CN103858858A - 马精液稀释液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种马精液稀释液及其制备方法，本发明的马精液稀释液包含以下重量份的原料：葡萄糖45~75份，双糖2.5~5.5份，棉籽糖1.5~3.5份，柠檬酸钠0.4~0.8份，柠檬酸钾0.5~0.9份，Hepes9.5~9.6份，水1000份，相对于1000份水相同体积的脱脂奶，以及相对1000ml稀释液，用量为100万-300万国际单位的抗生素。其制备方法为将上述组分溶解于水中，高压灭菌，冷却，与经加热、过滤并冷却的脱脂奶混合，然后加入抗生素，密封即得。本发明的马精液稀释液可有效延长马精子的存活时间，提高保存质量和活率，提高精子的质膜完整性和顶体完整性，进而提高母马受胎率。

Description

马精液稀释液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种马精液稀释液，该马精液稀释液用于马精液稀释后常温或者低温体外保存及母马的人工授精，属于动物繁殖技术领域。 

背景技术

我国是世界养马大国且资源丰富，据畜禽遗传品种志（2010）统计，我国拥有41个马种和29个驴种，但是生产方式较为落后，繁殖技术多年停滞不前，甚至有些地区出现严重倒退。近些年，随着国内马术运动、休闲骑乘及娱乐观赏马业的逐渐兴起，全国有大小型养马场、马术俱乐部、马匹改良站（点）等上万家，由国外进口的优质种公马数量有所增加，但仍无法满足我国对优质种公马育种需求日益扩大的新形势的需要，且地域分布极不平衡。由于各地运动用马繁育种马运输成本过高，严重妨碍了优质种公马的利用，亟需推广现代马属动物人工授精技术体系。 

目前，马精液保存技术主要分为液态保存和冷冻保存两种。液态保存主要以低温保存为主，随着国外的马种登记委员会允许使用低温和冷冻精液配种获得的幼驹进行登记，精液低温保存运输技术得到快速发展。低温保存技术可以保证马精液在短时间内（3-5天）保持较高的活率，其受胎率与自然交配相近，故使用广泛。此外，马精液冷冻保存技术可以最大程度克服地域和时间的制约，长时间保存马品种的遗传资源。但是其应用技术推广仍远不如牛等家畜普及，主要因为很多优秀的种公马精液不适合冷冻保存，且精液冷冻制作程序较为复杂，技术性较强，解冻后精子活率较低温保存精液低，且人工授精率较鲜精低。 

早期进行人工授精及精液保存时主要使用以葡萄糖或蔗糖为基础的稀释液，其保存时间短、精液保存时间也短。后改为以奶类为主的稀释液进行保存，但是其只使用奶类作为稀释液成分，未添加葡萄糖等糖类及缓冲物质来调节保存过程中稀释液的pH值变化，对精子的保存时间和质膜完整性产生不良的影响。 

用于马精液保存的稀释液种类很多，大多数是以牛奶、卵黄或乳脂/明胶为基础的稀释液。虽然卵黄稀释液能够获得类似的牛奶稀释液效果，但是其制作工艺较为复杂，通常也不能提高精子质量或受胎率，因此使用较少。近些年，人们开始研究确定成分的稀释液来减少其中的有害物质，而这些物质可能同样存在于复杂的生物物质（如牛奶和卵黄）中。对于低温保存后精液质量较差的种公马，应使用不同的稀释液进行保存实验以找到最适合这匹种公马的稀释液。国内关于马精液稀释液的报道较少且较早，稀释液配制单一，效果较差；目前，国外精液保存技术已经商业化，主要的稀释液有 

INRA82、Kenney、

Universal等。 

海藻糖是由两个葡萄糖分子构成的非还原性双糖，其在抗逆性强的生物体内含量丰富，可在极端环境（高温、高渗透压和低温）下对精子起到保护作用。人们在小鼠、兔和牛的精液冷冻保存中添加海藻糖，通过检测解冻后精子的活率、质膜完整性和顶体完整性等发现，海藻糖可显著提高精子冻后的生物功能，减少低温对其造成的损伤。人们还发现海藻糖不仅可以为精子的代谢提供能量物质，还可以在脱水精子外形成一保护膜，防止精子因脱水而受到损伤。 

但是，如前所述，当用作动物精液稀释液时，稀释液的组成、渗透压、不同成分与精液的成分之间存在复杂的相互作用，甚至稀释液中不同的成分之间也存在复杂的相互作用，因而制约了其在实际生产中的应用。另外，由于动物精液中存在复杂的生理成分，对于不同的动物种类来说，同样的稀释液往往显示出相差很大的效果， 其中的具体机理目前仍然有待于进一步的研究。目前，将海藻糖等双糖用于马精液稀释液具有何种效果的报道尚未见明确报道。 

发明内容

本发明的目的在于针对目前国内现有技术的不足，提供一种马精液稀释液。 

本发明提供的马精液稀释液，包含以下重量份的组分： 

相对于所述的1000份水相同体积的脱脂奶；以及抗生素，所述抗生素的用量为相对于每1000ml的稀释液，用量为100万-300万国际单位。 

优选地，本发明的马精液稀释液包含以下重量份的组分： 

相对于所述的1000份水相同体积的脱脂奶；以及抗生素，所述抗生素的用量为相对于每1000ml的稀释液，用量为200万国际单位。 

本发明所述的双糖为海藻糖、蔗糖或乳糖。 

优选地，使用的水为超纯水。 

本发明所述的脱脂奶为脱脂牛奶或脱脂奶粉水溶液。 

所述的脱脂奶粉水溶液为：4~10份脱脂奶粉溶于100份水中即得。 

本发明的马精液稀释液制备方法包括如下步骤： 

（1）将上述配比的葡萄糖、双糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾和Hepes溶解于水中，高温灭菌； 

（2）将所述量的脱脂奶加热15~25min，用消毒纱布过滤，冷却； 

（3）将步骤（1）和步骤（2）的稀释液混合，加入抗生素，密封保存。 

其中，所述的双糖为海藻糖、蔗糖或乳糖，所述制备过程均在无菌条件下进行。 

其中，步骤（1）中所述配比的各组分，溶于水中，待其全部溶解后，115℃高压灭菌15-20min，冷却至30℃以下； 

步骤（2）中的处理参数为：取与水等体积的脱脂奶于92℃-97℃水浴加热，使用6~8层消毒纱布过滤，冷却至30℃以下。 

步骤（3）具体为：将步骤（1）和步骤（2）的冷却到30℃以下的两部分稀释液混合，任选地加入抗生素，密封后放于4℃冰箱中保存备用。 

本发明的马精液稀释液的使用方法为：使用前，可将稀释液放于37℃水浴中预热，使用时按1:(3-5)比例与马精液混合。 

本发明的马精液稀释液含有葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、Hepes、脱脂牛奶/脱脂奶粉、青霉素、链霉素等物质。糖类（葡萄糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、）不仅可以为精子提供能量物质，还可以对精子起到保护作用；缓冲物质（柠檬酸钠、柠檬酸钾、Hepes）防止保存过程中溶液pH值变化较大而对精子造成损伤；脱脂牛奶不仅可以为精子提供能量物质，其含有的大 蛋白物质可以防止精子在降温过程遭受冷打击。该稀释液不仅能够有效延长低温或常温条件下马精子的存活时间，还有利于缓冲pH值变化对精液的影响，有利于维持马精子的质膜完整性及顶体完整性，提高母马的妊娠率。 

本发明的稀释液具有如下优点：一是能够有效延长常温（15℃）条件下马精子的存活时间，提高马精子体外保存的质量，常温下15℃马精子的存活时间约为48-72h，使用本发明的精液稀释液后，其存活时间约为120h；二是能够有效延长低温（4℃）条件下保存马精子的存活时间为160h，延长稀释后精子的活率，提高精子的质膜完整性和顶体完整性，从而提高母马繁殖受胎率：三是可根据种公马的精液特异性选择不同的抗生素，以达到最优的保存效果。本发明的马精液稀释液既适用于鲜精稀释后的即时输精，也适用于马精液稀释后的短期保存和长途运输后输精，显著提高了马精子的生存指数，保持其受精能力。使用本发明的稀释液，可以进行精液的常温及低温保存，通过远程运输方式大大提高优秀种公马的使用效率及应用地域范围。 

本发明的马精液稀释液可应用于任何采用人工授精的马保种场（区）、养殖场（户）、改良站（点）、种公马站等对象。 

本发明的马精液稀释液省时、高效，充分利用了种公马的种质资源，大大节约了引种开支，效果良好。以每匹种公马一次采精50ml，密度2亿/ml，每匹母马输精3-5亿有效精子数算，使用该稀释液每次稀释后可配种母约20-30匹母马，大大提高了种公马的利用效率。配种收入为1500元/次，一次采精配种可收入30000-45000元，种公马每周可采精3-4次，一年一匹公马配种6个月，可产生经济价值约为300万元，具有明显的社会效益和经济效益。 

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例1-3中，加入的各原料除特别说明外，均为市售。 

实施例1马精液稀释液的制备（1） 

首先称取5g葡萄糖、0.3g海藻糖、0.2g棉子糖、0.05g柠檬酸钠、0.08g柠檬酸钾、0.952g Hepes，溶于100ml超纯水中，待其全部溶解后，115℃高压灭菌20min，冷却至29℃；取100ml脱脂牛奶于92℃-97℃水浴加热20min，使用8层消毒纱布过滤，冷却至28℃后，将两种稀释液混合，之后加入青霉素20万单位和链霉素20万单位，密封后放于4℃冰箱中保存待用。所有制备过程均在无菌条件下进行。 

使用前，将稀释液放于37℃水浴中预热，使用时按1:3比例与马精液混合。 

实施例2马精液稀释液的制备（2） 

首先称取60g葡萄糖、5.5g蔗糖、3.5g棉子糖、0.4g柠檬酸钠、0.9g柠檬酸钾、9.55g Hepes，溶于1000ml超纯水中，待其全部溶解后，115℃高压灭菌15min，冷却至28℃；取1000ml脱脂牛奶于92℃-97℃水浴加热20min，使用6层消毒纱布过滤，冷却至27℃后将两种稀释液混合，之后加入青霉素200万单位和链霉素200万单位，密封后放于4℃冰箱中保存待用。所有制备过程均在无菌条件下进行。 

将稀释液于37℃水浴中预热，使用时按1:4比例与马精液混合。 

实施例3马精液稀释液的制备（3） 

首先称取7g葡萄糖、0.25g乳糖、0.15g棉子糖、0.08g柠檬 酸钠、0.05g柠檬酸钾、0.96g Hepes，溶于100ml超纯水中，待其全部溶解后，115℃高压灭菌18min，冷却至28℃；称取4~10g脱脂奶粉溶于100ml超纯水中，于92℃-97℃水浴加热20min，使用6层消毒纱布过滤，冷却至30℃以下后两种稀释液混合，之后加入青霉素20万单位和链霉素20万单位，密封后放于4℃冰箱中保存待用。所有制备过程均在无菌条件下进行。 

将稀释液于37℃水浴中预热，使用时按1:5比例与马精液混合。 

实施例4马精液稀释液的应用效果实验——对精液活率的影响 

利用分别添加了实施例1-3的马精液稀释液和Kenney稀释液（Hamilton Research,Inc）所制备得到的马精液，进行低温保存实验。低温温度为4℃，采精稀释前计为0h，每隔24h使用相差显微镜观察一次精液活率，并进行记录。实验结果表明：本发明实施例1、2、3制备的马精液稀释液可有效改善马精液在低温下的保存效果，精子存活时间延长至160h，且保存96h后精液活率仍可达到0.4以上，可用于输精，为缓解种公马配种压力及精液远程运输提供条件。 

表1稀释液对精液保存活率的影响 

表2稀释液对精液保存的影响 

注：对同一时间内的四种稀释液的保存效果进行对比；有效保存时间即精子 活率保持0.4以上的时间；总存活时间即精子至全部死亡的时间；存活指数即精子的平均存活时间。 

与现有的市售稀释液相比，本发明的精液稀释液能够使马精子的低温稳定性得到了较大的改善和提高。 

实施例5马精液稀释液的应用效果实验——对精子质膜的影响 

利用分别添加了实施例1、3的马精液稀释液和Kenney稀释液所制备得到的马精液，4℃下进行保存，之后进行低渗肿胀试验（HOST）检测精子尾部质膜的完整性。 

测试之前将低温保存的精液样品及HOST测试液提前在37℃水浴中预热30min。取各个样品100μl精液样品置于预热的1.5ml离心管中，然后加入HOST测试液900μl，之后在37℃下孵育30min，之后取20μl样品于预热的载玻片上，使用400倍的相差显微镜进行观察并记录不同精子数量（包括尾部弯曲和不弯曲的精子数）。 

实验结果表明：随着时间的延长，精子质膜完整率开始下降，而实施例1和实施例3的精子质膜完整率在相同保存时间下（48h以上）显著高于Kenney稀释液。因此，本发明的马精液稀释液可显著改善马精液的保存过程精子的质膜完整性，提高马精液保存的效果。 

表3稀释液对精子保存质膜完整率的影响 

Claims (10)

1.一种马精液稀释液，其特征在于，其原料包含以下重量份的组分：

相对于所述的1000份水相同体积的脱脂奶；以及抗生素，所述抗生素的用量为相对于每1000ml的稀释液，用量为100万-300万国际单位。

2.如权利要求1所述的马精液稀释液，其特征在于，包含以下重量份的组分：

相对于所述的1000份水相同体积的脱脂奶；以及抗生素，所述抗生素的用量为相对于每1000ml的稀释液，用量为200万国际单位。

3.如权利要求1所述的马精液稀释液，其特征在于，所述的双糖为海藻糖、蔗糖或乳糖。

4.如权利要求1所述的马精液稀释液，其特征在于，使用的水为超纯水。

5.如权利要求1所述的马精液稀释液，其特征在于，脱脂奶为脱脂牛奶或脱脂奶粉水溶液。

6.如权利要求1所述马精液稀释液，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

（1）将所述配比的葡萄糖、双糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾和Hepes溶解于水中，高温灭菌；

（2）将所述量的脱脂奶加热15~25min，用消毒纱布过滤，冷却；

（3）将步骤（1）和步骤（2）的稀释液混合，加入抗生素，密封保存。

7.如权利要求5所述的马精液稀释液，其特征在于，所述的双糖为海藻糖、蔗糖或乳糖，所述制备过程均在无菌条件下进行。

8.如权利要求5所述的马精液稀释液，其特征在于，步骤（1）中所述配比的各组分，溶于水中，待其全部溶解后，115℃高压灭菌15-20min，冷却至30℃以下；

步骤（2）中的处理参数为：取与水等体积的脱脂奶于92℃-97℃水浴加热，使用6~8层消毒纱布过滤，冷却至30℃以下。

9.权利要求1-8任意一项的马精液稀释液的制备方法，其特征在于，制备过程包括如下步骤：

（1）将所述配比的葡萄糖、双糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾和Hepes溶解于水中，高温灭菌；

（2）将所述量的脱脂奶加热15-25min，并用消毒纱布过滤，冷却；

（3）将步骤（1）和步骤（2）的稀释液混合，加入抗生素，密封保存。

10.如权利要求1-8任一所述的马精液稀释液在用于常温或冷冻保存马精液中的用途。