CN105638643B

CN105638643B - 一种羊精液冷冻稀释液

Info

Publication number: CN105638643B
Application number: CN201610086324.0A
Authority: CN
Inventors: 权国波; 洪琼花; 邵庆勇; 吴国权; 吕春荣
Original assignee: Kunming Yixingheng Animal Husbandry Technology Co ltd; Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Kunming Yixingheng Animal Husbandry Technology Co ltd; Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2016-02-16
Filing date: 2016-02-16
Publication date: 2018-01-12
Anticipated expiration: 2036-02-16
Also published as: WO2017139909A1; CN105638643A

Abstract

本发明涉及一种羊精液冷冻稀释液，每100ml包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷2.71g，柠檬酸1.4g，单糖1.0g，新鲜蛋黄5‑20ml，渗透性保护剂0‑10ml，青霉素10万IU，链霉素10万IU，聚乙烯醇0.05‑5g，余量为超纯水。本发明首次将常见的高分子聚合物聚乙烯醇作为冰晶抑制剂代替天然的抗冻蛋白应用于羊精液的冷冻保存研究中。解冻后精子的活率在75％左右，活力在50％以上，顶体完整性在65％以上，质膜完整性在50％左右，人工授精后不返情率达到70％以上。

Description

一种羊精液冷冻稀释液

技术领域

本发明涉及动物生殖生理与繁殖技术领域，具体涉及一种羊精液冷冻稀释液。

背景技术

尽管山羊精液冷冻保存研究已经开展了50多年，但是解冻后的精液活力仅在30％-50％左右，人工授精后不返情率和产仔率均显著低于新鲜精液。山羊精液冷冻过程中，细胞内外形成的冰晶对动物精子造成的机械损伤直接导致冷冻后精子活力的下降，如何降低冰晶的产生对山羊精子的损伤一直是山羊繁殖技术和低温生物学研究领域的研究热点，通过改变精液稀释液的组成成分可以降低冷冻对精子的损伤，目前，渗透性有机溶剂和糖类已经应用于哺乳动物精液的冷冻保存研究中，但是有机溶剂和糖类并不能完全解决细胞内外冰晶对精子造成机械损伤的问题。

1969年,DeVries和Wohlschlag发现了一种新型的冰晶抑制剂——抗冻蛋白。抗冻蛋白通过修饰冰晶性状和抑制重结晶等作用方式来减少冰晶对组织细胞的机械损伤。一些研究表明，抗冻蛋白能提高人类和一些哺乳动物精液冷冻保存后的存活率。然而，抗冻蛋白的应用也存在一定的局限性。首先，作为一种异源蛋白，抗冻蛋白可能导致动物产生一定的免疫反应；其次，目前抗冻蛋白的主要来源是从极地海洋鱼类的血液中提取，而且这些技术和专利主要掌握在欧美国家手中，价格高昂；最后，抗冻蛋白是通过改变冰晶形状来抑制冰晶形成，这导致一些尖锐针状冰晶的形成，从而加重冷冻对精子的机械损伤。目前对于抗冻蛋白是否能提高冷冻精子质量仍然存在一定的争议。

开发更多来源广泛、安全可靠的冰晶抑制剂，是提高精液冷冻技术在畜牧行业推广的关键，可以让优秀公畜的基因快速扩群，改良品种，提高饲养效率。

聚乙烯醇是一种高分子有机化合物，医药级的聚乙烯醇对人体无毒无副作用，被作为乳化剂和成膜剂广泛应用于医药和化妆品领域。中国专利《一种猪精液稀释剂》专利号：201310478237.6中公布了将聚乙烯醇应用于猪精液的常温稀释保存，中国专利《猪精液的低温保护剂》专利号：201210196733.8中公布了将聚乙烯醇应用于猪精液的0-4℃低温稀释保存。精液在常温或0-4℃低温保存时，主要是通过抑制精子活动而减少其能量损耗，使精子在静止状态下还能保持授精能力，在1-7天内使用，扩大了优秀公畜精液的使用范围，在这些技术中使用聚乙烯醇，主要是作为成膜剂保护精子细胞膜活性，同时可以降低精子的沉降速度，在常温稀释保存和0-4℃低温稀释保存时发挥了保护精子细胞的作用，但是还未见有研究报道将聚乙烯醇作为冰晶抑制剂用于精子的冷冻稀释保存。

发明内容

为解决上述问题，本发明首次发现非渗透性高分子聚合物聚乙烯醇具有与抗冻蛋白类似的抑制冰晶再形成的功效，可以代替抗冻蛋白应用于羊精液的冷冻保存，从而避免了与抗冻蛋白应用有关的缺陷，相关的研究未见文献报道。

本发明的羊精液冷冻稀释液，每100ml包括如下组分：

优选地，所述聚乙烯醇分子量为9KD。

优选地，所述单糖为葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖或木糖醇。

优选地，所述渗透性保护剂为甘油。

本发明的羊精液冷冻稀释液的制备方法，其步骤是，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、单糖1.0g、渗透性保护剂0-10ml、青霉素10万IU,链霉素10万IU，聚乙烯醇0.05-5g，溶于超纯水中，搅拌均匀，调整pH值至6.8-7.2，使用前加入56℃30min灭活处理的新鲜蛋黄5-20ml，混合均匀后定容至100ml，于4℃下15000转/分的速率离心1小时，取上清液用0.45μm一次性滤器过滤备用。

本发明的羊精液冷冻稀释液可以对精液进行一步法冷冻保存，其步骤是，将山羊精液和本发明的山羊精液冷冻稀释液按照1：4-1：10的比例混合均匀，而后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，而后迅速移入液氮气相中熏蒸5min，最后将细管投入液氮冷冻保存。

本发明的羊精液冷冻稀释液还可以对羊精液进行两步法冷冻保存，其步骤是，将羊精液和不含渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1：4的比例混合均匀，而后分装于2ml冻存管内，先缓慢降温至5℃，而后将上述悬浮液和本发明所述羊精液冷冻稀释液按照1：1的比例混合均匀，于5℃下进一步平衡1-3h,用移液器吸取0.2ml滴于干冰预冻，最后将冷冻颗粒投入液氮冷冻保存。

本发明的两步法冷冻保存方法中所述不含渗透性保护剂的冷冻稀释液，其制备方法为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、单糖1.0g、青霉素10万IU、链霉素10万IU、聚乙烯醇0.05-5g，溶于超纯水，搅拌均匀，使用前加入56℃30min灭活处理的新鲜蛋黄5-20ml，混合均匀后定容至100ml，于4℃下15000转/分的速率离心1小时，取上清液用0.45μm一次性滤器过滤备用。

对于山羊精液的冷冻保存而言，为了清除精浆中磷酸酯酶A与蛋黄相互作用对精子存活的不利影响，将精液和清洗液按照1：10的比例混合，600g离心15min，取上清，重复洗涤精子沉淀一次，其余操作步骤同绵羊。

本发明的冷冻保存方法中所述羊精液冷冻所需清洗液，其制备方法为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、单糖1.0g、青霉素10万IU、链霉素10万IU、聚乙烯醇0.05-5g，用超纯水定容至100ml，用0.22μm一次性滤器过滤。

本发明中用来进行冷冻保存的羊精液品质为：活力大于75％，畸形率小于10％，精子密度高于1×10⁹/ml。

本发明的技术方案中，所述三羟甲基氨基甲烷为缓冲物质，柠檬酸为溶质，可能也参与糖酵解作用，所述单糖为精子代谢底物，所述蛋黄为低温休克质膜保护剂，所述甘油为渗透性保护剂，所述青霉素和链霉素为抗生素，所述聚乙烯醇为冰晶抑制剂。我们的研究表明，尽管分子结构不同于抗冻蛋白，但是聚乙烯醇具有明显的抑制解冻后冰晶再形成的作用，从而降低了冰晶对精子细胞的二次损伤，此外，聚乙烯醇抑制冰晶形成的能力要高于其他高分子聚合物，如葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等。

本发明的有益效果如下：

1.首次将聚乙烯醇作为冰晶抑制剂成功应用于羊精液冷冻保存：本发明针对目前羊精液冷冻保存研究中存在的主要问题，首次将常见的高分子聚合物——聚乙烯醇作为冰晶抑制剂代替天然的抗冻蛋白应用于羊精液的冷冻保存研究中。聚乙烯醇能有效抑制冷冻精液解冻过程中冰晶的形成，减少冰晶对精子的机械性损伤，改善羊冷冻精液的质量，提高人工授精不返情率。大量实验表明，通过应用本发明的羊精液冷冻稀释液冷冻保存的羊精液，解冻后精子的活率在75％左右，活力在50％以上，顶体完整性在65％以上，质膜完整性在50％左右，人工授精后不返情率达到70％以上。

2.安全可靠、成本低廉：本发明中使用的聚乙烯醇是一类常见的化学原料，来源广泛、成本低廉、纯度有保证、化学性质稳定，使用聚乙烯醇作为精液冷冻稀释液的冰晶抑制剂，具有不会产生免疫反应、低毒性、纯度有保证、价格低廉等优点。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但是本发明的技术方案不以实施例为限。

实施例1：

采用电刺激法采集云南半细毛羊精液，而后进行精液品质检测。用于冷冻保存的绵羊精液指标必须满足：活力大于75％，精子密度高于1×10⁹/ml，畸形率小于10％，精液量为1-2ml。

配制精液冷冻稀释液，其步骤为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、葡萄糖1.0g、甘油5ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU、聚乙烯醇0.1g，溶于超纯水，搅拌均匀，使用前加入56℃30min灭活处理的新鲜蛋黄10ml，混合均匀后定容至100ml，于4℃下15000转/分的速率离心1小时，取上清液用0.45μm一次性滤器过滤备用。

将符合冷冻要求的绵羊精液和冷冻稀释液按照1：5的比例混合均匀，而后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，在此温度下进一步平衡2小时,而后移入液氮气相中熏蒸5min，最后投入液氮冷冻保存。

该方法冷冻保存的羊精液，解冻后精子的活率在75％左右，活力在50％以上，顶体完整性在65％左右，质膜完整性在50％左右，人工授精后不返情率达到70％以上。

实施例2：

采用假阴道采集努比亚羊精液，而后进行精液品质检测。用于冷冻保存的精液指标必须满足：活力大于75％，精子密度高于1×10⁹/ml，畸形率小于10％，精液量为0.75-2ml。

配制精液清洗液，其步骤为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、果糖1.0g、青霉素10万IU、链霉素10万IU、聚乙烯醇0.2g，溶于超纯水，混合均匀后定容至100ml，用0.22μm一次性滤器过滤备用。

配制精液冷冻稀释液，其步骤为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、果糖1.0g、甘油7ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU、聚乙烯醇0.2g，溶于超纯水，搅拌均匀，使用前加入56℃30min灭活处理的新鲜蛋黄15ml，混合均匀后定容至100ml，于4℃下15000转/分的速率离心1小时，取上清液用0.45μm一次性滤器过滤备用。

将符合冷冻要求的羊精液和清洗液按照1：4的比例混合均匀，与室温下2500转/分离心10分钟，去除上清后，再于相同离心条件下洗涤精子沉淀一次。加清洗液重悬精子沉淀至原体积。取洗涤后的精子悬液与冷冻稀释液按照1：8的比例混合均匀，而后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，在此温度下进一步平衡2小时,而后迅速移入液氮气相中熏蒸5min，最后投入液氮冷冻保存。

该方法冷冻保存的山羊精液，解冻后精子的活率在75％左右，活力在50％以上，顶体完整性在60％左右，质膜完整性在50％左右，人工授精后不返情率达到70％以上。

实施例3：

采用假阴道法采集无角陶赛特公羊精液，而后马上进行精液品质检测。用于冷冻保存的绵羊精液指标必须满足：活力大于75％，精子密度高于1×10⁹/ml，精液量为1-2ml。

配制不含渗透性保护剂的冷冻稀释液，其制备方法为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、葡萄糖1.0g、青霉素10万IU、链霉素10万IU、聚乙烯醇1.0g，溶于超纯水，搅拌均匀，使用前加入56℃30min灭活处理的新鲜蛋黄20ml，混合均匀后定容至100ml，于4℃下15000转/分的速率离心1小时，取上清液用0.45μm一次性滤器过滤备用。

配置精液冷冻稀释液，其步骤为，分别称取三羟甲基氨基甲烷2.71g、柠檬酸1.4g、果糖1.0g、甘油10ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU、聚乙烯醇1.0g，溶于超纯水，搅拌均匀，使用前加入56℃30min灭活处理的新鲜蛋黄20ml，混合均匀后定容至100ml，于4℃下15000转/分的速率离心1小时，取上清液用0.45μm一次性滤器过滤备用。

将符合冷冻要求的精液和不含渗透性保护剂的冷冻稀释液按照1：4的比例混合均匀，而后分装于2ml冻存管内，先缓慢降温至5℃，而后将上述悬浮液和本发明所述羊精液冷冻稀释液按照1：1的比例混合均匀，于5℃下进一步平衡1h,用移液器吸取0.2ml滴于干冰预冻，最后将冷冻颗粒投入液氮冷冻保存。

该方法冷冻保存的山羊精液，解冻后精子的活率在75％左右，活力在60％左右，顶体完整性在70％左右，质膜完整性在55％左右，人工授精不返情率在75％左右。

以上实施例中，采用的聚乙烯醇分子量均为9KD，由于聚乙烯醇是高分子聚合物，分子量过高则有可能在冷冻过程中形成“冰团”，对精子细胞造成更严重的损伤，分子量过低则有可能发挥不了抑制冰晶形成的功效。

上述实施例仅用于说明本发明，对本发明的保护范围不构成任何限制。

以上对本发明所提供的羊精液冷冻稀释液配方以及冷冻程序进行了详细介绍。本文通过具体实施方式对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种羊精液冷冻稀释液，其特征在于，每100ml包括如下组分：

余量为超纯水，所述渗透性保护剂为甘油，所述聚乙烯醇分子量为9KD。

2.根据权利要求1所述羊精液冷冻稀释液，其特征在于，所述单糖为葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖或木糖醇其中一种或几种的组合。

3.根据权利要求1所述羊精液冷冻稀释液，所述新鲜蛋黄经56℃、30min的灭活处理。