CN104046590B - 一种稀少精子体外培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稀少精子体外培养基，含有以下组分：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸钾、乳酸钙、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、谷氨酰胺、牛磺酸、己酮可可碱、L‑天冬酰酸、L‑天冬氨酸、甘氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、依地酸、庆大霉素、酚红。本发明优点在于：本发明的稀少精子体外培养基与以往传统洗精液不同，特别适用于临床严重少、弱精子症、睾丸及附睾获取的精子样本体外处理和培养，以提高少、弱精子和睾丸精子的运动能力，使单精子卵胞浆内显微注射操作时寻找有运动能力的精子变得容易而安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种稀少精子体外培养基，具体地说，是一种用于特殊精子的体外处理、培养，以提高精子运动能力的体外培养基。
背景技术
目前全世界约有20％育龄夫妇患有不孕症，不孕症中男性原因占50％左右，而在男性不育症中约60％以上，原因为少、弱精子症，甚至为无精子症。自1992年卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术问世以来，使精液中无精子的患者可利用睾丸、附睾中获取的精子去生育一个自己的孩子。但是睾丸精子不具有运动能力或仅有微弱的震颤运动力，显微镜下直接观察睾丸穿刺物中的精子时无法确定其死活。尽管通过体外培养可以使部分睾丸精子产生活动力，但活动力较弱，很少出现前向运动精子，仍有多数精子并未出现活动力。
随着辅助生殖技术在男性不育治疗中的应用，促进了通过体外培养来提高精子运动和受精能力的研究。目前有许多人尝试着将许多物质：像血清、腹腔液、卵泡液和其他的化学修饰药物如孕酮、腺苷类似物和甲基黄嘌呤等用来提高人精子的运动和受精能力。但是市面上尚没有一种专门针对少、弱精子，睾丸精子的体外培养的专门培养液。
中国专利文献CN103805559A公开了一种用于精液样品洗涤或精子培养保存的精子洗涤培养液，其特征是含有一定浓度的神经营养因子(NGF)，能够明显提高精液样品中的精子活力和存活率。中国专利文献CN103352025A公开了改善人精子运动能力的体外培养液及其应用，该培养液含有果糖6-磷酸(F6P)，该发明改善人精子运动能力的体外培养液，对离体后纯化的人精子进行培养，除了维持精子运动还能显著提高了正常人精子的活力，为改进辅助生育技术提供了有意义的参考。但是关于一种用于特殊精子的体外处理、培养，以提高精子运动能力的体外培养基目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对市面上辅助生殖技术使用的各种培养液中没有一种专门针对少、弱精子，睾丸精子的体外培养的专用培养液而研发，提供一种稀少精子体外培养基。
本发明的再一目的是，提供一种稀少精子体外培养基的应用。
本发明的另一目的是，提供一种体外处理稀少精子的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种稀少精子体外培养基，每升所述的培养基中含有以下组分：氯化钠98.0 mmol、氯化钾4.5 mmol、硫酸镁0.20 mmol、磷酸钾0.35 mmol、乳酸钙21.4 mmol、碳酸氢钠20.0 mmol、葡萄糖2.90 mmol、丙酮酸钠0.33mmol、谷氨酰胺1.0 mmol、牛磺酸0.1 mmol、己酮可可碱2.0 mmol、L-天冬酰酸0.1 mmol、L-天冬氨酸0.1 mmol、甘氨酸1.0 mmol、L-脯氨酸0.1 mmol、L-丝氨酸0.1 mmol、依地酸100umol、庆大霉素1.0 mmol、0.5%酚红1 ml。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的培养基在稀少精子体外处理和培养中的应用。
所述的稀少精子为临床严重少、弱精子症、睾丸及附睾获取的精子。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种体外处理稀少精子的方法，包括以下步骤：将获取的精子置Modified-HTF 1.5ml液中处理，离心后去上清后，添加权利要求1所述的稀少精子体外培养基1ml，再置5% CO2箱中培养30分钟至3小时。
本发明优点在于：
1、本发明通过综合各种化学物质组合的培养基，将它用于培养精液中无活动能力的少、弱活精子，能明显刺激那些原本精液中微弱摆动，不前向运动的精子产生活动，并且对精子生存能力无明显的影响；
2、本发明的稀少精子体外培养基与以往传统洗精液不同，特别适用于临床严重少、弱精子症、睾丸及附睾获取的精子样本体外处理和培养，以提高少、弱精子和睾丸精子的运动能力，使单精子卵胞浆内显微注射（ICSI）操作时寻找有运动能力的精子变得容易而安全。
附图说明
图1. 稀少精子处理流程。
图2. 稀少精子体外培养基使用前后运动精子数比较。
图3. 稀少精子体外培养基使用前后前向运动精子数比较。
图4. （Fitc-psa 荧光染色） 稀少精子顶体完整率的检测。
图5. （Fitc-psa 荧光染色）正常精子顶体完整率的检测。
图6. （Fitc-psa 荧光染色）精卵结合后，顶体发生反应的精子。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明的稀少精子体外培养基成分：
氯化钠98.0 mmol/L、氯化钾4.5 mmol/L、硫酸镁0.20 mmol/L、磷酸钾0.35 mmol/L、乳酸钙21.4 mmol/L、碳酸氢钠20.0 mmol/L、葡萄糖2.90 mmol/L、丙酮酸钠0.33 mmol/L、谷氨酰胺1.0 mmol/L、牛磺酸0.1 mmol/L、己酮可可碱2.0 mmol/L、L-天冬酰酸0.1mmol/L、L-天冬氨酸0.1 mmol/L、甘氨酸1.0 mmol/L、L-脯氨酸0.1 mmol/L、L-丝氨酸0.1mmol/L、依地酸 100umol/L、庆大霉素1.0 mmol/L、0.5%酚红 1 ml/L。
稀少精子体外培养基使用步骤：见图1，将睾丸精子获取后或是体外获取的精液中，精子浓度少于2×106/ml，活动率小于10%的样本，将其置Modified-HTF（IrvineScientific company）1.5ml液中处理，离心后去上清后，添加稀少精子体外培养基1ml，再置5% CO2箱中培养30分钟至3小时不等。
实施例2
1、研究材料和方法
研究对象：
（1）精液标本来源于医院男科不育门诊就诊的11例少弱精症患者的精子，.禁欲48h～7d，手淫方式取精于干燥无菌的取精杯内，60min内完全液化。按WHO5推荐方法进行精液常规分析。
（2）54例无精子症患者显微外科手术行睾丸活检术获取的精子进行分析。
2、研究方法主要试剂
1）含5％HSA的HTF培养液(美国Ivrine公司，90125)；
2）稀少精子体外培养基（采用实施例1所述的配比配置）。
3、显微外科手术获取的睾丸精子，置含5％HSA的HTF培养液中，睾丸组织用剪刀或用弯成7字形的注射器针头体视镜下处理完加入稀少精子体外培养液1ml 放入37℃、5％c培养。处理后显微镜下计数精子浓度。
4、体外获取的少、弱精子待液化后显微镜下计数其浓度：将密度少于2×106/ml，活动率小于10%的样本，将其置Modified-HTF（Irvine Scientific company）1.5ml液中处理，离心后去上清后，添加稀少精子体外培养基1ml，再置5% CO2箱中培养30分钟至3小时后。
5、分别取部分组织观察精子的活动力，测定精子存活率。取有存活精子的病例进行冷冻保存。精子的活动力及存活率按WHO标准判断。
6、统计学分析所有数据以X±S表示，采用t检验。
7、结果
从表1得知，65例严重少、弱精子样本使用本发明研制的“稀少精子体外培养液”培养2小时后观察，原来不动的精子均有不同程度的活力改变；其中15例“输精管缺如”患者通过显微取精后的样本，体外培养2小时后有86.7%的精子出现了前向运动。39例梗阻性无精症患者睾丸显微手术取精后的样本，体外培养2小时后可观察到有74.3% 的精子出现前向运动能力。另外11例外周获取的少、弱精子样本，体外培养2小时后观察，出现前向运动精子的比例占72.7%。
（表1）65例严重少、弱精子体外培养后运动精子统计
传统的睾丸精子获取后，通常在Modified-HTF（Irvine Scientific company）中处理，再置5% CO2箱中培养3小时甚至2天不等，但是能出现运动的精子数量极少见，不能满足临床治疗时选择可使用的活动精子数量。
添加稀少精子体外培养基1ml，置5% CO2箱中培养30分钟至3小时后，睾丸获取后的精子样本以及外周精液中的弱精子运动能力明显提高10-20%。
当显微镜下观察不到活动精子的样本，使用稀少精子体外培养基5～10分钟即可观察到活动的精子，见图2；30分钟后，前向运动的精子大于10%，见图3。可以显著提高睾丸精子活力（与其他品牌产品相比差异显著，p<0.05）。
实施例3 稀少精子体外培养液安全性实验
1、取正常人的精子，要求其禁欲48h～7d，手淫方式取精子于干燥无菌的取精杯内，60min内完全液化。按WHO5推荐方法进行精液常规分析。
2、将液化的精液采用45%，90%梯度离心分离后，取沉淀的精子用Modified-HTF混匀，将精子密度调到20×106/ml，活力（PR%）90%，分装在3支5ml试管，每支含0.5ml，分别在24小时，48小时，72小时各取一管进行计数精子的存活率和精子的顶体完整率。
结果] 正常精子在稀少精子体外培养液中培养24小时，48小时，72小时后，精子存活率不小于85%，精子顶体完整率达80%以上，通过精卵结合实验表明，50%以上的精子都可以发生顶体反应（见图4、 图5、图6）。
实验表明稀少精子体外培养液不仅能提高严重少、弱精子的运动能力，而且对精子的长期体外培养也是安全，可靠的。
结论
综上所述，既往无精子症的患者，睾丸手术获取的精子基本是不运动或极少运动的，因此在临床ART治疗使用单精子显微操作时实验室技术人员很难挑选一条形态学正常、有运动能力的精子进行注射。本发明研制的“稀少精子体外培养基”与以往传统洗精液不同，特别适用于临床严重少、弱精子症、睾丸及附睾获取的精子样本体外处理和培养，以提高少、弱精子和睾丸精子的运动能力，使单精子卵胞浆内显微注射（ICSI）操作时寻找有运动能力的精子变得容易而安全。
稀少精子体外培养基中除了添加了平衡液体酸碱度必要的有机物和电解质外，关键还添加了丙酮酸钠、乳酸钠和葡萄糖，这些物质是精子运动和获能所必需的供能物质；其中添加的牛磺酸是精子活力因子，对于维持雌雄动物配子的正常功能以及繁殖的顺利进行都起到重要的作用；另外，还添加了促进精子运动的营养因子-己酮可可碱。己酮可可碱作为磷酸二酯酶非特异性抑制剂，通过抑制PDE的活性，减少胞内cAMP的降解，提高精子胞浆内cAMP浓度，激活cAMP依赖性蛋白激酶，导致精子尾部蛋白磷酸化 ，促进精子的运动。
本发明通过综合各种化学物质组合的培养基，将它用于培养精液中无活动能力的少、弱活精子，能明显刺激那些原本精液中微弱摆动，不前向运动的精子产生活动；并且对精子生存能力无明显的影响。将它用于培养睾丸获取精子的体外培养，能显著增强睾丸精子的活动能力，在观察睾丸精子的活动潜力及鉴别其存活情况等方面具有应用价值。并为显微操作时实验室技术人员选择活动精子提供了方便。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种稀少精子体外培养基，其特征在于，所述的稀少精子是从无精子症患者睾丸及附睾获取的精子，每升所述的培养基中由以下组分组成：氯化钠98.0 mmol、氯化钾4.5mmol、硫酸镁0.20 mmol、磷酸钾0.35 mmol、乳酸钙21.4 mmol、碳酸氢钠20.0 mmol、葡萄糖2.90 mmol、丙酮酸钠0.33 mmol、谷氨酰胺1.0 mmol、牛磺酸0.1 mmol、己酮可可碱2.0mmol、L-天冬酰酸0.1 mmol、L-天冬氨酸0.1 mmol、甘氨酸1.0 mmol、L-脯氨酸0.1 mmol、L-丝氨酸0.1 mmol、依地酸 100 μmol、庆大霉素1.0 mmol、0.5%酚红1 ml，其余为水。
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