CN107980765A - 一种提高驴精液低温保存品质的精液稀释液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种提高驴精液低温保存品质的精液稀释液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及畜牧领域，具体公开了一种提高驴精液低温保存品质的精液稀释液及其制备方法与应用。本发明提供的精液稀释液能够显著提高精液低温保存活性，延长精子体外保存时间。本发明提供的应用操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响。可以在驴属动物精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。

Description

一种提高驴精液低温保存品质的精液稀释液及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及畜牧领域，具体地说，涉及一种提高精液低温保存品质的精液稀释液及其制备方法与应用。
背景技术
精液冷冻保存与人工授精技术相结合，在现代畜牧业生产中发挥着巨大的作用，能大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优秀种公畜的利用率，为畜牧业带来巨大的经济效益。现阶段，驴繁殖主要采用本交方式，个别技术好的畜牧人员有时也将采出的精液(鲜精)不稀释或低倍稀释立即给发情母驴输精，它适用于母驴季节性发情较明显，而且数量较多的地区。精液低温冷冻保存技术能充分利用优良种畜的遗传资源，迅速扩大畜群的良种比例。
与本交相比，效率可提高5～20倍。但由于我国驴品种较多，养殖区分布较广，多在山区或交通不便区域，且饲养方式多以散户居多，母驴分布不集中，鲜精或低倍稀释的精液人工授精技术推广面积较少。此外，由于驴鲜精体外保存时间极短，几小时后活力近乎丧失，这使得驴的鲜精人工授精技术受到时间、地点的极大限制。因此，畜牧生产中迫切需要保存时间更长、携带更为方便的优质公驴精液来改良全社会的驴生产群体。
精液保存分为常温(15℃～25℃)保存、低温保存(0℃～5℃)和冷冻(-79℃～-196℃)保存三种方法。常温保存技术研究开展的最早，相对比较成熟，但在常温下，一方面微生物生长迅速会影响精液质量，另一方面常温保存时精子活力下降较快。低温保存技术相对冷冻保存而言操作简单方便，成本低，但低温保存技术需要既能提供营养又能保护精子的非渗透性低温保护剂及稀释液冷冻保存是指将精液经过特殊处理后置于液氮或干冰中，可保存该物种种质资源数年甚至数十年，切实发挥良种公畜的遗传资源。但由于不同公畜精子的生物学特性不同，其冷冻保存效果也存在很大的差别。如牛精液的冷冻保存技术比较成熟，尤其牛精液细管法程序生产已经普及；但羊精子冻后普遍存在情期受胎率不稳定、受胎率低、重复率低等诸多问题；而猪的精子因含脂量较高，脱水比较困难，冷冻-解冻后精子存在超微结构受到损伤(如精子膜、顶体和精子核泡化、损伤或破裂)、在雌性生殖道内寿命缩短和受精率低等问题，因而猪精液冷冻保存还一直处于试验阶段。目前国内外关于驴精液冷冻保存的研究很少，主要原因是:一方面是驴的繁殖率低，妊娠期长；第二，由于不同的驴个体间其精液品质有明显的差异，且驴精子本身对低温打击特别敏感，在冷冻解冻过程中极易损伤，因而冷藏和冷冻后的精液极大地降低了受胎率；第三，由于驴发情时间长，人工授精的时机掌握不准确造成其妊娠率低；最后，公驴每次平均射精量多达70ml，密度较稀，且精清中的电解质成分会促进精子早衰。因而，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大，严重制约着冷冻精液的应用。
近几年，子宫角深部输精和内窥镜输精等低剂量输精技术在生产中应用，进一步对精液的保存效果提出了更高的要求。因此，提高冻精活力，延长精子体外存活时间是畜牧生产和科学研究所必需的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高精液低温保存品质的精液稀释液及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖3.5～6.00g、乳糖0.300～2.5g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060～0.095g、柠檬酸钾0.082～0.41g、HEPES试剂0.952～1.325g、青霉素10～40万IU、链霉素10～40万IU、蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1％～2.5％。
进一步地，所述提高精液低温保存品质的精液稀释液中A溶液由以下成分组成：葡萄糖3.5～6.00g、乳糖0.300～2.5g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.080～0.098g、HEPES试剂0.952g、青霉素10～40万IU、链霉素10～40万IU、蒸馏水100mL。
进一步地，所述A溶液中的青霉素、链霉素也可选用功效类似的抗生素，根据需要用量可适当调整。
本发明所述脱脂奶可由牛奶脱脂制得，也可由脱脂奶粉加水配制而得。
进一步地，所述脱脂奶中蛋白质含量为4.0～6.0g/100g，脂肪含量≤0.5g/100g。
在本发明一个较佳的实施例中，所述提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖6.00g、乳糖0.300g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.080g、HEPES试剂0.952g、青霉素40万IU、链霉素40万IU、蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1％。
在本发明另一个较佳的实施例中，所述提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖3.5g、乳糖2.5g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.080g、HEPES试剂0.952g、青霉素40万IU、链霉素40万IU，蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1.0％。
在上述配方下等比例扩大或缩小均属于本发明的保护范围。
本发明各原料均可市售购得，部分原料也可自行制备。
所述HEPES等化学试剂购自SIGMA公司。
所述新鲜卵黄可来自鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋等；优选为鸡蛋。
本发明所述提高精液低温保存品质的精液稀释液在使用前，A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄一般单独存放；A溶液配制好后可置于4℃冰箱保存备用；新鲜卵黄现用现制；在使用时，将A溶液和脱脂奶等体积混匀后，水浴缓慢加热至37±2℃，再按配比加入新鲜卵黄，混匀，保持37±2℃即可使用。
具体地，本发明所述新鲜卵黄采用如下方法制备：
鸡蛋应选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、干净，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒，待酒精挥发尽后用蛋清分离器取出完整的卵黄；也可在鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄；然后用灭菌的注射器穿过卵黄膜抽取卵黄。
所述蒸馏水也可采用超纯水代替。
本发明还提供上述提高精液低温保存品质的精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：
1)按配比取A溶液的各成分，将除青霉素、链霉素之外的各成分混匀，灭菌(一般可于121℃高压灭菌10-20min)，放凉后按配比加入青霉素、链霉素，制得A溶液；可于4℃保存备用；
2)取脱脂奶或用脱脂奶粉配制脱脂奶，灭菌(一般可于115℃高压灭菌10-15min)，放凉后，至于4℃保存备用；
3)制备新鲜卵黄。
本发明还包括利用上述提高精液低温保存品质的精液稀释液保存精液的方法。
具体地，所述保存精液的方法包括：
1)精液采集；一般要求精液精子活力90％以上；
2)将经检测合格的精液低速(一般600g左右)常温离心(一般10min左右)，弃上清；加入上述精液稀释液，使精液密度为25～100×106个/mL；然后置于含少量空气的容器中，封口，包裹严密，标记公驴号及日期时间，放置于4℃平衡柜或冰箱保存。
一般地，离心弃上清后的1单位体积精液可使用1～4倍体积的精液稀释液(37℃左右)。
具体地，精液采集方法如下：健康7±3岁公驴，单圈饲养，人工采集驴精液，采精器内加入温水(42～45℃)。公驴阴茎勃起后，使用苏打水进行清洗，然后使用清水冲洗干净并擦干。临采精前在一次性里衬内(深度为1/3处)均匀地涂抹润滑剂，根据种公驴阴茎的长短，粗细调节采精筒的压力。采精器准备妥当后，右手持采精筒，采精员站在驴右后侧，调教师牵引种公驴令其爬跨假台驴，并将阴茎导入采精筒内，待公驴射精后，将采精器集精杯端向下倾斜，同时打开放气阀放气，拿回处理室，然后缓慢取下采精器。
精液检测方法：精液采集后，使用4-6层脱脂消毒纱布去除胶状物，置于无菌量筒(规格为100ml)内量取精液体积；精液密度用精子密度分析仪检测(SDM6,Ref:12300/0008,Minitube,Germany)，检测时用200μL移液枪吸取130μL精液进行检测；同时，精子全自动分析系统(CASA，Sperm Therio，mintube，Germany)检测精液的活率(％)，用100μL的移液枪吸取70μL的精液到载玻片上，轻轻盖上盖玻片，防止气泡产生，置于镜下检测，每次检测至少选取3个视野，取其均值。要求精子活力90％以上。最后，精液经过低速(600g)常温离心10min后弃上清，进行下一步操作。
精液低温保存方法：根据精液密度及输精要求，利用37℃上述的精液稀释液稀释精液，精液的稀释倍数根据其密度及输精要求来确定。正常范围内，驴精子密度为150～400×106个/mL，目前人工授精时要求的总精子数为250～1000×106个(优选1000×106个，输精剂量为15ml)。1单位体积精液离心弃上清后可使用1～4倍体积的37℃精液稀释液，保持离心管中少量空气，封口，标记公驴号及日期时间，之后用5cm厚的脱脂棉包裹严密，放置于4℃平衡柜或冰箱保存。
作为优选，本发明所提供的精液稀释液对驴属动物的精液保存格外适宜，因此，所述精液优选来自马属动物，例如马或驴。
选择健康，无生殖疾病、发情正常的成年母驴，种公驴低温保存精液用于发情母驴输精。
母驴发情鉴定及输精：配种员每天上午通过B超直肠检查，根据毛驴卵泡发育情况，判定配种时间，当卵泡直径大于35mm时，当天下午5-6点进行输精，用卡苏公司生产的输精枪(产品编号:019839)和注射器(20ml,产品编号:016065)进行子宫体输精，输精体积为5-15ml(优选15ml)，总精子数为1-10亿(优选10亿)。输精后隔一日的上午再次检查卵泡，若母驴未排卵则在当日下午再次输精，以此保证母驴在输精后的48h内排卵，直到48h内母驴排卵为止。最后一次配种后第18天用B超直肠检查法对母驴进行妊娠检查，统计情期受胎率,情期受胎率＝(情期怀孕个数/情期输精个数)×100％。
在上述输精方法方面做相似改动均属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种可以提高动物精液低温保存品质的精液稀释液。本发明提供的精液稀释液能够显著提高精液低温保存活性，延长精子体外保存时间。本发明操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响。可以在驴精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1表示精液低温保存不同时间对母驴受胎率的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验例1
提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜鸡卵黄；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1。精液稀释液的具体组成见表1。
表1
用上述表1中编号为SM1-SM4的4种稀释液对同一头种公驴的精液进行保存；以新鲜精液作为阳性对照。定时检测不同保存时间(12h,24h，48h，72h，96h，120h)的精子活力。所有实验结果6次独立重复，最后用SPSS软件进行统计分析。
所述保存精液的方法：
1)精液采集；要求精液精子活力90％以上；
2)将经检测合格的精液低速(600g左右)常温离心(10min左右)，弃上清；分别加入4倍体积的各组精液稀释液(37℃左右)，使精液密度为25～100×106个/mL；然后置于含少量空气的容器中，封口，包裹严密，标记公驴号及日期时间，放置于4℃冰箱保存。
试验结果发现：SM组稀释液保存精液时，采用SM3液保存驴精液的96小时直线前进活力、有效存活时间(直线前进≥0.40)和总存活时间(55.7±2.9、142.0±6.00h和184.0±3.50h)效果显著优于SM1液和SM2液(P＜0.05)，但与SM4液各项指标无统计学差异(P>0.05)，阳性对照组新鲜精液4℃保存12小时后，精子无活力。结果见表2和表3。
表2稀释液对精子直线前进活力的影响
注：对同一时间内的四种稀释液的保存效果进行对比；同一保存时间里下标小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)
表3SM组稀释液对精液低温保存存活时间的影响
注：对同一时间内的四种稀释液和新鲜精液的保存效果进行对比；同一保存时间里上标小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)；有效保存时间即精子活率保持在0.4以上的时间；总存活时间即精子至全部死亡的时间。
实验例2低温保存不同时间对母驴输精影响
配种试验：母驴群随机分组；取种公驴新鲜精液以及分别采用实施例1中稀释液SM3、INRA96(法国卡苏公司精液保存液)于4℃保存不同时间的精液，在同一情期内随机用于发情母驴配种。试验驴发情鉴定：配种员每天上午通过B超直肠检查，根据母驴卵泡发育情况，判定配种时间。当卵泡直径大于35mm时，当天下午5-6点进行输精，输精体积为15ml，总精子数为10亿。输精后第二日上午再次检查卵泡，若母驴未排卵则在当日下午再次输精，以此保证母驴在输精后的48h内排卵。配种后第18天用B超直肠检查法对母驴进行妊娠检查。妊娠结果进行卡方检验，不同字母表示差异显著，P＜0.05.
结果发现，稀释液SM3处理后的精液体外4℃保存0，48，72h后对母驴进行输精后的情期妊娠率和INRA96，SM3液稀释处理的新鲜精液的妊娠率没有统计学差异(P>0.05)，但是保存96小时后妊娠率显著降低(P<0.05)，120小时后没有毛驴受孕(结果见图1)。
综上所述，本发明所提供的精液稀释液通过对所含成分的选择和配比的精确控制，相较对比例实现了更好的精液保存效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种提高精液低温保存品质的精液稀释液，其特征在于，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖3.5～6.00g、乳糖0.300～2.5g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060～0.095g、柠檬酸钾0.082～0.41g、HEPES试剂0.952～1.325g、青霉素10～40万IU、链霉素10～40万IU、蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1％～2.5％。
2.根据权利要求1所述的精液稀释液，其特征在于，所述A溶液由以下成分组成：葡萄糖3.5～6.00g、乳糖0.300～2.5g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.080～0.098g、HEPES试剂0.952g、青霉素10～40万IU、链霉素10～40万IU、蒸馏水100mL。
3.根据权利要求1所述的精液稀释液，其特征在于，所述提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖6.00g、乳糖0.300g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.080g、HEPES试剂0.952g、青霉素40万IU、链霉素40万IU、蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1％；
或者，所述提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖3.5g、乳糖2.5g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.080g、HEPES试剂0.952g、青霉素40万IU、链霉素40万IU，蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1.0％；
或者，所述提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖4g、乳糖0.3g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.41g、HEPES试剂0.952g、青霉素40万IU、链霉素40万IU，蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1.0％；
或者，所述提高精液低温保存品质的精液稀释液，包括A溶液、脱脂奶和新鲜卵黄；其中，A溶液由以下成分组成：葡萄糖5g、乳糖0.3g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.08g、HEPES试剂0.952g、青霉素40万IU、链霉素40万IU，蒸馏水100mL；所述A溶液与脱脂奶的体积比为1:1；所述精液稀释液中新鲜卵黄的体积含量为1.0％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的精液稀释液，其特征在于，所述脱脂奶中蛋白质含量为4.0～6.0g/100g，脂肪含量≤0.5g/100g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的精液稀释液，其特征在于，所述新鲜卵黄来自鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋；优选为鸡蛋。
6.权利要求1-5任一项所述精液稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)按配比取A溶液的各成分，将除青霉素、链霉素之外的各成分混匀，灭菌，放凉后按配比加入青霉素、链霉素，制得A溶液；
2)取脱脂奶或用脱脂奶粉配制脱脂奶，灭菌，放凉后，至于4℃保存备用；
3)制备新鲜卵黄。
7.利用权利要求1-5任一项所述的精液稀释液保存精液的方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：
1)精液采集；优选精液精子活力90％以上；
2)将经检测合格的精液低速常温离心，弃上清；加入所述精液稀释液，使精液密度为25～100×106个/mL；然后置于含少量空气的容器中，封口，包裹严密，标记公驴号及日期时间，放置于4℃平衡柜或冰箱保存。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述精液来自马属动物，优选为马或驴。
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