CN110402919B - 环腺苷酸用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环腺苷酸用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法，本发明同时还提供了一种山羊精液冷冻保存用稀释液，包括环腺苷酸、营养物质、缓冲物质等。本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，具有提高精液冷冻保存后精子活率、顶体和质膜完整率，使得山羊的繁殖性能和经济效益有显著提高的效果。
Description
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，涉及动物繁殖技术，尤其涉及环腺苷酸用于制备山羊精液保存用稀释液的应用及制备方法。
背景技术
动物精液冷冻保存是将精液进行特殊处理，保存在超低温下，以达到长期保存的目的。但是精子在降温和冷冻保存的过程中，很容易产生各种损伤，包括物理性的、化学性的和生物性的损伤。与新鲜精液相比较，经冷冻-解冻处理的精液，其精子的成活率、精子活力、顶体完整率、线粒体活性和受胎率显著下降，而山羊的精液更是如此，这对于生产实践和科学研究来说是极其不利的因素。尽管山羊精液的冷冻保存技术已经有了长足的发展，但目前仍然存在很多问题有待解决。
环腺苷酸，全称腺苷-3',5'-环一磷酸，是一种参与细胞信号跨膜转导的重要第二信使，具有广泛的生理功能。配基与细胞膜上的受体结合后，激活G蛋白，进而激活腺苷酸环化酶，催化ATP生成环腺苷酸，发挥广泛的生理调控功能。目前并无将其用于动物精液冷冻保存技术的相关报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷或者不足，本发明提供了一种环腺苷酸用于制备山羊精子保存用稀释液的应用及制备方法。
本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所提供的山羊精子冷冻保存用稀释液用于保存山羊精子，包括环腺苷酸。
具体的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括环腺苷酸、营养物质以及缓冲物质。
更具体的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括环腺苷酸、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。
所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括环腺苷酸、果糖、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
此外，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
本发明所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠0.25-1.25g，柠檬酸0.75-6g，碳酸氢钠0.062-0.5g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖0.5-4g，卵磷脂0.125-1g，二甲基亚砜6-30mL，乙二醇6-30mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.07-0.56g，链霉素0.06-0.48g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取环腺苷酸0.0012-0.0045g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，离心取上清液即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
作为一种最优方案，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取环腺苷酸0.0029g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，离心取上清液即得到山羊精子冷冻保存用稀释液
本发明的有益效果是：
本发明的稀释液，能提高精液冷冻保存后精子活率、顶体和质膜完整率，间接提高了山羊的繁殖性能和经济效益。
本发明在稀释液中加入了环腺苷酸，在精液降温、冷冻保存和解冻过程中对精子起到保护作用，减少损伤，精液经冷冻-解冻处理后，精液的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到44.58±1.59％，52.73±2.19％和47.90±2.08％。
具体实施方式
环腺苷酸，全称腺苷-3',5'-环一磷酸，是一种参与细胞信号转导的重要第二信使,具有广泛的生理功能。配基与细胞膜上的受体结合后，激活G蛋白，进而激活腺苷酸环化酶，催化ATP生成环腺苷酸，发挥广泛的生理调控功能。目前环腺苷酸已经开发出的功能有：环腺苷酸对免疫功能、激素合成和分泌的影响；对膜蛋白活性的调节；环腺苷酸对神经细胞的作用，以及环腺苷酸对基因表达的调节作用。目前并无相关报道将其用于动物精液冷冻保存技术中。本发明的发明人针对精液经冷冻-解冻处理后，其精子的成活率、精子活力、顶体完整率、线粒体活性和受胎率显著下降的问题，开发出一种新的山羊精子保存用稀释液，在其中添加适量的环腺苷酸。结果表明添加适量的环腺苷酸能提高经冷冻保存-解冻后精液的精子活率、顶体和质膜的完整率。后期经过一系列的研究，证明山羊精液在冷冻过程中，环腺苷酸确实对精子起到保护作用，但是具体的内部机理目前还不明确，发明人还在进一步探索。
另外，为保证效果，本发明用于山羊精子冷冻保存的稀释液，应现用现配。本发明的山羊精子保存用稀释液，包括柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠(三者共同起到维持渗透压以及酸碱调节作用)、果糖(作为能源，主要作用是补充精子能量，也是一种简单的稀释剂)、卵磷脂(具有类似卵黄中具有抗低温打击保护作用的主要功能性成份)、二甲基亚砜、乙二醇(均作为冷冻保护剂)，青霉素、链霉素(均作为抑菌物质)和环腺苷酸。
为了说明上述山羊精子冷冻保存用稀释液对山羊精子的保存效果，发明人对精子的活率、顶体完整率和质膜完整率进行了观测。随机抽取10支细管冻精，37℃水浴20s解冻。取10μL精液，置于全自动精子质量分析仪的样品池中，观测精子的活率、顶体和质膜的完整率。同时，为了确定环腺苷酸以及与环腺苷酸配比的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释液中的最适浓度，实施例共设置5组，每组中环腺苷酸或与环腺苷酸配比的其他成分，在山羊精子冷冻保存用稀释液中的浓度均不同。同时，为进一步说明环腺苷酸的在山羊精子冷冻保存用稀释液所起到的有益效果，特与各对比例的效果加以对比。
实施例1：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括环腺苷酸、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取环腺苷酸0.0045g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到所谓D液，即添加环腺苷酸的山羊精子冷冻保存用稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取其5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液，再将其用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例1：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例所用的山羊精子冷冻保存稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取其5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液，再将其用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
实施例2：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括环腺苷酸、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平准确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取环腺苷酸0.0012g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到所谓D液，即添加环腺苷酸的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
其余操作步骤同实施例1。
对比例2：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平准确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。
其余操作步骤同对比例1。
实施例3：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括环腺苷酸、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平准确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取环腺苷酸0.0012g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到所谓D液，即添加环腺苷酸的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
其余操作步骤同实施例1。
对比例3：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平准确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
其余操作步骤同对比例1。
实施例4：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括环腺苷酸、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确称取环腺苷酸0.0045g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，即添加环腺苷酸的山羊精子冷冻保存用稀释液。
其余操作步骤同实施例1。
对比例4：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
其余操作步骤同对比例1。
实施例5：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括环腺苷酸、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g，准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取环腺苷酸0.0029g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到所谓D液，即添加环腺苷酸的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
其余操作步骤同实施例1。
对比例5：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g，准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
其余操作步骤同对比例1。
各实施例以及对比例的效果对比：
随机抽取10支细管冻精，37℃水浴20s解冻。取10μL精液，置于全自动精子质量分析仪的样品池中，观测精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，并与对比例进行比较。
实施例1及对比例1效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是42.46±1.51％，50.22±2.09％和45.62±1.98％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了32.98±1.27％，顶体完整率提高了10.69±1.12％，质膜完整率提高了17.03±1.23％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例2及对比例2效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是38.21±1.36％，45.20±1.88％和41.06±1.78％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了34.64±1.14％，顶体完整率提高了12.07±1.01％，质膜完整率提高了18.50±1.11％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例3及对比例3效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是34.39±1.22％，40.68±1.69％和36.95±1.60％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了32.19±1.02％，顶体完整率提高了10.04±0.91％，质膜完整率提高了16.34±1.00％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例4及对比例4效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是38.42±1.37％，45.44±1.89％和41.29±1.80％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了32.63±1.15％，顶体完整率提高了10.40±1.02％，质膜完整率提高了16.72±1.12％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例5及对比例5效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是44.58±1.59％，52.73±2.19％和47.90±2.08％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了34.55±1.33％，顶体完整率提高了11.19±1.18％，质膜完整率提高了17.85±1.30％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
如各实施例和不添加环腺苷酸的各对比例所示，实施例组与对比例组相比精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，由此表明，本发明添加环腺苷酸的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
如实施例1和实施例4所示，具有同样含量环腺苷酸的山羊精子冷冻保存用稀释液，均能显著提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，但是实施例5的效果优于实施例1，说明环腺苷酸的添加量并不是越多越好，其与山羊精子冷冻保存用稀释液中的其余成分有一个最佳的配比，只有添加环腺苷酸以及各组分适配两个条件同时达到，才能显示最佳效果。
通过以上结果可以得出，本发明稀释粉配方中添加0.0012-0.0045的环腺苷酸能显著延长精子有效保存时间，提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，其中添加0.0029g的环腺苷酸效果更好，精液经冷冻-解冻处理后，精液的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到44.58±1.59％，52.73±2.19％和47.90±2.08％，与对比例不添加环腺苷酸的山羊精液冷冻保存用稀释液相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
进一步，为了说明本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，特进行实施例6试验：
实施例6：
本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，试验已经对不同年龄段的陕西关中奶山羊、不同年龄段的黑山羊以及黄羊的精液冷冻保存效果均进行了验证，试验方法同上(不做详述)，结果表明：本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，能有效提高解冻后精液的精子活率、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶山羊冻精生产效率冻精品质。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (3)
1.一种山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括环腺苷酸、果糖、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
2.权利要求1所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将柠檬酸钠0.25-1.25 g，柠檬酸0.75-6 g，碳酸氢钠0.062-0.5 g，加50 mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到A液；
（2）将果糖0.5-4 g，卵磷脂0.125-1 g，二甲基亚砜6-30 mL，乙二醇6-30 mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到B液；
（3）将青霉素0.07-0.56 g，链霉素0.06-0.48 g，加B液50 mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到C液；
（4）取环腺苷酸0.0012-0.0045 g，加入C液50 mL，溶解后定容至100 mL，离心取上清液即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
3.权利要求1所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将柠檬酸钠1.25 g，柠檬酸3.35 g，碳酸氢钠0.28 g，加50 mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到A液；
（2）将果糖2.25 g，卵磷脂0.53 g，二甲基亚砜18 mL，乙二醇18 mL，加A液50 mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到B液；
（3）将青霉素0.25 g，链霉素0.25 g，加B液50 mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到C液；
（4）取环腺苷酸0.0029 g，加入C液50 mL溶解后定容至100 mL，离心取上清液即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
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| Title |
|---|
| Motility, acrosome integrity and fertility of frozen ram spermatozoa treated with caffeine, pentoxifylline, cAMP, 2-deoxyadenosine and kallikrein;W.M.C.Maxwell 等;《Reprod. Fertil. Deu》;19950731;第7卷(第5期);第1082页左栏材料与方法 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110402919A (zh) | 2019-11-05 |
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