CN107232183A - 卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用方法 - Google Patents

卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用方法，所述序贯玻璃化冷冻液包括皱缩液、平衡液和玻璃化液，所述皱缩液为使细胞脱水的非渗透性保护剂。本发明的优点在于：(1)细胞在进入平衡液前先用非渗透性保护剂预处理使其脱水，可缩短平衡液内的作用时间，降低渗透性保护剂的化学毒性；(2)非渗透性保护剂预处理，可提高卵子胞膜的稳定性，使卵子更耐受渗透损伤，有助于提高复苏卵子的存活率；(3)不同熟练程度的操作者均可获得非常稳定的高存活率，临床应用前无需进行长时间、大样本量的技术培训；(4)结果稳定、操作简单，将极大有利于人卵玻璃化冷冻技术在临床上广泛推广。

Description

卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用 方法
技术领域
本发明属于医学中的辅助生殖领域，更具体地讲，涉及卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用方法。
背景技术
卵子冷冻价值巨大，比如，罹患癌症的适龄女性可在化疗前冻存卵子，癌症治疗后再解冻卵子生育，而无需借卵；职业女性可在年轻时将卵子冷冻，待有生育意愿时解冻卵子生儿育女；在符合伦理和知情同意的前提下，辅助生殖治疗的女性可将部分卵子冷冻，成功分娩后将冻存的卵子捐赠给他人，解决赠卵来源困难的难题；卵子冷冻在珍稀动物、实验动物保种和再生医学研究等领域也具有重要的研究和应用价值。
然而，卵子冷冻技术目前并不成熟，表现为两低一高，即存活率和囊胚形成率低，而流产率高。人卵慢速冷冻的存活率仅为50％-70％，玻璃化冷冻对慢速冷冻是一次革命，胞内和胞外均不会形成冰晶，存活率可达85％-90％以上。但是，玻璃化技术对操作者的要求很高，冷冻结局严重受限于胚胎学家的操作技巧和熟练程度，表现有三：1)文献显示，使用相同冷冻液和冷冻方法的各个不同实验室其冷冻结局有很大差别；2)同一个实验室不同操作者之间的差异很大，以临床上广泛使用的15％EG+15％DMSO+0.5M蔗糖+Cryotop玻璃化冷冻方案为例，操作者之间的存活率差异可高达30％以上；3)同一个操作者使用相同的冷冻方法，经过大样本量的训练后，存活率可有明显提高，直至接近其个人成绩的上限。这说明目前公知的人卵玻璃化冷冻方案(包括冷冻液和冷冻方法)掌握难度较大，事实也是如此，该技术并未在临床上广泛使用，仅作为取卵日无精子或癌症患者放化疗前的补救疗法。所以，研究开发重复性好，稳定性高，不依赖于操作者经验的人卵玻璃化冷冻液及冷冻方案具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供重复性好，稳定性高，不依赖于操作者经验的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液。
本发明的第二个目的在于提供卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液的使用方法。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液，其特征在于，所述序贯玻璃化冷冻液包括皱缩液、平衡液和玻璃化液，所述皱缩液为使细胞脱水的非渗透性保护剂。
作为一个优选方案，所述皱缩液为0.01mol/L-1.0mol/L蔗糖和/或海藻糖溶液。
作为一个优选方案，所述皱缩液为0.1mol/L-0.5mol/L蔗糖和/或海藻糖溶液。
作为一个优选方案，所述皱缩液为0.1mol/L-0.2mol/L蔗糖和/或海藻糖溶液
作为一个优选方案，所述平衡液为5％-10％EG+5％-10％DMSO，所述玻璃化液为10％-20％EG+10％-20％DMSO+0.01mol/L-1.0mol/L蔗糖和/或海藻糖。
作为一个优选方案，所述平衡液为7.5％EG+7.5％DMSO，所述玻璃化液为15％EG+15％DMSO+0.5mol/L蔗糖和/或海藻糖。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液使用方法，其特征在于，将细胞分别经皱缩液作用30秒-5分钟、经平衡液作用1分钟-15分钟和经玻璃化液作用30秒-180秒后，装载于玻璃化冷冻载体后投入液氮。
作为一个优选方案，将细胞分别经皱缩液作用1分钟-2分钟、经平衡液作用8分钟-12分钟和经玻璃化液作用60秒-120秒后，装载于玻璃化冷冻载体后投入液氮。
本发明要求卵母细胞在投入液氮完成玻璃化冻结前，须序贯经过三种冷冻液分别实现三个目的：第一步用一定浓度的非渗透性保护剂使细胞脱水(胞浆皱缩)，所用液体称为皱缩液；第二步用较低浓度的渗透性保护剂使细胞充分平衡，所用液体称为平衡液；第三步用适当浓度的非渗透性保护剂和较高浓度的渗透性保护剂使细胞进一步平衡并再次脱水，以达到投入液氮时可实现完全玻璃化状态之目的，所用液体称为玻璃化液。目前现有的玻璃化冷冻液核心环节为两步，即平衡液和玻璃化液，本发明在现有的玻璃化方案前增加了一步，即用非渗透性的高渗液(如蔗糖、海藻糖等)使细胞脱水，胞浆体积缩小，这将会缩短细胞在第二步平衡液内完成平衡所需要的时间，降低冷冻保护剂对细胞的毒性作用(提高发育潜能)，并可能有助于提高细胞膜的稳定性，降低操作难度，提高复苏存活率，这是本发明的优势得以实现的根本原因。
本发明所使用的平衡液和玻璃化液可与目前公知的、辅助生殖临床上广泛使用的玻璃化冷冻液相同，如平衡液为7.5％(V/V)乙二醇(Ethylene Glycol，EG)+7.5％(V/V)二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)或7.5％(V/V)EG+7.5％(V/V)丙二醇(Propyleneglycol，PROH)，玻璃化液为15％(V/V)EG+15％(V/V)DMSO+0.5mol/L蔗糖或15％(V/V)EG+15％(V/V)PROH+0.5mol/L蔗糖。
对配制皱缩液、平衡液和玻璃化液所用的基础液和蛋白添加物无特别要求。基础液可为改良的人输卵管液(modified human tubal fluid，mHTF)、TCM199或平衡盐溶液PBS等。蛋白添加物可为终浓度为10％-20％(V/V)的人血清白蛋白(HSA)或血清替代物(SerumSubstitute Supplement，SSS)等。
本发明将卵子用非渗透性保护剂预处理使其体积缩小后再进行玻璃化冷冻，后续平衡液和玻璃化液可与现有方案类似，对临床上广泛使用的EG+DMSO+蔗糖和/或海藻糖组合和EG+PROH+蔗糖和/或海藻糖组合均可适用。文献也有报道在卵子玻璃化冷冻前进行预处理，如直接在基础液里静置1-2分钟(本质是使卵子适应室温的操作环境，因为人卵本来培养在37℃的温箱内)，或者基础液中添加β-巯基乙醇(活性氧抑制剂)、细胞松弛素B或紫杉醇(细胞骨架稳定剂)等，以减少卵子纺锤体和微观微丝的结构改变，这些预处理方式均着眼于提高复苏卵子的发育潜能，目前仅在动物卵子上进行了尝试(效果有争议，未用于人卵)，不能降低冻卵技术的操作难度，也不能提高冷冻结局的稳定性，与本发明所述的非渗透性保护剂皱缩法的预处理方式和预期目标均显著不同。
本发明的优点在于：(1)细胞在进入平衡液前先用非渗透性保护剂预处理使其脱水(胞浆皱缩)，可缩短平衡液内的作用时间，降低渗透性保护剂的化学毒性；(2)非渗透性保护剂预处理，可提高卵子胞膜的稳定性，使卵子更耐受渗透损伤，有助于提高复苏卵子的存活率；(3)不同熟练程度的操作者均可获得非常稳定的高存活率，临床应用前无需进行长时间、大样本量的技术培训；(4)结果稳定、操作简单，将极大有利于人卵玻璃化冷冻技术在临床上广泛推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.蔗糖皱缩法序贯玻璃化冷冻液的配制
皱缩液：称取0.342g-34.2g蔗糖，加10mL-20mL SSS，用mHTF或PBS补足至总量100mL，即为0.01mol/L-1.0mol/L的皱缩液。作为优选，称取蔗糖3.42g，加20mL SSS，用mHTF补足至总量100mL，即为0.1mol/L的皱缩液。
平衡液：量取5mL-10mL EG，5mL-10mL DMSO，加10mL-20mL SSS，用mHTF或PBS补足至总量100mL，即为5％-10％EG+5％-10％DMSO的平衡液。作为优选，量取7.5mL EG，7.5mLDMSO，加20mL SSS，用mHTF补足至总量100mL，即为7.5％EG+7.5％DMSO的平衡液。
玻璃化液：量取10mL-20mL EG，10mL-20mL DMSO，称取0.342g-34.2g蔗糖，加10mL-20mL SSS，用mHTF或PBS补足至总量100mL，即为10％-20％EG+10％-20％DMSO+0.01mol/L-1.0mol/L蔗糖的玻璃化液。作为优选，量取15mL EG，15mL DMSO，称取17.1g蔗糖，加20mLSSS，用mHTF补足至总量100mL，即为15％EG+15％DMSO+0.5mol/L蔗糖的玻璃化液。
实施例2.海藻糖皱缩法序贯玻璃化冷冻液的配制
皱缩液：称取0.378g-37.8g海藻糖，加10mL-20mL SSS，用mHTF或PBS补足至总量100mL，即为0.01mol/L-1.0mol/L的皱缩液。作为优选，称取海藻糖3.78g，加20mL SSS，用mHTF补足至总量100mL，即为0.1mol/L的皱缩液。
平衡液：量取5mL-10mL EG，5mL-10mL DMSO，加10mL-20mL SSS，用mHTF或PBS补足至总量100mL，即为5％-10％EG+5％-10％DMSO的平衡液。作为优选，量取7.5mL EG，7.5mLDMSO，加20mL SSS，用mHTF补足至总量100mL，即为7.5％EG+7.5％DMSO的平衡液。
玻璃化液：量取10mL-20mL EG，10mL-20mL DMSO，称取0.378g-37.8g海藻糖，加10mL-20mL SSS，用mHTF或PBS补足至总量100mL，即为10％-20％EG+10％-20％DMSO+0.01mol/L-1.0mol/L蔗糖的玻璃化液。作为优选，量取15mL EG，15mL DMSO，称取18.9g海藻糖，加20mL SSS，用mHTF补足至总量100mL，即为15％EG+15％DMSO+0.5mol/L海藻糖的玻璃化液。
实施例3.不同溶液的渗透压测定及卵子在蔗糖溶液内的体积变化
发明人测定了0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L蔗糖溶液的渗透压，分别为387mOsm/kg·H2O、505mOsm/kg·H2O、899mOsm/kg·H2O和1464mOsm/kg·H2O(表1)。经0.1mol/L蔗糖溶液处理2分钟后卵子的体积缩小为原体积的62％左右，而经1.0mol/L蔗糖溶液预处理2分钟后卵浆容积缩小为原来的38％左右，但预处理导致的卵浆容积缩小并不影响昆明小鼠卵子的发育潜能(表2)。发明人还测定了细胞松弛素B和紫杉醇预处理液的渗透压，分别为293mOsm/kg·H2O和295mOsm/kg·H2O(表1)，这与基础液20％SSS-mHTF(289mOsm/kg·H2O)相当，都属生理渗透压范围，不会造成卵浆体积减小。
表1不同溶液的渗透压
实施例4.小鼠MⅡ卵子蔗糖皱缩法玻璃化冷冻
取出4℃冰箱内储存的皱缩液、平衡液和玻璃化液置室温30分钟后使用。分别取1mL皱缩液和平衡液置四孔板的1号孔和2号孔，2枚小鼠MⅡ卵子分别在皱缩液和平衡液内作用1分钟和5分钟。卵子在平衡液内作用到3分钟-4分钟时，在四孔板皿盖上准备2个50μL的玻璃化液微滴，将平衡液内充分平衡(5分钟)的卵子转移至玻璃化微滴内，每个微滴停留30秒后，迅速装载于冷冻载体Cryotop上，直接投入液氮内完成玻璃化冻结，再将Cryotop置于冷冻支架上转移至液氮罐内长期保存。
实施例5.人MⅡ卵子蔗糖皱缩法玻璃化冷冻
取出4℃冰箱内储存的预处理液、平衡液和玻璃化液置室温30分钟后使用。分别取1mL预处理液和平衡液置四孔板的1号孔和2号孔，2枚体外培养成熟的人MⅡ卵子分别在预处理液和平衡液内作用1分钟和10分钟。卵子在平衡液内作用到8分钟-9分钟时，在四孔板皿盖上准备2个50μL的玻璃化液微滴，将平衡液内充分平衡(10分钟)的卵子转移至玻璃化微滴内，每个微滴停留30秒后，迅速装载于冷冻载体Cryotop上，直接投入液氮内完成玻璃化冻结，再将Cryotop置于冷冻支架上转移至液氮罐内长期保存。
实施例6.卵子经不同浓度的蔗糖溶液预处理后的发育潜能比较
常规方法促排6-8周龄昆明雌鼠，获取MⅡ卵子，经不同浓度的蔗糖溶液预处理1分钟、2分钟后，用氯化锶化学激活，观察卵裂率(2细胞率)、囊胚形成率、囊胚孵出率和总效率(孵出囊胚/卵子数*100％)，研究卵子经不同浓度蔗糖溶液预处理后的发育潜能，结果显示0.01mol/L-1.0mol/L各组蔗糖溶液处理1分钟和2分钟后均与对照组(0mol/L蔗糖组，即20％SSS-mHTF基础液、不含蔗糖)无显著差异(表2)，所以蔗糖溶液预处理不会降低卵子的继续发育能力，可以认为该操作是安全的。
表2不同浓度蔗糖溶液预处理卵子后的发育情况(昆明小鼠MII卵子)
各组比较无显著差异(p＞0.05)
实施例7.两种玻璃化冷冻方法对卵子发育潜能的影响
传统法玻璃化冷冻以目前最广泛使用的ES为7.5％(V/V)EG+7.5％(V/V)DMSO、VS为15％(V/V)EG+15％(V/V)DMSO+0.5mol/L蔗糖、载体为Cryotop为例，比较本发明所述的蔗糖皱缩法玻璃化冷冻方案对卵子发育潜能的影响。结果显示，与新鲜对照组相比，两种方案冷冻后，昆明小鼠卵子的发育潜能均显著降低，但本发明所述方案冷冻卵子的存活率和发育潜能(2细胞数率和囊胚形成率)均显著优于传统方案(表3)。
表3昆明小鼠MII卵两种玻璃化冷冻方法的结果比较
a，b，c两两比较有显著差异(p＜0.05)
实施例8不同熟练程度的操作者用本发明所述方案冷冻卵子均获得了稳定的高存活率
不同熟练程度的操作分别用本发明公布的蔗糖皱缩法预处理玻璃化方案和传统玻璃化方案(同实施例5)冷冻体外培养成熟的人MⅡ卵子，比较复苏后0h和24h的存活率。结果显示(表4)：1，同一个操作者本发明所述方案的0h和24h存活率均显著高于传统方案；2，不同熟练程度的操作者用本发明所述方案冷冻人MⅡ卵子均获得了稳定的高存活率，非常熟练者、基本掌握者和卵子冷冻初学者的0h和24h存活率分别为100％、100％、98.3％和100％、100％、98.3％，三组之间无差异；3，不同熟练程度的操作者用传统方案冷冻人MⅡ卵子时，存活率有显著差异，卵子冷冻的初学者(5年以上工作经历的中高级胚胎学家，只是没有卵子冷冻经验)仅获得56％的存活率。尽管无统计学差异，但传统方案中基本掌握者的存活率与非常熟练者相比仍有较大的降低趋势(80％vs 90％)。由此可见，本发明所述方案在冷冻人卵时结果稳定，操作者无需接受长时间、大样本量的技术培训即可开展该技术。
表4不同操作者两种方案冷冻卵子的存活率(体外培养成熟的人MII卵子)
a vs b p＜0.05，＊vs#p＜0·05
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液，其特征在于，所述序贯玻璃化冷冻液包括皱缩液、平衡液和玻璃化液，所述皱缩液为使细胞脱水的非渗透性保护剂。
2.根据权利要求1所述的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液，其特征在于，所述皱缩液为0.01mol/L-1.0mol/L蔗糖和/或海藻糖溶液。
3.根据权利要求2所述的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液，其特征在于，所述皱缩液为0.1mol/L-0.5mol/L蔗糖和/或海藻糖溶液。
4.根据权利要求3所述的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液，其特征在于，所述皱缩液为0.1mol/L-0.2mol/L蔗糖和/或海藻糖溶液。
5.根据权利要求1所述的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液，其特征在于，所述平衡液为5％-10％EG+5％-10％DMSO，所述玻璃化液为10％-20％EG+10％-20％DMSO+0.01mol/L-1.0mol/L蔗糖和/或海藻糖。
6.根据权利要求5所述的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液，其特征在于，所述平衡液为7.5％EG+7.5％DMSO，所述玻璃化液为15％EG+15％DMSO+0.5mol/L蔗糖和/或海藻糖。
7.权利要求1所述的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液使用方法，其特征在于，将细胞分别经皱缩液作用30秒-5分钟、经平衡液作用1分钟-15分钟和经玻璃化液作用30秒-180秒后，装载于玻璃化冷冻载体后投入液氮。
8.根据权利要求7所述的卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液使用方法，其特征在于，将细胞分别经皱缩液作用1分钟-2分钟、经平衡液作用8分钟-12分钟和经玻璃化液作用60秒-120秒后，装载于玻璃化冷冻载体后投入液氮。
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