CN115777696A - 一种玻璃化冷冻解冻液套装 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种玻璃化冷冻解冻液套装，包括冷冻液、平衡液、解冻液、稀释液、清洗液，解冻液包括羟丙基纤维素、脂肪酸补充剂、蔗糖、基础培养基。本发明提供的玻璃化冷冻解冻液套装，具有低粘度、低密度、易消泡等优点，并且能够维持卵子/胚胎细胞脂膜中脂质含量，且冷冻过程中能够促进渗透性冷冻保护剂进入细胞内，同时在解冻过程中可以提高卵子/胚胎解冻后存活率，改善卵子/胚胎后续的发育情况。
Description
技术领域
本发明属于生物组织低温保存领域，涉及辅助生殖流程中细胞玻璃化冷冻技术，具体涉及一种玻璃化冷冻解冻液套装。
背景技术
卵子/胚胎低温保存是重要的辅助生殖技术之一，通过对生育力需要保存的对象，将其卵子低温储存并在有需求时对其复苏保证卵子活力。辅助生殖过程中，主要采用玻璃化冷冻技术对卵子/胚胎细胞进行保存，该技术的基本原理是：利用高浓度的冷冻保护剂，使渗透性冷冻保护剂充分进入细胞中，非渗透性冷冻保护剂在卵子外部促进卵子脱水，之后将卵子投入液氮，随着温度极速下降，冷冻保护剂凝固成“玻璃态”，从而越过冰点，防止冰晶形成损害胚胎的结构功能。在极高的冷冻速率下，样本从液态直接转变为无固定形状的玻璃态的过程。
目前，通用的玻璃化冷冻解冻液包含的成分包括：基础培养基（用于提供细胞生长所需的能量物质和无机离子）、渗透性冷冻保护剂（渗透入细胞，将细胞内的水置换出来）、非渗透性冷冻保护剂（在细胞外部，促进细胞的脱水）、白蛋白（为细胞生长提供大分子支持，如：生长因子、脂质等），目前玻璃化冷冻技术已经广泛应用于临床，但仍旧存在不足，包括：1、在产品易用性上：市面上大部分产品液体粘度大，由于含有高浓度的蛋白成分，表面活性低，操作过程中易起泡，不利于显微镜下观察；2、在产品性能上：玻璃化冷冻过程中的渗透性冷冻保护剂为脂溶性成分，卵子经玻璃化后脂质含量降低，细胞膜的磷脂双分子层受损伤。
发明内容
为了解决玻璃化冷冻解冻液粘度大、易于起泡、细胞膜的磷脂双分子层易受损等问题，本发明提供了一种玻璃化冷冻解冻液套装，其包含的冷冻液和解冻液具有液体粘度、密度和表面张力低的特点，能够促进渗透性冷冻保护剂进入细胞内，同时在解冻过程中可以提高细胞解冻后存活率和发育情况。
实现发明目的的技术方案如下：一种玻璃化冷冻解冻液套装，包括平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液，解冻液包括羟丙基纤维素、脂肪酸补充剂、蔗糖、基础培养基，冷冻液包括羟丙基纤维素、基础培养基、乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖。
在一个实施例中，上述冷冻液还包括脂肪酸补充剂。
在一个实施例中，上述玻璃化冷冻解冻液套装中，解冻液和冷冻液中脂肪酸补充剂的种类相同，均包括不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸中任意一种或两种。
优选地，不饱和脂肪酸包括花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈油酸中任意一种或几种。
优选地，饱和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸中任意一种或几种。
在一个改进的实施例中，上述解冻液中脂肪酸补充剂的加入量为解冻液体积的0.5%~1.5%。
优选地，解冻液中所述脂肪酸补充剂的加入量为解冻液体积的1.0%。
在一个实施例中，上述玻璃化冷冻解冻液套装中，解冻液和冷冻液中羟丙基纤维素的加入量相同，且为0.06~0.12mg/mL。
在一个改进的实施例中，上述平衡液、稀释液、清洗液中均包括羟丙基纤维素，稀释液、清洗液中均包括脂肪酸添加剂。
优选的，所述平衡液、所述稀释液、所述清洗液中羟丙基纤维素加入量为0.06~0.12mg/mL，所述稀释液、所述清洗液中脂肪酸添加剂的加入量为各组分体积的0.5%~1.5%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的玻璃化冷冻解冻液套装，具有低粘度、低密度、易消泡等优点，其能够维持细胞脂膜中脂质含量的能力，且冷冻过程中能够促进渗透性冷冻保护剂进入细胞内，同时在解冻过程中可以提高细胞解冻后存活率，改善细胞后续的发育情况。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为具体实施方式中卵子经本发明玻璃化冷冻解冻液套装处理后的脂质染色示意图；
图2为具体实施方式中卵子经表1中现有的玻璃化冷冻解冻液套装处理后的脂质染色示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
现有玻璃化冷冻解冻液套装中，包括平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液1、清洗液2，参见下表所示，为现有玻璃化冷冻解冻液套装中各组分的组成及功能。
表1：现有玻璃化冷冻解冻液套装：
上述玻璃化冷冻解冻液套装在使用时，一方面由于各组分的密度高和粘度大，使得细胞在各组分中往往漂浮在液滴表面，长久无法下落，导致细胞无法被平衡液充分包裹，细胞周围压力不均一，冷冻保护剂的渗透效果变差；另一方面，各组分中使用了高浓度的人血清白蛋白（如添加量为12mg/mL），导致极易起泡，在操作过程中由于需要用毛细管反复吹吸胚胎，会造成产生大量气泡，在显微镜下容易干扰细胞观察；第三方面，在冷冻过程中，其渗透性冷冻保护剂为脂溶性成分，细胞经玻璃化后脂质含量降低，且细胞膜的磷脂双分子层受损伤。
针对上述问题，本发明提供了一种玻璃化冷冻解冻液套装，冷冻解冻液套装主要对其各组分中的成分及各成分的含量进行改进，解决易起泡及细胞膜受损的问题，冷冻解冻液套装包括解冻液、冷冻液、平衡液、稀释液、清洗液，以下通过具体的实施例对本发明的冷冻液套装进行说明。
实施例1：
本实施例提供了一种玻璃化冷冻解冻液套装，包括平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液，本实施例的玻璃化冷冻解冻液套装中各组分及其成分及功能参见下表2所示。
表2：实施例1中玻璃化冷冻解冻液套装：
本实施例中，平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液（包括清洗液1和清洗液2）中使用了羟丙基纤维素，羟丙基纤维素能够降低各液体的密度和黏度，使得细胞可以快速下落，且操作阻力更小，同时能够提高各液体的表面活性，使得液体消泡更加迅速，进而不会妨碍显微镜下对细胞的观察。
可选的，上述玻璃化冷冻解冻液套装中，平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液中羟丙基纤维素的加入量为0.06~0.12mg/mL。
本实施例中，解冻液、稀释液、清洗液（包括清洗液1和清洗液2）中使用了脂肪酸补充剂，脂肪酸补充剂能够有效的保护细胞的磷脂双分子层，避免细胞膜脂质含量降低，促进细胞解冻后存活率和发育情况。
可选的，在同一个玻璃化冷冻解冻液套装中，各组分中使用的脂肪酸补充剂的种类相同，其可以选用不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸中任意一种或两种。
可选的，上述不饱和脂肪酸包括花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈油酸中任意一种或几种。饱和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸中任意一种或几种。
可选的，同一个玻璃化冷冻解冻液套装中，上述各组分中脂肪酸补充剂的加入量为各组分体积的0.5%~1.5%。优选地，脂肪酸补充剂的加入量为各组分体积的1.0%。
实施例2：
本实施例提供了一种玻璃化冷冻解冻液套装，包括平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液，本实施例的玻璃化冷冻解冻液套装中各组分及其成分及功能参见下表3所示。
表3：实施例2中玻璃化冷冻解冻液套装：
本实施例中，平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液（包括清洗液1和清洗液2）中使用了羟丙基纤维素，羟丙基纤维素能够降低各液体的密度和黏度，使得细胞可以快速下落，且操作阻力更小，同时能够提高各液体的表面活性，使得液体消泡更加迅速，进而不会妨碍显微镜下对细胞的观察。
可选的，上述玻璃化冷冻解冻液套装中，平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液中羟丙基纤维素的加入量为0.06~0.12mg/mL。
本实施例中，冷冻液、解冻液、稀释液、清洗液（包括清洗液1和清洗液2）中使用了脂肪酸补充剂，脂肪酸补充剂能够有效的保护细胞的磷脂双分子层，避免细胞膜脂质含量降低，促进细胞解冻后存活率和发育情况。本实施例与实施例1的区别在于，本实施例的冷冻液中也加入了脂肪酸补充剂，用以对细胞进行保护。
可选的，在同一个玻璃化冷冻解冻液套装中，各组分中使用的脂肪酸补充剂的种类相同，其可以选用不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸中任意一种或两种。
可选的，上述不饱和脂肪酸包括花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈油酸中任意一种或几种。饱和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸中任意一种或几种。
可选的，同一个玻璃化冷冻解冻液套装中，上述各组分中脂肪酸补充剂的加入量为各组分体积的0.5%~1.5%。优选地，脂肪酸补充剂的加入量为各组分体积的1.0%。
上述实施例1和实施例2的玻璃化冷冻解冻液套装中使用羟丙基纤维素和脂肪酸补充剂的原理是：
首先，冷冻解冻液套装内各组件中羟丙基纤维素的添加量仅为0.06~0.12mg/mL，其可以大大降低液体密度和粘度，使得细胞能够完全的包裹在液体内，使冷冻保护剂可以逐渐的进入细胞内或从细胞内迁出；同时羟丙基纤维素具有中度表面活性，其与人血白蛋白相比不易起泡，即使产生气泡也能快速消泡，其可以使得液体的表面张力降低，使得在实际操作过程中避免毛细管反复吹吸导致的密集起泡，方便显微镜观察。
其次，在使用渗透性冷冻保护剂（二甲基亚砜、乙二醇）时，其可能会导致细胞中部分有效成分缺失的问题，因此在各组分中加入了脂肪酸补充剂，其可以缓解渗透性冷冻保护剂对细胞脂膜的影响，防止冷冻后细胞的脂质含量的降低，保证细胞后续的发育能力。
上述玻璃化冷冻解冻液套装可以对各种细胞，例如卵子细胞、胚胎细胞、普通细胞等各种细胞进行冷冻，本具体实施方式以表1中现有玻璃化冷冻解冻液套装，和下表4中所示的玻璃化冷冻解冻液套装的组分及配比，以及表5中脂肪酸添加剂的成分及配比，对卵子细胞的冷冻及解冻进行举例说明。
在此需要说明的是，表4中玻璃化冷冻解冻液套的组分及配比和表5中脂肪酸添加剂的成分及配比，只是对玻璃化冷冻解冻液套装中各组分进行举例说明，并不是对其配比进行限定。
表4：玻璃化冷冻解冻液套的组分及配比：
注：上述部分组分中由于蔗糖为固体，其难以采用体积衡量，但是其溶于液体后会占据一定体积，因此部分组分的总体积不为100%。
表5：脂肪酸添加剂的组分及配比：
卵子细胞的冷冻及解冻过程如下：
第一步、卵子细胞的玻璃化冷冻
在培养皿做一个100 uL的平衡液液滴，采用毛细管将卵子放在平衡液表面的中央部分；卵子会在30 s内下沉，观察到卵子脱水收缩然后又逐渐恢复原本体积的过程，平衡时间为12 min；平衡时间剩余1 min时，用移液器在皿盖上做两个100 uL的冷冻液液滴（冷冻液滴1、冷冻液滴2）。
平衡操作结束后，将平衡液中的卵子吸引至吸管前端，然后移动至冷冻液1液滴表面的中央；计时25 s，在冷冻液滴1底部不断轻柔吹吸卵子；然后将卵子放入冷冻液滴2中，计时25 s，在冷冻液滴2底部不断轻柔吹吸卵子；用毛细管将含有卵子的液滴放置在冷冻载杆的载片上，迅速投入液氮中低温保存，完成卵子细胞的玻璃化冷冻过程。
步骤二、卵子玻璃化解冻：
在即将解冻操作前，从37℃培养箱中取出预热好的解冻液，在准备好的35 mm小皿中加入1 mL的解冻液；再取3个35 mm小皿分别加入平衡至室温的稀释液、清洗液1、清洗液2；
迅速将载杆的载片端倒扣浸入预热质37℃的解冻液中，放置1 min；
时间到后用巴斯德吸管将卵子吸出，将吸出的卵子打入稀释液底部中心，保持3min；
用吸管将卵子吸出，打入清洗液1的底部，放置5 min；然后用吸管将卵子吸出，打入清洗液2的底部，放置5 min；时间结束后，取出卵子放入m16培养基进行后续培养，记录卵子发育数据；
取另一部分经过解冻的卵子采用尼罗红进行脂质染色，并在荧光显微镜下拍照观察，参见图1和图2所示。
参见下表6和表7所示，为卵子的发育情况及平衡液和冷冻液物理性能参数。
表6：卵子发育情况：
表7：平衡液和冷冻液物理性能参数：
分析：从表6的卵子发育情况可以看出，采用本发明的冷冻解冻液套装进行冷冻和解冻的卵子后续囊胚发育情况高于表1中玻璃化冷冻解冻液套装进行冷冻解冻的卵子；通过对两种套装中平衡液、冷冻液的物理性能参数进行测量可知，本发明的玻璃化冷冻解冻液套装中的平衡液和冷冻液的密度、粘度、表面张力均低于表1中玻璃化冷冻解冻液套装的平衡液和冷冻液，这一特性能够改善玻璃化冷冻解冻液套装在冷冻过程中的操作便利性；除此之外在对不同处理的卵子进行冷冻后，可以发现图1所示卵子的脂质含量（强橘红色荧光染色部分）高于图2所示卵子，说明本发明能够在玻璃化冷冻解冻过程中保护卵子的磷脂双分子层，维持细胞膜的脂质含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
此外，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种玻璃化冷冻解冻液套装，包括冷冻液、平衡液、解冻液、稀释液、清洗液，其特征在于：所述解冻液包括羟丙基纤维素、脂肪酸补充剂、蔗糖、基础培养基；所述冷冻液包括羟丙基纤维素、基础培养基、蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：所述冷冻液还包括脂肪酸补充剂。
3.根据权利要求1或2所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：玻璃化冷冻解冻液套装中，所述解冻液和所述冷冻液中所述脂肪酸补充剂的种类相同，均包括不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸中任意一种或两种。
4.根据权利要求3所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：所述不饱和脂肪酸包括花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈油酸中任意一种或几种。
5.根据权利要求3所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：所述饱和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸中任意一种或几种。
6.根据权利要求3所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：所述解冻液中所述脂肪酸补充剂的加入量为所述解冻液体积的0.5%~1.5%。
7.根据权利要求6所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：所述解冻液中所述脂肪酸补充剂的加入量为所述解冻液体积的1.0%。
8.根据权利要求1或2所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：玻璃化冷冻解冻液套装中，所述解冻液和所述冷冻液中所述羟丙基纤维素的加入量相同，且为0.06~0.12mg/mL。
9.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：所述平衡液、所述稀释液、所述清洗液中均包括羟丙基纤维素，所述稀释液、所述清洗液中均包括脂肪酸添加剂。
10.根据权利要求9所述的玻璃化冷冻解冻液套装，其特征在于：所述平衡液、所述稀释液、所述清洗液中羟丙基纤维素加入量为0.06~0.12mg/mL，所述稀释液、所述清洗液中脂肪酸添加剂的加入量为各组分体积的0.5%~1.5%。
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