CN117158415B - 一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂及其应用，属于动物科学中的精子保存及人工授精技术领域。本发明要解决如何缓解猪精子在冷冻过程中的损伤及抗氧化能力降低的技术问题。所述产品由单独包装的稀释剂A、B和C组成，其中稀释剂A包括伊拉米肽、葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、卵黄、二甲基亚砜，稀释剂B包括伊拉米肽、葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、卵黄、二甲基亚砜、甘油；稀释剂C含有葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷等。本发明提供的冷冻保存稀释剂经试验证明可有效提高猪精子活率、活力、动力学参数、质膜完整率、高线粒体活性率、顶体完整率、DNA完整率、抗氧化能力、抗氧化酶活性、抗凋亡蛋白表达量及穿卵能力。
Description
技术领域
本发明属于动物科学中的精子保存及人工授精技术领域，具体涉及一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂，以及含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂冷冻保存猪精子的方法。
背景技术
猪肉是我国居民肉类消费的主要品类之一，生猪生产在畜牧业中具有重要的战略地位。人工授精技术是目前生猪繁殖的必需技术之一，几乎全部的集约化生猪养殖企业均于依靠人工授精技术完成生猪扩繁。
目前生猪的人工受精常以短期液体保存的精液为主，这主要是由于猪精子对体外保存环境的变化高度敏感。但也面临着保存时间较短及细菌繁殖等不利影响。而冷冻保存具有保存时间长及运输距离远等优势，逐渐成为生猪保种及远距离配种的首要选择。
活性氧是细胞的有氧代谢的副产物，适宜的浓度对精子获能及受精具有重要作用。但猪精子在冷冻保存过程中由于外界环境的剧烈变化极易导致细胞内活性氧的利用/代谢体系失衡即抗氧化能力降低，造成活性氧过度堆积最终使得精子凋亡。
冷冻保存其近乎无限的保存时间以及良好的远程运输耐受性使其成为了种质资源远距离交流的必需技术，能够使优良种质资源不再受时间及距离的限制，有效促进优良生猪繁殖及高质量生猪产品的生产。因此，如何缓解猪精子在冷冻过程中的损伤及抗氧化能力降低水平成为改善其冷冻保存质量的重要技术方向之一。
发明内容
针对现有技术的以上技术不足与缺陷，本发明提供了一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂及其冷冻保存猪精子的方法。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂，由单独包装的稀释剂A、稀释剂B和稀释剂C组成；其中，稀释剂A由伊拉米肽（Elamipretide）、葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、卵黄、二甲基亚砜和超纯水组成；稀释剂B由伊拉米肽、葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、卵黄、二甲基亚砜、甘油和超纯水组成；稀释剂C由葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、咖啡因、碳酸氢钠、EDTA-2Na、丙酮酸钠和超纯水组成。
上述稀释剂各原料的质量配比如下：
稀释剂A：伊拉米肽9.60mg、葡萄糖35g、乳糖35g、青霉素0.60g、链霉素1.00g、200mL卵黄、3vol%二甲基亚砜以及超纯水；稀释剂A的制备方法：先将伊拉米肽溶解二甲基亚砜中，再加入葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素和卵黄，使用超纯水溶解并定容至1000mL制得，放置3℃～5℃下保存；
稀释剂B：伊拉米肽9.60mg、葡萄糖35g、乳糖35g、青霉素0.60g、链霉素1.00g、200mL卵黄、3vol%二甲基亚砜、7vol%甘油以及超纯水；稀释剂B的制备方法：先将伊拉米肽溶解二甲基亚砜中，再加入葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素和卵黄，使用超纯水溶解并定容至1000mL制得，放置3℃～5℃下保存；
稀释剂C：葡萄糖25g、三羟甲基氨基甲烷9g、柠檬酸3g、咖啡因4.5g、碳酸氢钠3g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）4.3g及丙酮酸钠0.42g，以及超纯水；稀释剂C的制备方法：使用超纯水溶解并定容至1000mL制得，放置3℃～5℃下保存。
进一步地限定，所述卵黄为鸡蛋黄，且经过10000r/min离心处理并去除沉淀。
稀释剂A和稀释剂B中二甲基亚砜不超过稀释剂总量的3vol%。
本发明还提供一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂冷冻保存猪精子的方法，所述方法是按下述步骤进行的：
S1:分别将稀释剂A和稀释剂B的pH值调整至7.2～7.4后在35℃～37℃下预温；
S2:原始精液离心处理后去除上清液，立刻使用稀释剂A稀释精子至4亿/mL，放置16℃～18℃环境中平衡30分钟；
S3:然后加入与稀释剂A等量的稀释剂B稀释精子至2亿/mL，放置3℃～5℃环境中平衡60分钟；
S4:然后用冻精细管灌装封口机将稀释后的精子灌装入细管中，梯度降温至-115℃～-125℃并维持55秒～65秒，之后迅速投入液氮保存；
S5:将稀释剂C在35℃～37℃下预温，冻精细管由液氮中取出后迅速放置48℃～52℃中持续15秒，之后取出并于等量稀释剂C混匀，放置在35℃～37℃下暂时保存等待使用。
进一步地限定，步骤S1中采用稀盐酸或者稀NaOH调整pH值。
进一步地限定，步骤S2中用血球计数板确定精子浓度。
进一步地限定，步骤S4中使用程控冷冻仪梯度降温。
进一步地限定，步骤S4中梯度降温过程如下：以-5.5℃/min～-6.5℃/min速率降低至-4.5℃～-5.5℃并维持55秒～65秒，再以相同速率降低至-115℃～-125℃并维持55秒～65秒。
线粒体是细胞内负责能量代谢的重要细胞器之一，也是成熟精子内唯一存留的细胞器，对精子的运动及受精能力均具有重要影响。线粒体也是精子内活性氧产生的主要来源。但精子细胞质在成熟过程中高度浓缩，其胞内抗氧化酶系统功能减弱，无法有效地将过量活性氧进行清除。
本发明的猪精子冷冻稀释剂组分之间具有协同作用，其中，伊拉米肽促进细胞的三磷酸腺苷合成并减少活性氧生成，从而改善细胞氧化应激水平；葡萄糖及乳糖能够为精子提供充足的能量；青霉素及链霉素能够抑制稀释处理过程中的细菌滋生，避免由此导致的精子活力下降；卵黄及甘油能够保护精子细胞膜免受冰晶损害，维持膜结构完整；三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、碳酸氢钠及丙酮酸钠共同构成酸碱缓冲体系，维持精子外部环境的pH值稳定；EDTA-2Na降低冰晶形成大小及数量，保护精子脂膜结构；咖啡因有利于解冻后精子运动能力的快速恢复；二甲基亚砜有利于伊拉米肽在稀释剂中的充分溶解。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明的猪精子冷冻保存稀释剂使用方法，通过程序控制使得冷冻保存体系经历阶段性降温，尽可能地避免冰晶在冷冻过程中的产生。同时添加有伊拉米肽可提高精子的三磷酸腺苷生成能力并减少活性氧生成。解冻时使冷冻保存体系快速跨越冰晶区并进入复苏温度，同时提供足量能量及其他物质加速精子复苏。
本发明提供的一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂，经试验表明能够有效缓解冷冻保存猪精子活率、活力、运动性能、质膜完整性、顶体完整性、DNA完整性、线粒体活性、总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶活性、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性及凋亡蛋白等指标的降低水平，同时可显著降低冷冻保存猪精子的畸形率、丙二醛水平与H2O2水平。
具体实施方式
为使本发明目的、技术方案及技术优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：本实施例的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂是由单独包装的稀释剂A、稀释剂B及稀释剂C组成；其中，稀释剂A、稀释剂B及稀释剂C各原料的质量配比如下：
稀释剂A：伊拉米肽9.60mg、葡萄糖35g、乳糖35g、青霉素0.60g、链霉素1.00g、200mL卵黄、3vol%二甲基亚砜以及超纯水。稀释剂A的制备方法：先将伊拉米肽溶解二甲基亚砜中，再加入葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素和卵黄，最后使用超纯水溶解并定容至1000mL制得，放置4℃保存；
稀释剂B：伊拉米肽9.60mg、葡萄糖35g、乳糖35g、青霉素0.60g、链霉素1.00g、200mL卵黄、3vol%二甲基亚砜、7vol%甘油以及超纯水。稀释剂B的制备方法：先将伊拉米肽溶解二甲基亚砜中，再加入葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素和卵黄，最后使用超纯水溶解并定容至1000mL制得，放置4℃保存；
稀释剂C：葡萄糖25g、三羟甲基氨基甲烷9g、柠檬酸3g、咖啡因4.5g、碳酸氢钠3g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）4.3g、丙酮酸钠0.42g以及超纯水。稀释剂C的制备方法：使用超纯水溶解并定容至1000mL制得，放置4℃保存；
其中，上述卵黄为鸡蛋黄，且经过10000r/min离心处理并去除沉淀。
上述配方中，伊拉米肽能够促进精子三磷酸腺苷合成并抑制活性氧生成；葡萄糖及乳糖能够为精子提供充足的能量；青霉素及链霉素能够抑制稀释处理过程中的细菌滋生；卵黄及甘油能够保护精子细胞膜免受冰晶损害；三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、碳酸氢钠及丙酮酸钠共同构成酸碱缓冲体系，维持精子外部环境的pH值稳定；EDTA-2Na降低冰晶形成大小及数量，保护精子脂膜结构；咖啡因有利于解冻后精子运动能力的快速恢复；二甲基亚砜有利于伊拉米肽在稀释剂中的充分溶解。
本实施例的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂使用方法，即其冷冻保存猪精子的方法，具体是按下述步骤进行的：
S1:分别将稀释剂A和稀释剂B的pH值调整至7.2后在35℃下预温；
S2:使用血球计数板确定原始精液中的精子浓度，原始精液离心处理后去除上清液，立刻使用稀释剂A稀释精子至4亿/mL，放置16℃环境中平衡30分钟；
S3:步骤S2平衡完成后加入与稀释剂A等量的稀释剂B稀释精子至2亿/mL，放置3℃环境中平衡60分钟；
S4:步骤S3平衡完成后用冻精细管灌装封口机将稀释后的精子灌装入细管中，并使用程控冷冻仪按照预设程序梯度降温至-120℃并维持60秒，之后迅速投入液氮保存；
S5:将稀释剂C在35℃下预温，冻精细管由液氮中取出后迅速放置50℃中持续15秒，之后取出并于等量预温处理的稀释剂C混匀，放置在35℃下暂时保存等待使用。
其中，步骤S4所述程控冷冻仪预设程序为：以-5.5℃/min速率降低至-5.0℃并维持60秒；再以相同速率降低至-120℃并维持60秒。
采用下述实验验证本发明的效果：
按上述说明配制猪精子冷冻保存稀释液，伊拉米肽浓度依次为：测试组1（0mg/L）、测试组2（3.20mg/L）、测试组3（6.40mg/L）、测试组4（9.60mg/L）及测试组5（12.80mg/L），具体组分分别见表1-3，之后进行猪精子冷冻及解冻。
表1为各测试组猪精子冷冻保存稀释液A组分
表2为各测试组猪精子冷冻保存稀释液B组分
表3为各测试组猪精子冷冻保存稀释液C组分
使用计算机辅助精子分析系统分析解冻精子活率、活力、畸形率及动力学参数；使用JC-1/SYBR-14联合染色法评估精子质膜完整率及高线粒体活性率；使用FITC-PNA染色法评估精子顶体完整率；使用吖啶橙染色法评估精子DNA完整率；使用抗氧化能力测定试剂盒评估精子抗氧化能力与抗氧化酶活性；使用Western Blot技术评估精子凋亡蛋白表达量；使用叙利亚仓鼠（Mesocricetus auratus）黏附指数测试评估精子穿卵能力，结果以平均数±标准差表示，P＜0.05为差异显著。
表4为冷冻保存稀释剂对猪精子活率、活力及畸形率的影响。
同列数据肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表4可知，测试组4精子活率均显著高于其他各测试组（P＜0.05），测试组3及5显著高于测试组1及2（P＜0.05）；测试组4精子活力显著高于其他测试组（P＜0.05）；测试组4精子畸形率显著低于其他各试验组（P＜0.05），测试组3及5显著低于测试组1及2（P＜0.05）。
表5为冷冻保存稀释剂对猪精子动力学参数的的影响
同列数据肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表4可知，测试组4精子路径速度显著高于其他各测试组（P＜0.05）；测试组4及5精子直线速度显著高于测试组1、2及3（P＜0.05）；测试组4精子曲线速度显著高于其他各测试组（P＜0.05），测试组3及5精子曲线速度显著高于测试组1（P＜0.05）；测试组4精子鞭打频率显著高于其他各测试组（P＜0.05）。
表6为冷冻保存稀释剂对猪精子顶体完整率、质膜完整率、高DNA完整率及高线粒体活性率的影响。
同列数据肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表6可知，测试组4及5精子顶体完整率显著高于测试组1、2及3（P＜0.05）；测试组4及5精子质膜完整率显著高于测试组1、2及3（P＜0.05）；测试组4精子DNA完整率显著高于其他各测试组（P＜0.05）；测试组4及5精子高线粒体活性率显著高于测试组1、2及3（P＜0.05）。
表7为冷冻保存稀释剂对猪精子抗氧化能力的影响。
同列数据肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表7可知，测试组4猪精子总抗氧化能力显著高于其他各测试组（P＜0.05），测试组3及5猪精子总抗氧化能力显著高于测试组1及2（P＜0.05）；测试组4猪精子过氧化氢水平显著低于其他测试组（P＜0.05）；测试组4丙二醛水平显著低于其他测试组（P＜0.05），测试组3及5猪精子丙二醛水平显著高于测试组1及2（P＜0.05）。
表8为冷冻保存稀释剂对猪精子抗氧酶活性的影响。
同列数据肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表8可知，测试组4猪精子过氧化氢酶活性显著高于其他各测试组（P＜0.05）；测试组4及5猪精子谷胱甘肽过氧化物酶活性及超氧化物歧化酶活性显著高于测试组1、2及3（P＜0.05）；测试组4超氧化物歧化酶活性显著高于其他各测试组（P＜0.05）。
表9为冷冻稀释剂对猪精子凋亡蛋白表达量的影响
同列数据肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表9可知，测试组4抗凋亡蛋白Bcl-xl及Bcl-2表达量显著高于测试组1（P＜0.05），促凋亡蛋白BAK表达量显著低于测试组1（P＜0.05）。
表10为冷冻稀释剂对猪精子穿卵能力的影响
同列数据肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表10可知，测试组4猪精子黏附指数显著高于测试组1（P＜0.05）。
由此可见，向冷冻保存稀释剂中添加伊拉米肽对猪精子活率、活力、动力学参数、质膜完整率、高线粒体活性率、顶体完整率、DNA完整率、抗氧化能力、抗氧化酶活性、抗凋亡蛋白表达量及穿卵能力均有有益影响。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂，其特征在于，所述保存稀释剂由单独包装的稀释剂A、B和C组成；
稀释剂A由伊拉米肽、葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、卵黄、二甲基亚砜和超纯水组成；
稀释剂B由伊拉米肽、葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、卵黄、二甲基亚砜、甘油和超纯水组成；
稀释剂C由葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、咖啡因、碳酸氢钠、EDTA-2Na、丙酮酸钠和超纯水组成；
稀释剂A中，伊拉米肽的浓度为9.60mg/L，葡萄糖的浓度为35g/L，乳糖的浓度为35g/L，青霉素的浓度为0.60g/L，链霉素的浓度为1.0g/L，卵黄的浓度为200mL/L，二甲基亚砜的浓度为3vol%；
稀释剂B中，伊拉米肽的浓度为9.60mg/L，葡萄糖的浓度为35g/L，乳糖的浓度为35g/L，青霉素的浓度为0.60g/L，链霉素的浓度为1.0g/L，卵黄的浓度为200mL/L，二甲基亚砜的浓度为3vol%，甘油的浓度为7vol%；
稀释剂C中，葡萄糖的浓度为25g/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为9g/L，柠檬酸的浓度为3g/L，咖啡因的浓度为4.5g/L，碳酸氢钠的浓度为3g/L，EDTA-2Na的浓度为 4.3g/L，丙酮酸钠的浓度为0.42g/L。
2.根据权利要求1所述的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂，其特征在于，稀释剂A、稀释剂B、稀释剂C均放置3℃～5℃条件下保存。
3.根据权利要求1所述的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂，其特征在于，所述卵黄为鸡蛋黄，经过离心处理并去除沉淀。
4.根据权利要求1所述的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂，其特征在于，所述稀释剂A和稀释剂B的配制方法：先将伊拉米肽溶解二甲基亚砜中，再加入其他组分，用超纯水溶解并定容。
5.如权利要求1-4任意一项所述的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂冷冻保存猪精子的方法，其特征在于，所述方法是按下述步骤进行的：
S1:分别将稀释剂A和稀释剂B的pH值调整至7.2～7.4后在35℃～37℃下预温；
S2:原始精液离心处理后去除上清液，立刻使用稀释剂A稀释精子至4亿/mL，放置16℃～18℃环境中平衡30分钟；
S3:然后加入与稀释剂A等量的稀释剂B稀释精子至2亿/mL，放置3℃～5℃环境中平衡60分钟；
S4:然后用冻精细管灌装封口机将稀释后的精子灌装入细管中，梯度降温至-115℃～-125℃并维持55秒～65秒，之后迅速投入液氮保存；
S5:将稀释剂C在35℃～37℃下预温，冻精细管由液氮中取出后迅速放置48℃～52℃中持续15秒，之后取出并于等量稀释剂C混匀，放置在35℃～37℃下暂时保存等待使用。
6.根据权利要求5所述的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂冷冻保存猪精子的方法，其特征在于，S1中，用血球计数板测定精子浓度。
7.根据权利要求5所述的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂冷冻保存猪精子的方法，其特征在于，S4中，使用程控冷冻仪梯度降温。
8.根据权利要求5所述的含伊拉米肽的猪精子冷冻保存稀释剂冷冻保存猪精子的方法，其特征在于，S4中，梯度降温过程如下：以-5.5℃～-6.5℃/min的速率降低至-4.5℃～-5.5℃并维持55秒～65秒，再以相同速率降低至-115℃～-125℃并维持55秒～65秒。
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