CN110432259B

CN110432259B - 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用

Info

Publication number: CN110432259B
Application number: CN201910792520.3A
Authority: CN
Inventors: 窦蒙家; 饶伟
Original assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN110432259A

Abstract

本发明涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用。所述冷冻保护液包括：L‑脯氨酸和海藻糖，所述L‑脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4～10:1。本发明所提供的细胞冻存液采用生物相容性更好的L‑脯氨酸和海藻糖，在使用时可以直接将冻存管保存于液氮中，节省大量时间，同时可以保证较高的细胞复苏率，特别是红细胞，可以达到80～90％；本发明细胞冻存液冻存后的细胞形态结构和生理功能维持稳定，细胞膜上的各功能性蛋白活性保持不变。

Description

一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用。

背景技术

细胞冻存是现有生物学领域的一项常规技术，在购买的细胞经过传代后，一般需要将其中的一部分冻存起来，以作备用，可以用来重复实验，也可以在需要时复苏细胞，一部分拿来实验，另一部分继续传代冻存，是实验室的一种资源。同时也有很多实验在构建特定的细胞株后需要冻存一部分，以便重复使用。细胞在冻存时大量水分从细胞器中渗出，在低温条件下形成冰晶，从而对细胞本身造成损害。

现有技术为了克服细胞在低温状态下易形成冰晶的缺陷，在细胞冻存液中使用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，提高细胞膜对水的透过性，细胞在低温条件下，部分水分渗出，形成的冰晶较少；同时，细胞在冻存时需要采用“慢冻速融”的方法，以便于细胞内的水分可以充分地渗出，避免形成较大的冰晶。但是，现有冻存方法仍存在着一定的缺陷，以此方法冻存的细胞难免在结构和功能方面出现损伤，在复苏时，往往一部分细胞仍会死亡，而存活下来的细胞有时也需培养一段时间后恢复状态和活性。

而对于某些较为脆弱的细胞，由于其本身特殊的性质，在其冻存过程中细胞冻存液和冻存方法的选择更为重要，例如红细胞，红细胞目前被广泛用于外科手术补充失血和治疗贫血等疾病中。目前各大血站通常采用ACD，CPD，CPDA-1保存液将血液保存在4℃下，虽然能够基本保证一般情况下的临床用血需求，但是这种传统的保存方法保存时间短，通常可以保存3周，运输困难且受气温影响比较大，对于紧急情况下的大量用血以及偏远地区的用血需求就难以保障。此外，目前有采用甘油低温冷冻保存方法，能够保存红细胞长达10年之久，但是由于需要高浓度的甘油来保障红细胞经历降温及升温过程后仍然存活，所以在复苏红细胞后需要一系列复杂的耗时耗力的去甘油化过程，红细胞才能被用于输注。

发明内容

本发明提供一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用，用以解决现有技术中细胞冻存步骤繁琐，冻存后细胞结构和功能难以保持的问题。

第一方面，本发明提供一种冷冻保护液，包括：L-脯氨酸和海藻糖，所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4～10:1。

L-脯氨酸可以渗透到细胞内，减少细胞酸性，调整细胞的氧化还原势能，稳定蛋白质及其他生物大分子，海藻糖的性质十分稳定，可以在细胞膜表面形成保护膜，有效保持蛋白质分子不变形，维持细胞的生命特征和生物过程。本发明将此两者进行搭配，并限定其浓度使得其制成的冻存液效果在很大程度上得到提升，在冻存细胞时减少形成冰晶的数量和大小，可以不用常规的“慢冻”过程，直接置于液氮中保存也可以保持较高的细胞存活率。

进一步地，所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩尔比为4～8:1。

进一步地，所述L-脯氨酸和所述海藻糖在细胞冻存液中终浓度为：L-脯氨酸1～2mol/L，海藻糖0.2～0.3mol/L。

第二方面，本发明提供一种细胞冻存液，包括上述冷冻保护液和基础液。

进一步地，所述基础液为PBS、0.9％NaCl、1×DMEM basic和杜氏磷酸缓冲液中的一种或多种，优选为杜氏磷酸缓冲液。

基础液在冻存液中起到维持细胞的正常生理活性的作用，合适的基础液可以使得复苏后的细胞仍能保持较好的生物活性，特别是杜氏磷酸缓冲液，本发明通过电子显微镜观察发现，以其为基础液和本发明的冻存保护液所配置的细胞冻存液，冻存的细胞在复苏前后细胞形态得以更好地保持，其细胞膜上的Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺/Mg²⁺-ATP酶的活力也得以维持。

进一步地，所述细胞冻存液为红细胞冻存液。

相较于其他细胞，红细胞在形态上更小且更加脆弱，其冻存条件更加苛刻，一般采用甘油作为细胞冻存液，具有较好的冻存效率，然而甘油生物活性差，在解冻时需要使用不同浓度的甘油进行梯度洗脱，才能尽可能地去除甘油，方便红细胞的输注，而本发明的细胞冻存液具有较好的生物相容性，在解冻时直接37℃水浴复温后即可使用，同时可以保证较高的红细胞存活率，达到90％。

第三方面，本发明提供一种细胞冻存方法，采用上述细胞冻存液冻存细胞。

进一步地，具体步骤为：将所述细胞与所述细胞冻存液混合后直接置于低于-196℃条件下保存。

进一步地，混合后所述细胞体积为总体积的15％～25％。

在本发明一个优选实施方式中，细胞冻存方法如下：

(1)将L-脯氨酸和海藻糖用基础液杜氏磷酸盐缓冲液稀释成1～2mol/L和0.2～0.3mol/L，制成细胞冻存液；

(2)室温下将红细胞移入装有细胞冻存液的冻存管中，红细胞体积占总体积的15％～25％，后直接将冻存管置于液氮中进行保存。

进一步地，细胞冻存液在制成后在4℃条件下平衡10min。

进一步地，解冻时将冻存管从液氮中取出后37℃水浴，完成解冻过程。

本发明涉及一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用，具有如下有益效果：

(1)本发明冻存速度快，将细胞和细胞冻存液混匀后即可置于液氮中保存，无需常规的慢冻过程，特别是红细胞，可以保持80％～90％的细胞存活率。

(2)冻存后的细胞可以维持良好的形态结构和功能状态，细胞膜上的各类功能性蛋白活性不发生改变。

(3)在用于红细胞时，无需传统甘油冻存法的繁琐步骤和设备，水浴即可复苏红细胞。

附图说明

图1为本发明实验例2提供的电子显微镜观察下的冻存前后红细胞形态结构对比图，其中，A图为冻存前红细胞扫描电子显微镜图，B图为冻存后红细胞扫描电子显微镜图；

图2为本发明实验例2提供的冻存前后红细胞渗透脆性变化示意图；

图3为本发明实验例2提供的冻存前后红细胞细胞膜上Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺/Mg²⁺-ATP酶的活力测试结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种细胞冻存液，制备方法如下：

用1×杜氏磷酸缓冲液稀释L-脯氨酸和海藻糖制备细胞冻存液，其中，L-脯氨酸浓度为1.2mol/L，海藻糖浓度为0.2mol/L；制备完成后将细胞冻存液在4℃下平衡10分钟。

实施例2

本实施例提供一种细胞冻存液，制备方法同实施例1，区别在于：

其中，L-脯氨酸浓度为2mol/L，海藻糖浓度为0.2mol/L。

实施例3

其中，L-脯氨酸浓度为1.2mol/L，海藻糖浓度为0.3mol/L。

实施例4

本实施例提供一种细胞冻存液，制备方法同实施例1，区别在于：基础液选用1×PBS。

实施例5

本实施例提供一种细胞冻存液，制备方法同实施例1，区别在于：基础液选用0.9％NaCl。

对比例1

本对比例提供一种细胞冻存液，成分如下：

10％甘油、1.5％甘露醇以及0.65％NaCl。

对比例2

本对比例提供一种细胞冻存液，制备方法同实施例1，区别在于：将L-脯氨酸替换为D-脯氨酸。

对比例3

本对比例提供一种细胞冻存液，制备方法同实施例1，区别在于：将L-脯氨酸替换为HES。

对比例4

本对比例提供一种细胞冻存液，制备方法同实施例1，区别在于：将海藻糖替换为葡萄糖。

对比例5

本对比例提出一种细胞冻存液，制备方法同实施例1，区别在于：

其中，L-脯氨酸浓度为0.25mol/L，海藻糖浓度为0.9mol/L。

实验例1

本实验例对上述实施例和对比例中的细胞冻存液通过如下方法进行冻存效果测试：

将新鲜的无菌脱纤维绵羊血用缓冲液离心(以1000转/分钟离心5分钟)洗涤1～2遍，去除其中坏损的红细胞；

将洗涤后的红细胞以20％的体积比加入1mL细胞冻存液中，后移入1.2mL冻存管内；

将冻存管直接浸入液氮中进行冻存。

在冻存7天后，将冻存管中液氮中取出，浸入37℃水浴中，振荡加强对流换热，约1min完成解冻程序。

将解冻后的红细胞收集离心后，利用酶标仪测试上清液在450nm处的吸光度，比色法测试溶血率，并对其聚集程度进行检测，得到如下表结果：

表1红细胞溶血率对比结果

实验例2

本实验例对使用实施例1的冻存液冻存的红细胞在冻存前后细胞形态、渗透脆性和细胞膜上的Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺/Mg²⁺-ATP酶活性进行测试，具体方法如下：

取实验例1中解冻后的红细胞收集离心后，在电子显微镜下观察其形态，如图1所示，红细胞维持良好的中间凹陷的盘状形态，

通过将解冻后的红细胞和未经冻存的红细胞加到一系列不同浓度低渗盐水中以测试红细胞的渗透脆性进行测试得到如图2所示结果：当复苏后的红细胞在0.60％～0.65％NaCl中的时候发生50％溶血率，和冻存前红细胞的渗透脆性相比无明显改变。

通过酶标定法对细胞膜上Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺/Mg²⁺-ATP酶进行活力测试得到如图3所示结果：复苏后的红细胞的细胞膜上的Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺/Mg²⁺-ATP酶的活性分别为1.56±0.36μmol Pi^-1(10⁹RBCs)^-1hour^-1，1.52±0.26μmol Pi^-1(10⁹RBCs)^-1hour^-1，与正常红细胞的细胞膜上酶活性基本一致。

实验例3

本实验例对使用实施例1的冻存液冻存的3T3在冻存前后的细胞存活率进行测试，区别在于基础液使用1×DMEM basic，测试具体步骤如下：

取3T3细胞，将1×10⁶个3T3细胞加入1mL细胞冻存液中，后移入1.2mL冻存管内；

将冻存管直接浸入液氮中进行冻存。

将解冻后的3T3细胞收集离心后，将细胞培养1天后，利用CCK8试剂及酶标仪，测试在450nm处的吸光度，获得细胞活率。

结果显示，3T3细胞的存活率达到53％。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种红细胞冻存液，其特征在于，由冷冻保护液和基础液组成；所述冷冻保护液由L-脯氨酸和海藻糖组成，所述L-脯氨酸在细胞冻存液中终浓度为1～2mol/L，所述海藻糖在细胞冻存液中终浓度为0.2～0.3mol/L。

2.根据权利要求1所述的红细胞冻存液，其特征在于，所述基础液为PBS、0.9％NaCl、1×DMEM basic和杜氏磷酸缓冲液中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的红细胞冻存液，其特征在于，所述基础液为杜氏磷酸缓冲液。

4.权利要求1-3任一项所述细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括：使用所述基础液稀释L-脯氨酸和海藻糖至合适浓度。

5.一种细胞冻存方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的细胞冻存液冻存细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞冻存方法，其特征在于，具体步骤为：将所述细胞与所述细胞冻存液混合后直接置于低于-196℃的条件下保存。