌落于5mlLB培养基(含50μg/ml的卡那霉素)中，37℃培养过夜。次日，取1ml培养液转入1.5ml离心管中，保存于4℃作为菌种。将剩余的培养液于5000rpm，离心10分钟，弃上清。用250μl已加入RNaseA1的BufferS1重悬细菌沉淀(悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解)。加入250μlBufferS2，温和但充分地上下翻转混合6次，直至形成透亮的溶液。加入400μlBufferS3，温和并充分地上下翻转混合10次，室温静置2分钟，14000rpm离心10分钟(若仍有悬浮物，可轻轻颠倒混匀后再次离心3分钟)。将离心后的上清液转移到制备管中，置于2ml离心管，1400rpm离心1分钟。将滤液再次转移到制备管以同样的方法重复结合一次。弃滤液，将制备管置回到原离心管中，加入500μlBufferW1进行洗涤，14000rpm离心1分钟。弃滤液，将制备管置回到原离心管中，加入700μlBufferW2(已加入适当体积的无水乙醇)，14000rpm离心1分钟，弃滤液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次，弃滤液。将制备管置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。将制备管移入新的1.5ml离心管，在制备管的膜中央加20μlEluent(Eluent提前加热至65℃，可提高洗脱效率)，室温静置1分钟；14000rpm离心1分钟进行洗脱。将洗脱液重新加入制备管膜中央，室温静置1分钟，14000rpm离心1分钟再次洗脱DNA。洗脱液置于-20℃保存，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒DNA。(参照AxyPrep质粒小量制备试剂盒操作手册)

2.3pET-28a空载质粒的双酶切

加入限制性内切酶酶切pET-28a(+)空载质粒，37℃水浴反应过夜，反应体系如下：

酶切产物进行1％琼脂糖凝胶(GoldView^TM核酸染料)电泳，切下目的片段进行回收纯化，回收方式同实施例1中1.1.3，样品保存于-20℃。

2.4重组质粒的构建

按照3∶1(摩尔比)的比例将回收后的外源基因片段与表达载体片段进行连接，连接体系如下：

反应体系于16℃水浴中连接过夜，构建pET-28a(+)-SjSap重组质粒。

实施例3日本血吸虫SjSap表达载体的鉴定

3.1连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞

将实施例2的2.4中的连接产物与E.coliDH5α感受态细胞轻轻混合，冰浴30分钟，于42℃水浴热激1.5分钟，再次冰浴5分钟。无菌条件下向培养管中加入900μl的SOC培养基，37℃，200rpm，振荡培养1小时。将培养好的菌液于3500rpm，离心3分钟，弃去大部分上清，留约100μl培养基重悬菌体。将重悬液均匀涂布于LB平板(含50μg/ml的卡那霉素)上，37℃倒置培养过夜，观察菌落生长情况。

3.2重组质粒的PCR鉴定

随机挑取平板上的单个菌落进行菌落PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测(结果如图2所示)，经过PCR鉴定显示在预计的分子量大小处出现目的条带，表明有外源基因片段的插入。

3.3重组质粒的测序鉴定

选择可扩增出目的条带的单菌落送英潍捷基贸易有限公司进行测序，以检验插入片段的序列是否正确。测序分析结果表明插入的外源基因片段序列正确，重组质粒构建成功。

实施例4日本血吸虫SjSap的重组质粒在E.coli中的表达及鉴定

4.1pET-28a(+)-SjSap重组质粒的诱导表达

1)取1μl测序正确的pET-28a(+)-SjSap重组质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，转化方法同实施例3中的3.1。

2)次日，分别于每个平板上各随机挑取6个单菌落接种于5ml的LB培养基(含含50μg/ml的卡那霉素)，37℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀＝0.6。

3)取出1ml菌液作为菌种，再取出2ml菌液不加IPTG作为对照，剩余的2ml菌液加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，37℃，250rpm，继续培养4小时。

4)将培养好的菌液于4℃，5000rpm离心10分钟收集菌体，弃去上清。

4.2SDS-PAGE鉴定诱导产物

向诱导管和对照管中分别加入200μl1×PBS重悬菌体沉淀。分别从诱导管和对照管中取出5μl的重悬液，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液5μl，混匀后于100℃煮沸5分钟变性。每个上样孔中分别加入8μl的样品，进行SDS-PAGE分析，分离胶为12％，浓缩胶为5％。凝胶配方如下表3所示：

表3

设置浓缩胶的电压为80V，分离胶的电压为100V进行电泳。待溴酚蓝指示剂逸出玻璃板下边缘时关闭电源。取下凝胶用染色液染色2小时，再用脱色液脱色，直到蛋白条带清晰可见。

如图3所示，将pET-28a(+)-SjSap重组质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达后较诱导前的菌体出现了分子量约为20kDa的明显表达条带，即为目的基因与Histag融合表达的产物，大小与理论相对分子量相符。

4.3重组蛋白溶解性鉴定

将已确定可表达重组蛋白的E.coliBL21(DE3)菌种接种到100mlLB培养基(含50μg/ml的卡那霉素)中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6。将培养的菌液取出1ml作为菌种，另取2ml作为对照。向剩余的菌液中加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm继续培养4小时。

诱导后的菌液经5000rpm，4℃，离心10分钟，弃尽上清，向菌体沉淀中加入5ml的BugBuster蛋白抽提剂(Novagen)，充分悬浮沉淀后，将悬浮液转入离心管中，置于摇床上，室温裂解菌体1小时。将细菌裂解液于4℃，10000rpm离心10分钟，取上清保存于另一干净的离心管中，挑取少量沉淀用适当体积的PBS重悬。分别取出5μl的上清和沉淀重悬液作SDS-PAGE分析，鉴定重组蛋白的溶解性。电泳结果(图3)显示重组蛋白主要位于沉淀中，形成包涵体。

实施例5重组蛋白SjSap的纯化

5.1重组蛋白的纯化

1)将已确定可表达重组蛋白的E.coliBL21(DE3)单克隆于前一日接种到5mlLB培养基中(含50ug/ml的卡那霉素)，37℃，200rpm培养过夜。

2)次日，将培养过夜的菌液转接到500ml的LB(含50μg/ml的卡那霉素)培养基中，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀约为0.6。

3)取1ml菌液作为未诱导对照，剩余菌液中加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm，继续诱导培养4h。

4)诱导后的菌液10000rpm，4℃，离心15min，弃尽上清，用适当体积的PBS重选菌体沉淀，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后于100℃煮沸5分钟变性。

5)按照实施例4中4.2的方法进行SDS-PAGE，分离蛋白条带；用干净的手术刀片切下脱色后胶块中含有目的条带的部分，放入1.5ml的离心管中，用双蒸水洗2次，每次5min。

6)用研磨棒将离心管中的胶块研磨成细小的碎片，将干粉和DTT(二硫苏糖醇)完全溶解于溶液A，再向离心管中加入400μl的溶液A(溶液A、干粉和DTT，均来自PAGE胶蛋白微量回收试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司，产品编号：BSP062)，在室温条件下，摇床上震荡过夜(16-18h)，期间取出，偶尔震荡几次。

7)室温12000rpm离心15min，转移上清至2ml的离心管中，加入2ml预冷的溶液B，混匀，4℃静置30min。

8)室温12000rpm离心15min，去除上清，再次加入0.5ml的溶液B(来自PAGE胶蛋白微量回收试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司，产品编号：BSP062)，震荡洗涤沉淀，4℃静置15min。

9)室温12000rpm离心15min，去除上清，将离心管置于通风橱中，使残留的液体挥发干净。

10)加入适当体积的PBS(磷酸盐缓冲液)溶解沉淀，SDS-PAGE检测重组蛋白纯化的效果。电泳结果如图4所示，表明割胶回收后获得了纯度较高的重组蛋白。

5.2重组蛋白浓度的测定

利用Bradford蛋白质定量试剂盒(天根)测定重组蛋白的浓度，按照说明书进行操作。主要步骤包括：

考马斯亮蓝溶液在使用前先平衡至室温并温和颠倒混匀，预热分光光度计。将0、5、10、15、20、25、30μl牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1mg/ml)分别加入到离心管中，加PBS补足至75μl。将适当体积纯化的重组蛋白加入到离心管中，并用PBS补足75μl。向各离心管中加入1425μl考马斯亮蓝溶液，混匀，室温静置10分钟。用分光光度计测定595nm处的吸光值，并记录读数。以不含BSA样品的光吸收值作为空白对照，绘制标准曲线，计算待测样品的蛋白浓度。如果所得到的蛋白浓度超出标准曲线的范围，根据情况将样品稀释或浓缩后重新测定。根据工会四和重组蛋白的稀释度计算出纯化后SjSap重组蛋白的浓度为0.815mg/ml。

用于绘制标准曲线的各管溶液反应体系如下表4所示：

表4

实施例6日本血吸虫SjSap重组蛋白的ELISA反应

6.1间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性试验

1)重组蛋白以最佳包被浓度包被酶标板，4℃过夜。

2)PBST洗板3次，每次静置3分钟。然后加入封闭液，100μl/孔，于4℃封闭过夜。

3)PBST洗板3次，每次静置3分钟。分别加入1∶100稀释的病人血清(安徽省)和正常人血清(宁夏省)，100μl/孔，每份样品均做复孔，于37℃反应2小时。每板同时设阳性参照(病人混合血清)、阴性参照(正常人混合血清)和空白参照(PBS)。

4)用PBST洗板6次，每次静置3分钟。每孔加入100μl的HRP标记羊抗人IgG全分子(Sigma-Aldrich，1∶20000稀释)，37℃反应1小时。

5)PBST洗板6次，每次静置3分钟。加入100μl/孔的TMB底物溶液，室温显色后加入100μl/孔的2MH₂SO₄终止反应。

6)用酶标仪读取OD450_nm的数值。

6.2间接ELISA方法检测血清抗体的特异性试验

基本方法同实施例6中6.1，与重组蛋白反应的第一抗体分别为华支睾吸虫病人血清(广东省)、囊虫病人血清(云南省)、并殖吸虫病人血清(中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制门诊收集)、旋毛虫病人血清(云南省)和正常人血清(宁夏省)。以正常人血清反应的OD均值的2.1倍作为判断阴阳性的临界值(CUTOFF)，OD均值＝0.131，CUTOFF＝0.275，如表5、图5所示，SjSap重组蛋白检测日本血吸虫病人血清的敏感性为80％(40/50)，检测非流行区正常人血清无假阳性反应(0/30)，与旋毛虫病人血清无交叉反应(0/8)，与囊虫病人、并殖吸虫病人和华支睾吸虫病人的交叉反应率分别为10％(1/10)、16.7％(1/6)和20％(1/5)。该试验结果表明SjSap重组蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断抗原。

表5SjSap重组蛋白检测血清抗体的敏感性和特异性

Claims (1)

1.一种日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病人血清抗体的试剂中的应用，所述日本血吸虫SjSap重组抗原蛋白为SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白。