CN109136172B - 提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒及小鼠受精方法。当前小鼠体外受精的囊胚率较低，不利于依托小鼠胚胎的辅助生殖技术研究的展开。本发明提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒，包括a毫升的mHTF、b毫克的BSA、c微克的ERO1L重组蛋白和d微克的DPEP2重组蛋白。a:b:c:d＝2:20:1:2。ERO1L重组蛋白为内质网氧化还原酶1类似蛋白，在DNA序列数据库中的基因ID为50527。DPEP2重组蛋白为二肽酶‑2，在DNA序列数据库中的基因ID为319446。本发明在试剂盒中加入ERO1L重组蛋白和DPEP2重组蛋白，使得本发明能够显著提升精子活力和囊胚率。

Description

提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于培养试剂盒技术领域，具体涉及一种提高小鼠精子活力及囊胚率的体外培养试剂盒及其使用方法。
背景技术
受精是精子与卵子相互结合而形成受精卵(合子)的过程，它标志着新生命的开端。在此过程中，精子和卵子携带者分别来自父本和母本的遗传物质，精子和卵子的质量决定着早期胚胎发育的成败。目前，对于受精这一神秘的生物学事件的认知大多来自体外受精的研究。然而，迄今为止，人类对受精的认识尚未穷尽，还需要倚重体外受精技术来进一步研究受精机制。
小鼠模型是目前体外受精研究的重要手段，因此，受精科学研究需要使用、消耗大量的小鼠胚胎。然而，根据研究表明，现有小鼠胚胎的培养过程中，约有10％～25％的卵细胞由于受精失败或是早期胚胎发育异常而被丢弃。传统的用于小鼠体外受精的培养液主要是HTF液。上述培养液可以为精子提供了一个缓冲和供能环境，基本满足体外受精技术的需求。但两个突出的问题在于：1，对精子运动能力的改善不够；2，受精后的合子发育成囊胚阶段的比率(囊胚率)有待提高。因此，开发一种提高小鼠精子活力和囊胚率的培养体系就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高小鼠精子活力及囊胚率的体外培养试剂盒及应用。
本发明提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒，包括a毫升的mHTF、b毫克的BSA、c微克的ERO1L重组蛋白和d微克的DPEP2重组蛋白。a:b:c:d＝2:20:1:2。
ERO1L重组蛋白为内质网氧化还原酶1类似蛋白，在美国国立生物技术信息中心建立的DNA序列数据库中的基因ID为50527。DPEP2重组蛋白为二肽酶-2，在美国国立生物技术信息中心建立的DNA序列数据库中的基因ID为319446。
进一步地，a＝10，b＝100，c＝5，d＝10。
该提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒的使用方法的具体步骤如下：
步骤一、将a毫升的mHTF、b毫克的BSA、c微克的ERO1L重组蛋白和d微克的DPEP2重组蛋白在37℃的环境下混合，并静置30分钟，得到小鼠精子培养液。a:b:c:d＝2:20:1:2。
步骤二、在小鼠精子培养液中吸取出精子获能滴、受精滴、洗滴。
步骤三、取小鼠精子加入精子获能滴中，并在37℃环境下培养90分钟。
步骤四、用三滴洗滴依次洗涤小鼠卵细胞后，然后将小鼠卵细胞置入受精滴中。
步骤五、吸取5～15ul经步骤三处理后含有精子的精子获能滴，并添加到受精滴中，使得添加精子获能滴后，受精滴内的精子浓度为1×106～5×106/ml。
步骤六、将经步骤五处理后含有精子获能滴的受精滴放入培养箱受精4～5小时。
进一步地，一滴精子获能滴的体积为150ul。一滴受精滴的体积为100ul。一滴洗滴的体积为50ul。
进一步地，所述的小鼠精子取自雄性8周龄、饲养环境为SPF级别的CD1小鼠体内。
进一步地，所述的小鼠卵细胞取自雌性8周龄、饲养环境为SPF级别的CD1小鼠体内。
进一步地，经步骤三操作后，精子获能滴中的精子密度为7.7×107～1.05×108/ml。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明在试剂盒中加入ERO1L重组蛋白和DPEP2重组蛋白，使得本发明能够显著提升精子活力和囊胚率。并且，由于ERO1L重组蛋白和DPEP2重组蛋白均为小鼠源重组蛋白，是从天然酵母表达系统中产生，对于小鼠精子本身没有任何毒害效应。
2、本发明所提供的mHTF、BSA、ERO1L重组蛋白、DPEP2重组蛋白配比对精子活力和囊胚率的提升效果明显高于其他配比。
3、本发明通过提高囊胚率能大大提升小鼠胚胎的制备速度，降低制备成本，从而对依托小鼠胚胎的受精机制、早期胚胎发育及辅助生殖技术研究起到辅助促进作用。
附图说明
图1为用本发明进行精子活力对比试验的结果柱状图；
图2为用本发明进行囊胚率对比试验的结果柱状图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒，包括盒体、10mL的mHTF(即ModifiedHuman Tubal Fluid，改良人输卵管液)、100mg的BSA(牛血清白蛋白，Bovine SerumAlbumin)、5ug的ERO1L重组蛋白和10ug的DPEP2重组蛋白。mHTF、BSA、ERO1L重组蛋白、DPEP2重组蛋白分别存放在盒体内的四个互不连通的容腔内。
ERO1L重组蛋白为内质网氧化还原酶1类似蛋白(即endoplasmic reticulumoxidoreductase 1like)，其在美国国立生物技术信息中心(即NCBI，National Center forBiotechnology Information)建立的DNA序列数据库中的基因ID为50527。
DPEP2重组蛋白为二肽酶-2(即dipeptidase 2)，其在美国国立生物技术信息中心建立的DNA序列数据库中的基因ID为319446。
ERO1L重组蛋白及DPEP2重组蛋白均为小鼠源基因通过酵母表达体系大量表达后的产物，其性状为提纯后的蛋白干粉。
该提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒的使用方法具体步骤如下：
步骤一、将提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒中10mL的mHTF、100mg的BSA、5ug的ERO1L重组蛋白和10ug的DPEP2重组蛋白在37℃的环境下混合，并静置30分钟，得到10mL小鼠精子培养液。
步骤二、在小鼠精子培养液中吸取出精子获能滴、受精滴、洗滴。精子获能滴、受精滴、洗滴的成分完全相同。一滴精子获能滴的体积为150ul。一滴受精滴的体积为100ul。一滴洗滴的体积为50ul。
步骤三、取小鼠精子加入精子获能滴中，并在37℃环境下获能培养90分钟，使得精子获能滴中的精子密度为7.7×107～1.05×108/ml。小鼠精子取自雄性8周龄、饲养环境为SPF级别的CD1小鼠体内。
步骤四、用三滴洗滴依次洗涤小鼠卵细胞后，然后将小鼠卵细胞置入受精滴中。小鼠卵细胞取自雌性8周龄、饲养环境为SPF级别的CD1小鼠体内。雌鼠的促排方案如下：给每只雌鼠的腹腔注射5IU(国际单位)的PMSG(促性腺激素)。PMSG注射46-48小时后，给每只雌鼠的腹腔注射5IU的HCG(绒毛膜促性腺激素)，HCG注射13小时后取材。
步骤五、吸取5～15ul经步骤三处理后的含有精子的精子获能滴，并添加到受精滴中，使得添加精子获能滴后，受精滴内的精子浓度为1×106～5×106/ml。
步骤六、将经步骤五处理后含有精子获能滴的受精滴放入培养箱受精4～5小时，得到小鼠受精卵。
针对小鼠精子活力的提升进行精子活力对比试验如下：
1、取本发明步骤一中制备的小鼠精子培养液作为实验组培养液，取含有质量分数为1％BSA的mHTF作为对照组培养液。
2、在实验组培养液中吸取实验组精子获能滴，在对照组培养液中吸取对照组精子获能滴。
3、用安乐死法处死雄鼠，开腹取出附睾，在附睾尾部用5号剪刀做横切口，待精子溢出后，取等量的两份小鼠精子分别加入实验组精子获能滴、对照组精子获能滴中。之后将实验组精子获能滴、对照组精子获能滴分别在37℃培养箱中获能培养90分钟；
4、在实验组精子获能滴、对照组精子获能滴中各吸取10ul样本。利用精子分析仪对吸取得到的两份样品分别测试精子活力。
精子活力对比试验的结果如图1所示，实验组精子获能滴中小鼠精子的活力率为92.2％，在对照组精子获能滴中小鼠精子的活力率为78.5％。可见，本发明相比于常规精子培养液，能够提高小鼠精子的活力。
针对小鼠卵细胞囊胚率的提升进行囊胚率对比试验如下：
1、取本发明步骤一中制备的小鼠精子培养液作为实验组培养液，取含有质量分数为1％BSA的mHTF作为对照组培养液。
2、在实验组培养液中吸取n滴实验组精子获能滴、n滴实验组受精滴、多滴实验组洗滴，在对照组培养液中吸取n滴对照组精子获能滴、n滴对照组受精滴、多滴对照组洗滴。
3、用安乐死法处死雄鼠，开腹取出附睾，在附睾尾部用5号剪刀做横切口，待精子溢出后，取等量的2n份小鼠精子分别加入n滴实验组精子获能滴、n滴对照组精子获能滴中。之后将实验组精子获能滴、对照组精子获能滴分别在37℃培养箱中获能培养90分钟；
4、安乐死法处死多只雌鼠，开腹，离断子宫系膜后可以看到卵巢末端与输卵管前端分开，取出输卵管，将输卵管放入生理盐水中清洗。用1ml注射器针头配合切开输卵管壶腹部，释放卵细胞。取出2n个卵细胞。
其中n个卵细胞均用三滴实验组洗滴依次洗涤。另n个卵细胞均用三滴对照组洗滴依次洗涤。将被实验组洗滴的n个卵细胞分别置入n滴实验组受精滴中。将被对照组洗滴的n个卵细胞置入n滴对照组受精滴中。
5、吸取n份5～15ul的实验组精子获能滴，分别添加到n滴实验组受精滴中。吸取n份5～15ul的对照组精子获能滴，分别添加到n滴对照组受精滴中。
6、将所有实验组受精滴和对照组受精滴放入培养箱受精4～5小时。将n滴实验组受精滴中的受精卵取出，洗去多余精子，并分别置入n滴实验组洗滴中；将n滴对照组受精滴中的受精卵取出，洗去多余精子，并分别置入n滴对照组洗滴中。
7、观察n滴实验组洗滴中的受精卵和n滴对照组洗滴中的受精卵的原核形成情况，以形成原核和排出第二极体为受精标志。计算实验组的n个受精卵的受精率和对照组的n个受精卵的受精率。后将实验组的n个受精卵的受精率和对照组的n个受精卵移至胚胎培养液中继续体外培养，依次于受精后24小时、48小时、72小时和96小时观察2-细胞率，4-细胞率，桑葚胚率和囊胚率。
囊胚率对比试验的结果如图2所示，实验组与对照组的受精率、2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率均无显著差异，但实验组的囊胚率为94.5％，对照组的囊胚率为85.4％，可见，本发明能够显著提升小鼠受精的囊胚率。

Claims (7)

1.提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒，包括a毫升的mHTF和b毫克的BSA，其特征在于：还包括c微克的ERO1L重组蛋白和d微克的DPEP2重组蛋白；a:b:c:d＝2:20:1:2；ERO1L重组蛋白为内质网氧化还原酶1类似蛋白，在美国国立生物技术信息中心建立的DNA序列数据库中的基因ID为50527；DPEP2重组蛋白为二肽酶-2，在美国国立生物技术信息中心建立的DNA序列数据库中的基因ID为319446。
2.根据权利要求1所述的提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒，其特征在于：a＝10，b＝100，c＝5，d＝10。
3.如权利要求1所述的提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤一、将a毫升的mHTF、b毫克的BSA、c微克的ERO1L重组蛋白和d微克的DPEP2重组蛋白在37℃的环境下混合，并静置30分钟，得到小鼠精子培养液；a:b:c:d＝2:20:1:2；
步骤二、在小鼠精子培养液中吸取出精子获能滴、受精滴、洗滴；
步骤三、取小鼠精子加入精子获能滴中，并在37℃环境下培养90分钟；
步骤四、用三滴洗滴依次洗涤小鼠卵细胞后，然后将小鼠卵细胞置入受精滴中；
步骤五、吸取经步骤三处理后含有精子的精子获能滴，并添加到受精滴中，使得添加精子获能滴后，受精滴内的精子浓度为1×106～5×106/mL；
步骤六、将经步骤五处理后含有精子获能滴的受精滴放入培养箱受精4～5小时。
4.根据权利要求3所述的提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒的使用方法，其特征在于：一滴精子获能滴的体积为150μL；一滴受精滴的体积为100μL；一滴洗滴的体积为50μL。
5.根据权利要求3所述的提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的小鼠精子取自雄性8周龄、饲养环境为SPF级别的CD1小鼠体内。
6.根据权利要求3所述的提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的小鼠卵细胞取自雌性8周龄、饲养环境为SPF级别的CD1小鼠体内。
7.根据权利要求3所述的提高囊胚率的小鼠精子体外培养试剂盒的使用方法，其特征在于：经步骤三操作后，精子获能滴中的精子密度为7.7×107～1.05×108/mL。
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