CN101869101A - 一种猪精液冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪精液冷冻保存方法。该方法要求精液样品新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：1)猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制；2)精液稀释；3)精液预冷平衡；4)精液的滴冻；5)精液解冻和冻后活力检查。本发明的益效是：本发明进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。

Description

一种猪精液冷冻保存方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体是一种猪精液冷冻方法。

背景技术

国内也有一些单位研究和优化猪精液冷冻保存方法，例如：西北农林科技大学、浙江大学等，我们研制的方法与他们不同，本发明进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪精液冷冻保存方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种猪精液冷冻保存方法，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：

1.猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制

1.1猪精液冷冻稀释液配方

稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液

1.1.1常温稀释液配方

常温稀释液由葡萄糖32.0g/L；TES 12.0g/L；Tris 2.0g/L；KCl 0.8g/L；EDTA-Na₂ 1.5g/L；甘氨酸5.0g/L；青霉素(Penicillin G)10000IU/L，硫酸链霉(Streptomycin sulfate)0.05g/L。

1.1.2冷冻稀释液配方

在常温稀释液的基础上加卵黄20％(v/v)、甘油6％(v/v)即为冷冻稀释液。

1.2.稀释液的配制

1.2.1常温稀释液的配制

准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于4℃冰箱中待用。

1.2.2冷冻稀释液的配制

新鲜鸡蛋1～2只，先用75％的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用10ml一次性注射器去掉针头抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻稀释液10ml时，取常温稀释液7.4ml，卵黄上清2ml，甘油0.6ml混匀即为冷冻稀释液，冷冻稀释液为现配现用。

2.精液稀释

2.1常温稀释液的稀释

在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1∶1稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室。

2.2冷冻稀释液的稀释

当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1∶1稀释后，检查活力，如精液活力≥0.7即可进行精液预冷平衡。

3.精液预冷平衡

把稀释好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡4h。

4.精液的滴冻

把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷10min。把平衡好的精液按0.25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，10min后把颗粒铲进液氮中。

5.精液解冻和冻后活力检查

从液氮中抽取1～2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50℃的水中进行解冻，解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37℃恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。

本发明的益效是：本发明进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例

一种猪精液冷冻方法，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：

1.猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制

1.1猪精液冷冻稀释液配方

稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液

1.1.1常温稀释液配方

常温稀释液由葡萄糖32.0g/L；TES 12.0g/L；Tris 2.0g/L；KCl 0.8g/L；EDTA-Na₂ 1.5g/L；甘氨酸5.0g/L；青霉素(Penicillin G)10000IU/L，硫酸链霉(Streptomycin sulfate)0.05g/L。

1.1.2冷冻稀释液配方

在常温稀释液的基础上加卵黄20％(v/v)、甘油6％(v/v)即为冷冻稀释液。

1.2.稀释液的配制

1.2.1常温稀释液的配制

准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于4℃冰箱中待用。

1.2.2冷冻稀释液的配制

新鲜鸡蛋1～2只，先用75％的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用10ml一次性注射器去掉针头抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻稀释液10ml时，取常温稀释液7.4ml，卵黄上清2ml，甘油0.6ml混匀即为冷冻稀释液，冷冻稀释液为现配现用。

2.精液稀释

2.1常温稀释液的稀释

在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1∶1稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室。

2.2冷冻稀释液的稀释

当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1∶1稀释后，检查活力，如精液活力≥0.7即可进行精液预冷平衡。

3.精液预冷平衡

把稀释好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡4h。

4.精液的滴冻

把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷10min。把平衡好的精液按0.25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，10min后把颗粒铲进液氮中。

5.精液解冻和冻后活力检查

从液氮中抽取1～2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50℃的水中进行解冻，解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37℃恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。

6.精子的质膜完整性

采用低渗肿胀实验(HOST)进行检测。取5μL解冻精液放入1mL低渗液中(1.3512g果糖和0.7352g二水柠檬酸钠溶于100mL去离子水)混匀。孵育30min后，取20μL精液滴在血细胞计数板上，在400×相差显微镜下观察精子尾部情况，分析精子质膜情况。

7.精子的顶体完整性

顶体完整率检查参照江一平等^[10]报道的方法，用考马斯亮蓝R250染色液对解冻精子进行染色，然后在1000×显微镜下检查精子畸形率和顶体完整率。每个处理制片2张，每片记数200个以上的精子。

8.精子的线粒体活性

按JC-1试剂盒说明书操作。JC-1染液的配制：(2.5μl JC-1染料+100μL JC缓冲液+400μL超纯水)/样本，避光放置。洗涤液的配制：(400μL JC缓冲液+1600μL超纯水)/样本。取8mL解冻精液加1mL PBS轻轻打匀，2000r/min离心6min，总共洗两次。然后，加JC-1染液和PBS各0.5mL，混匀后在37℃水浴锅中蔽光孵育30min。孵育后，再用配制好的洗涤液洗两次(2000r/min离心6min)。400×荧光显微镜下观察。

9.试验设计

在冷冻稀释液基础上添加不同浓度(0，0.5g/L，1g/L，1.5g/L)的牛血清白蛋白(BSA)作为试验组。然后根据解冻后，精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性等指标来评定冻后精子的质量。

10.统计分析

对试验数据用SAS统计软件进行分析。把活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性的数据进行反正弦转换，再用一般线性模型下的Duncan’s多重比较检验各组之间差异的显著性。

结果与分析

试验重复6次。从表1的试验分析结果可知，添加不同浓度(0.5g/L，1g/L，1.5g/L)的BSA与对照组相比，冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性均无显著差异(P＞0.05)。但通过数据可以看出，0.5g/L BSA组的冻后精子活力略高于对照组及其他试验组；质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性也要略高于其它各组。总体来说，各个试验组与对照组相比均无显著差异(P＞0.05)。

表1不同浓度的BSA对猪精液冷冻效果的影响

Table1 Effect of different BSA concentrations on cryopreservation ofboar spermatozoa

同一列数据上标不同字母表示差异显著(a、b：P＜0.05)。

Figures with different letters within columns differ significantly(a、b：P＜0.05).

Claims (1)

1.一种猪精液冷冻保存方法，其特征在于，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：

1)猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制

1.1)猪精液冷冻稀释液配方

稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液

1.1.1)常温稀释液配方

常温稀释液由葡萄糖32.0g/L；TES 12.0g/L；Tris 2.0g/L；KCl 0.8g/L；EDTA-Na₂ 1.5g/L；甘氨酸5.0g/L；青霉素(Penicillin G)10000IU/L，硫酸链霉(Streptomycin sulfate)0.05g/L；

1.1.2)冷冻稀释液配方

在常温稀释液的基础上加卵黄20％(v/v)、甘油6％(v/v)即为冷冻稀释液；

1.2.)稀释液的配制

1.2.1)常温稀释液的配制

准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于4℃冰箱中待用；

1.2.2)冷冻稀释液的配制

新鲜鸡蛋1～2只，先用75％的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用10ml一次性注射器去掉针头抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻稀释液10ml时，取常温稀释液7.4ml，卵黄上清2ml，甘油0.6ml混匀即为冷冻稀释液，冷冻稀释液为现配现用；

2)精液稀释

2.1)常温稀释液的稀释

在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1∶1稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室；

2.2)冷冻稀释液的稀释

当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1∶1稀释后，检查活力，如精液活力≥0.7即可进行精液预冷平衡；

3)精液预冷平衡

把稀释好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡4h；

4)精液的滴冻

把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷10min。把平衡好的精液按0.25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，10min后把颗粒铲进液氮中；

5)精液解冻和冻后活力检查

从液氮中抽取1～2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50℃的水中进行解冻，解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37℃恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。