CN105238744A

CN105238744A - 一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105238744A
Application number: CN201510705882.6A
Authority: CN
Inventors: 王英男; 杨勇; 吴亦波; 毛健
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105238744B

Abstract

本发明公开了一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其应用，属于XX技术领域。本发明的试剂盒包括9mLmHTF、25μlHexadecanoicAcid、25μlTrans-13-OctadecenoicAcid、20μl9,12-Octadecenoic、30μlArachidonicAcid、50μlDocosahexaenoateAcid。将试剂盒中各试剂置于37℃下混合平衡2～3小时，得到10.15ml精子培养体系；将用精子分裂液分离出来的精子按1000万/mL的浓度用上述精子培养体系重悬后，轻轻混匀，置于37℃恒温箱中放置90～120分钟，即可达到提高精子活力的效果。利用本发明试剂盒可以显著提高精子前向运动活力，在人工授精和体外受精技术中使用，可以改善妊娠结局，提高受精率；同时对严重弱精子症患者的治疗又提供了新方法。

Description

一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其应用，属于XX技术领域。

背景技术

据世界卫生组织数据显示，全球约15％的育龄夫妇面临着不孕不育的威胁，我国近期调查结果显示国内不孕症者占已婚夫妇人数的10％，而且发病率呈上升趋势。其中占据人类不孕不育症患者一半左右的是男性不育症的患者而弱精症则是常见男性不育的原因之一。临床常通过人工授精进行治疗，数据显示，较好的精子动力是提高辅助生殖技术成功率的一个重要条件。

精液的主要成分是精子和精浆，精子来源于睾丸，是受精的主体，其质膜上含有多种脂肪酸，它们对于精子的活动具有非常重要的作用。在辅助生殖技术操作实施过程中，常规处理精子的方法是洗去精浆，活力低的精子及死精子，然后用人工合成的培养液培养精子，人工合成的培养液包括BWW、mHTF、台式液等等。上述培养液主要为精子提供了一个缓冲和基本供能环境，对精子活力的提高作用不明显。因此，在临床上开发一种提高精子活力的培养体系就显得尤为重要。

发明内容

为了克服上述问题，本发明进行大量研究，发现精子中的一些脂肪酸对于精子活力的提高具有重要作用，例如HexadecanoicAcid(十六酸甲酯)、Trans-13-OctadecenoicAcid(反式-13-十八碳烯酸)、9,12-OctadecenoicAcid(12-羟基-9-十八碳烯酸)、ArachidonicAcid(花生四烯酸)、DocosahexaenoateAcid(二十二碳六烯酸)。而这些脂肪酸的加入对于提高精子活力具有非常重要的作用。

本发明的第一个目的是提供一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒，所述试剂盒中含有试剂HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid、DocosahexaenoateAcid。

在本发明的一种实施方式，所述试剂盒中HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid、DocosahexaenoateAcid的体积比为5:5:4:6:10。

在本发明的一种实施方式，所述人精子是离体之后用经精子分离液分离后的精子。

本发明的第一个目的是提供所述试剂盒在提高离体之后的人精子的活力方面的应用方法。

所述应用方法是取9mL的ModifiedHumanTubalFluid改良后人输卵管液，简称mHTF)、1mL的serumsubstitutesupplement(血清替代物，简称SSS)，然后添加试剂盒中的HexadecanoicAcid25μl、Trans-13-OctadecenoicAcid25μl、9,12-OctadecenoicAcid20μl、ArachidonicAcid30μl、DocosahexaenoateAcid50μl制成10.15ml的培养液，用该培养液重悬离体之后用精子分裂液分离出来的精子，轻轻混匀，置于37℃放置1～3小时。

在本发明的一种实施方式，所述应用方法中，37℃放置时间为1.5～2h。

在本发明的一种实施方式，所述应用方法中，精子按照终浓度1000万/mL的浓度进行重悬。

本发明的第三个目的是提供一种人精子体外培养液，所述培养液中含有脂肪酸HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid和DocosahexaenoateAcid。

在本发明的一种实施方式，所述体外培养液中脂肪酸HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid和DocosahexaenoateAcid的体积为5:5:4:6:10。所使用的是食品级脂肪酸。

在本发明的一种实施方式，所述体外培养液中还含有mHTF、SSS。

在本发明的一种实施方式，所述体外培养液，每10.15ml中含有9mL的mHTF、1mL的SSS、25μlHexadecanoicAcid、25μlTrans-13-OctadecenoicAcid、20μl9,12-OctadecenoicAcid、30μlArachidonicAcid、50μlDocosahexaenoateAcid。

本发明的第四个目的是提供所述体外培养液在提高离体之后的人精子的活力方面的应用，是将离体之后用精子分裂液分离出来的精子，用所述体外培养液重悬、轻轻混匀，置于37℃放置1～3小时。

在本发明的一种实施方式，所述精子是按照终浓度1000万/mL的浓度进行重悬。

本发明的有益效果：

本发明试剂盒试剂中的HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-OctadecenoicAcid、ArachidonicAcid、DocosahexaenoateAcid均为食品级脂肪酸，对于精子本身没有任何毒害效应，且目前已拥有成熟的大量生产技术，可投入广泛的临床及实验室使用。利用本发明体外培养液处理后的精子其前向运动活力提高显著，可使正常活力精子的平均前向运动精子比例提高18％左右，弱精子症患者的精子的平均前向运动精子比例提高12％左右。本发明的试剂盒和体外培养液可以在人工授精和体外受精技术中使用，可以改善妊娠结局，提高受精率；同时对弱精症患者的治疗又提供了新方法。

附图说明

图1为正常活力精子标本使用目的培养液前后精子动力改善状况；

图2为弱精子症患者标本使用目的培养液前后精子动力改善状况。

具体实施方式

实施例1：

样本来源：三份正常活力精子标本(标准按WHO五版)

精子处理：

1、预热10mL含体积分数为10％SSS的mHTF(作为培养前对照组)，2mLIsolate精子分离液和10mL本发明的体外培养液。

2、将收集有精液的取精杯置于37℃水浴，待液化后取出。

3、将预热的含体积分数为10％SSS的mHTF与液化后精液混匀，缓缓加入到Isolate精子分离液上，300g离心10分钟。

4、离心后弃上清，取下层分离后精子镜检，记录精子活力，作为培养前对照组。

5、将步骤4剩余精子按1000万/ml的浓度与本发明精子体外培养液混匀，置于37℃温箱90～120分钟。

6、取精子镜检，记录精子活力。

最终结果(图1)：本发明精子培养体系培养前平均前向运动精子比例为54.7％，培养后平均前向运动精子比例为72.9％，(p<0.01)

实施例2：

样本来源：三份弱精子症患者精子标本(标准按WHO五版)

精子处理：

1、预热10mL含体积分数为10％SSS的mHTF(作为培养前对照组)，2mLIsolate精子分离液和10mL本发明体外培养液。

2、将收集有精液的取精杯置于37℃水浴，待液化后取出。

3、将预热的含体积分数为10％SSS的mHTF与液化后精液混匀，缓缓加入到Isolate分离液上，300g离心10分钟。

5、将步骤4剩余精子按1000万/ml的浓度与本发明精子培养体系混匀，置于37℃温箱90～120分钟。

6、取精子镜检，记录精子活力。

最终结果(图2)：本发明精子培养体系培养前平均前向运动精子比例为32.1％，培养后平均前向运动精子比例为43.9％(p<0.01)

实施例1-2中使用的mHTF为IrvineScientific，购买自美国，货号：90126150402；serumsubstitutesupplement(血清替代物，简称SSS)购自美国，货号：99193150201.

实施例1-2中使用的本发明精子体外培养液制备如下：9mLmHTF、1mLSSS、25μlHexadecanoicAcid、25μlTrans-13-OctadecenoicAcid、20μl9,12-OctadecenoicAcid、30μlArachidonicAcid、50μlDocosahexaenoateAcid置于37℃下混合平衡1～3小时，得到10.15ml精子体外培养液。此外，本发明还发现，当上述脂肪酸添加种类减少(比如只添加三种或四种)，对精子活力的改善效果会大大降低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种改善人精子活力的体外培养液，其特征在于，所述培养液中含有脂肪酸HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid和DocosahexaenoateAcid。

2.根据权利要求1所述的体外培养液，其特征在于，所述培养液中脂肪酸HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid和DocosahexaenoateAcid的体积为5:5:4:6:10。

3.根据权利要求1所述的体外培养液，其特征在于，所述培养液中还含有ModifiedHumanTubalFluid、serumsubstitutesupplement。

4.根据权利要求1所述的体外培养液，其特征在于，所述培养液，每10.15ml中含有9mL的ModifiedHumanTubalFluid、1mL的serumsubstitutesupplement、25μlHexadecanoicAcid、25μlTrans-13-OctadecenoicAcid、20μl9,12-OctadecenoicAcid、30μlArachidonicAcid、50μlDocosahexaenoateAcid。

5.权利要求1-4任一所述体外培养液在提高离体之后的人精子的活力方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是将离体之后用精子分裂液分离出来的精子，用所述体外培养液重悬、轻轻混匀，置于37℃放置1～3小时。

7.一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有试剂HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid、DocosahexaenoateAcid。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中HexadecanoicAcid、Trans-13-OctadecenoicAcid、9,12-Octadecenoic、ArachidonicAcid、DocosahexaenoateAcid的体积比为5:5:4:6:10。

9.权利要求7-8任一所述试剂盒在提高离体之后的人精子的活力方面的应用方法。

10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述应用方法是取9mL的ModifiedHumanTubalFluid、1mL的serumsubstitutesupplement，然后添加试剂盒中的HexadecanoicAcid25μl、Trans-13-OctadecenoicAcid25μl、9,12-OctadecenoicAcid20μl、ArachidonicAcid30μl、DocosahexaenoateAcid50μl制成10.15ml的培养液，用该培养液重悬离体之后用精子分裂液分离出来的精子，轻轻混匀，置于37℃放置1～3小时。