CN104381247A

CN104381247A - 猪冷冻精液稀释液的制备方法

Info

Publication number: CN104381247A
Application number: CN201410716190.7A
Authority: CN
Inventors: 周学军
Original assignee: SANHE SHENGFAN TRADING Co Ltd
Current assignee: Technology development (Beijing) Co., Ltd.
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-12-02
Also published as: CN104381247B

Abstract

本发明涉及一种猪冷冻精液稀释液的制备方法。包括４种稀释液组分及配制步骤如下：液A：葡萄糖、柠檬酸钠、氯化钠、青霉素；液B：乳糖、葡萄糖、青霉素、链霉素、鲜蛋黄：液C：葡萄糖、柠檬酸钠、氯化钠、青霉素、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水；液D：无水柠檬酸、咖啡因g、三羟甲基氨基甲烷、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠、丙酮酸钠、葡萄糖；将各原料分别溶于100ml双馏水，制成四种稀释液，调pH值至6.5～7.5，置冰箱中冷藏。本发明的产品用于猪精液稀释液的冷冻保存。

Description

猪冷冻精液稀释液的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种猪冷冻精液稀释液的制备方法。

背景技术

生物技术飞速发展的今天，一些优秀种公畜的精液通过相关技术的处理制成冷冻精液，并通过人工授精技术大力推广使用。其中猪冷冻精液与人工授精技术的结合在现代养殖业中有非常广阔的市场前景，可以不受该公猪死亡、采精间隔、繁殖不育的限制；不受时间和地理位置差异的限制，并且可以大量减少公畜的饲养数量，降低饲养成本、使优质基因遗传概率达到最大化，为养殖业带来巨大的经济效益。从健康角度考虑，冻精为疾病检测提供了足够的时间，冻精还为大型的人工授精站爆发疾病时提供了稳定的精液供应保障。总之，猪精液冷冻技术的发展和冷冻精液的使用在品种引进、杂交改良、以及提高繁殖性能、疾病控制及遗传多样性保护方面具有重要意义。

稀释液是猪、牛、羊等精液冷冻时必不可少的组成成分，在冷冻过程中对精子起到稀释、缓冲、营养和保护的作用，并有效降低低温对精子的影响。

精液冷冻是保存遗传资源，建立精子基因库的重要措施。而冷冻后精子质量的好坏与家畜的妊娠率，产子率等密切相关。目前为止，猪精子在冷冻以后的精子活力、顶体完整率、质膜完整率等不很理想，致使在商品化养猪生产中，利用冷冻精液进行人工授精的母猪受胎率和产仔率较低而不能广泛应用，严重降低了优质公猪的利用率，饲养成本不能降低，生态环境的污染更没有得到缓解。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺陷问题，提供一种猪冻精液稀释液的制备方法。

本发明的技术方案如下：

包括稀释液A、稀释液B、稀释液C和稀释液D；四种稀释液各原料的质量配比及配制步骤如下：

稀释液A：葡萄糖3.5～5.0g、柠檬酸钠0.18～0.30g、氯化钠0.1～0.23g、青霉素0.2～0.45g；

将上述原料溶于100ml双蒸水中，调pH值至6.5～7.5，放在一旁降至室温，移至冰箱中冷藏备用；

稀释液B：乳糖5.00～12.5g、葡萄糖2～5.1g、青霉素80万u～100万u、链霉素0.20g～0.5g，鲜蛋黄：25～33ml；

将称取的上述原料溶于100ml双馏水，制成稀释液B；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用；

稀释液C：乳糖5.00～12.5g、葡萄糖2～5.1g、青霉素80万u～100万u、链霉素0.20g～0.5g，鲜蛋黄25～33ml,甘油6.7～9.5g，椰油单乙醇酰胺0.44～0.50g,十二烷基硫酸钠0.10～0.16g,三乙醇胺0.025～0.050g,盐酸0.01～0.035g,蒸馏水0.4～1.2g；

将称取的上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、链霉素溶于100ml双蒸水制成稀释液基础液；然后加入鲜蛋黄、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水，搅拌均匀；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用；

稀释液D：无水柠檬酸0.3～0.89g、咖啡因0.025～0.045g、三羟甲基氨基甲烷0.45～0.90g、碳酸氢钠0.30～0.85g、乙二胺四乙酸二钠0.18～0.43g、丙酮酸钠0.0085～0.042g、葡萄糖2.5～4.3g；

将称取的上述原料溶于100ml双蒸水制成稀释液D；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

进一步，所述的四种稀释液所用的双蒸水的温度均为32-38℃。

1、本发明设计的机理为：由于猪的精子较他家畜精子脂肪含量高，在降温和冷冻处理过程中不易存活这一特性，所以我们研发了猪的冷冻精液专项配方和独特的操作流程；

2、专项的稀释液配方：使精子在不同的降温处理阶段给予优势条件，使其不断地得到加能，不但有利于精子在解冻时顺利复苏，还有利于精子在冷冻的过程中抵抗冷冲击，保持精子细胞的完整。在稀释液D中复苏的精子会得到再次加能，最终使经过冷冻的精子的运动速度、存活时间、受精能力都强于常温精液中精子的水平。

3、精液采集与独特的降温处理方式：精液采集后会采用特制流程对精子代谢物和精清中一些有害物质进行除杂，再次加入营养物质，为进行下一阶段的降温处理提供能源，并在冷冻之前给予抗冷冻物质，准确控制精子与抗冷冻成分接触时间，既能降低甘油对精子的损害同时还起到冷冻保护作用。

完成以上发明机理包括以下成分及作用：

乳糖和葡萄糖配合使用作为主要的能源物质；柠檬酸钠具有良好的pH调节及缓冲性能。氯化钠是主要是控制精子细胞内电解质平衡；柠檬酸和三羟甲基氨基甲烷相互配合主要作为缓冲溶液使用，乙二胺四乙酸二钠有保护精子抗冷休克的作用，又可通过改变细胞膜渗透性,降低精子活动，从而延长精子寿命并保持受精能力。丙酮酸钠在此配方中主要起到强力的抗氧化作用，提高精子在缺氧情况的耐受能力，它全身碱化作用使其无论在缺氧或是有氧条件下都能消耗【H+】，保护精子细胞的基本功能。同时碳酸氢钠在维持渗透压也起着很重要的作用，精子在体内处在等渗的精清中，如果精清部分的盐浓度较高，则渗透压高，精子易脱水；反之,渗透压低，易使精子膨胀。适量使用碳酸氢钠可有效维持猪精液稀释液的渗透压。

咖啡因好似一种环核苷酸磷酸二酯酶的抑制剂，当其作用于精子时，使精子内钙离子内流和活性氧的产生，导致胞内腺苷酸环化酶的激活，导致胞内cAMP浓度的升高，从而诱发和维持精子的活力，促进精子获能，同时咖啡因还增强精子糖酵解的能力，从而增进其顶体反应能力，这对辅助生育中弱精改善有一定的帮助。同时咖啡因还增强精子糖酵解的能力，从而增进其顶体反应能力。

青霉素和链霉素主要起到杀菌，抑制微生物生长作用。

因为配方中含有鲜蛋黄，其中的油脂不易溶解，再加上其他一些成分中会存在一些微小粒子，如果不使其充分溶解，会影响该成分在配方中作用的发挥和一些微小粒子会不利于精子正常运动，因此，我们在配方中添加以下成分：椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺：将它们配合使用，起到水份与油脂充分溶解的作用，微量的盐酸主要用于PH的调节，以此保证稀释液的PH值的稳定性。

本发明的优点是利用上述配方进行猪精液稀释液的冷冻保存，可获得良好的效果，解冻后精子活力达78%以上，顶体完整率达78%以上、质膜完整率（PI染色）23%以下，线粒体活性（Rh123染色）达71%以上，畸形率12%以下。

具体实施方式：

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

稀释液A配制：

称取葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.18g、氯化钠0.23g、青霉素0.2g。将上述原料溶于溶于38℃的100ml双蒸水中，用酸或碱调pH值至6.5～7.5，放在一旁降至室温，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液B配制：

称取乳糖5.00g、葡萄糖5.1g、青霉素100万u、链霉素0.20g，鲜蛋黄：33ml，双蒸水100ml；将上述原料溶于溶于38℃的100ml双馏水，制成稀释液B；降至室温，用酸或碱调pH值至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液C配制：

称取乳糖5.00g、葡萄糖5.1g、青霉素80万u、链霉素0.5g，鲜蛋黄25,甘油6.7g，椰油单乙醇酰胺0.50g,十二烷基硫酸钠0.10g,三乙醇胺0.025g,盐酸0.035g,蒸馏水0.４g,双蒸水100ml。将上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、链霉素溶于38℃的100ml双蒸水制成稀释液基础液；然后加入鲜蛋黄、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水，搅拌均匀；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液D配制：

称取无水柠檬酸0.89g、咖啡因0.025g、三羟甲基氨基甲烷0.45g、碳酸氢钠0.85g、乙二胺四乙酸二钠0.18g、丙酮酸钠0.0085g、葡萄糖4.3g，双蒸水100ml；称取的各原料溶于38℃的100ml双蒸水制成稀释液D；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

实施例2

稀释液A配制：

称取葡萄糖３.５g、柠檬酸钠0.３０g、氯化钠0.１g、青霉素0.４５g。将上述原料溶于溶于3２℃的100ml双蒸水中，用酸或碱调pH值至6.5～7.5，放在一旁降至室温，移至冰箱中冷藏备用。

称取乳糖１２.５0g、葡萄糖２.０g、青霉素８0万u、链霉素0.５0g，鲜蛋黄：２５ml，双蒸水100ml；将上述原料溶于溶于3２℃的100ml双馏水，制成稀释液B；降至室温，用酸或碱调pH值至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液C配制：

称取乳糖１２.５0g、葡萄糖２.０g、青霉素１０0万u、链霉素0.２g，鲜蛋黄３３g,甘油９.５g，椰油单乙醇酰胺0.４４g,十二烷基硫酸钠0.10g,三乙醇胺0.05０g,盐酸0.0１g,蒸馏水１.２g,双蒸水100ml。将上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、链霉素溶于3２℃的100ml双蒸水制成稀释液基础液；然后加入鲜蛋黄、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水，搅拌均匀；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液D配制：

称取无水柠檬酸0.３g、咖啡因0.４5g、三羟甲基氨基甲烷0.90g、碳酸氢钠0.30g、乙二胺四乙酸二钠0.43g、丙酮酸钠0.042g、葡萄糖2.5g，双蒸水100ml；称取的各原料溶于32℃的100ml双蒸水制成稀释液D；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

实施例3

稀释液A配制：

称取葡萄糖4.５g、柠檬酸钠0.25g、氯化钠0.15g、青霉素0.3g。将上述原料溶于溶于35℃的100ml双蒸水中，用酸或碱调pH值至6.5～7.5，放在一旁降至室温，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液B配制：

称取乳糖8.00g、葡萄糖3.5g、青霉素90万u、链霉素0.35g，鲜蛋黄30ml，双蒸水100ml；将上述原料溶于溶于35℃的100ml双馏水，制成稀释液B；降至室温，用酸或碱调pH值至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液C配制：

称取乳糖9.0g、葡萄糖3.5g、青霉素90万u、链霉素0.35g，鲜蛋黄３0g,甘油8.0g，椰油单乙醇酰胺0.４8g,十二烷基硫酸钠0.13g,三乙醇胺0.035g,盐酸0.025g,蒸馏水0.8g,双蒸水100ml。将上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、链霉素溶于35℃的100ml双蒸水制成稀释液基础液；然后加入鲜蛋黄、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水，搅拌均匀；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

稀释液D配制：

称取无水柠檬酸0.6g、咖啡因0.35g、三羟甲基氨基甲烷0.70g、碳酸氢钠0.60g、乙二胺四乙酸二钠0.30g、丙酮酸钠0.002g、葡萄糖3.5g，双蒸水100ml；称取的各原料溶于35℃的100ml双蒸水制成稀释液D；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用。

猪精液冷冻保存应用试验:

（一）精液采集

由专业人员进行精液采集(制作冷冻精液所采用的公猪均为参加省级以上生产性能测定，且成绩优秀的猪。以此达到我们研发猪冷冻精液的目的之一：使优质基因遗传概率最大化)用显微镜在37℃下进行常规品质检测，选择精液的品质应该是无异味，呈乳白色，精子密度大、活力不低于90%，畸形精子率小于6%。

(二)精液的处理

将等温的稀释液A缓慢加入到新鲜精液中（按比例1:1-1.5稀释），降温至17度，离心处理10分钟，离心力：800G；弃去上清液，根据最终所需精液浓度0.5ml精液中含精子为2亿，兑上稀释液B，将兑好的精液降温至4℃-5℃，加入稀释液C，平衡半小时，灌装冷冻。

（三）精液冷冻

迅速将灌装后的冻精细管移到液氮池中，冷冻5-11分钟，然后将精液细管迅速投入液氮里进行保存。

（四）精液解冻

解冻镜检的方法是将保存在液氮里面的冻精细管投入到50℃的水中进行解冻，保持10-13秒，迅速从水中取出精液细管，用纸巾将精液细管表面的水分擦拭干净，用精液剪将细管的两端剪开，使精液流进D液中进行稀释。

（五）精液评定

解冻后精子活力达78%以上，顶体完整率达78%以上，质膜完整率（PI染色）23%以下，线粒体活性（Rh123染色）达71%以上，畸形率12%以下。

解冻后的精子17℃恒温条件下存活时间能达84小时，38℃恒温条件下存活时间能达5-6小时，室温下（25℃-27℃）存活时间不低于60小时。冷冻精液的运动速度、存活时间和受精能力都显著高于常温精液。

（四）冻精应用

（五）将冷冻精液应用到配种实验中，选择300头发情正常且无生产疾病的母猪进行冻精配种实验（其中初产母猪100头和经产母猪200头），初产母猪准胎率为86%，经产母猪准胎率达90%。

（六）最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，其特征在于：包括稀释液A、

稀释液B、稀释液C和稀释液D；四种稀释液各原料的质量配比及配制步骤如下：

将称取的上述原料乳糖、葡萄糖、青霉素、链霉素溶于100ml双蒸水制成稀释液基础液；然后相应加入鲜蛋黄、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水，搅拌均匀；降至室温，调pH值稳定至6.5～7.5，移至冰箱中冷藏备用；

2.如权利要求1所述的一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，其特征在于：所述的四种稀释液所用的双蒸水的温度均为32-38℃。