CN114190366B

CN114190366B - 冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用

Info

Publication number: CN114190366B
Application number: CN202111644153.6A
Authority: CN
Inventors: 刘红; 吕健勇; 赵立山; 卢思彤
Original assignee: Songshan Lake Materials Laboratory
Current assignee: Songshan Lake Materials Laboratory
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: CN114190366A

Abstract

本发明公开了一种人正常肝细胞冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用，本发明冻存剂组份包括有L‑谷氨酸、海藻酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、PBS缓冲液和注射用水。本发明冻存剂的配方以L‑谷氨酸、海藻酸钠和三羟甲基氨基甲烷等控冰材料为主要成分，可以有效降低冷冻保存过程中冰晶对L‑02细胞造成的损伤。相比于传统冻存剂，本发明不包含二甲基亚砜、乙二醇等毒性分子和血清等价格昂贵组分，并且复苏后，L‑02细胞的存活率、增殖能力以及细胞形态均优于现有的含DMSO冻存保护剂。本发明的冷冻保存液组分绿色无毒、来源方便、成本低廉，是一种可靠的人正常肝细胞冷冻保存手段。

Description

冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用

技术领域

本发明涉及低温冻存技术领域，特别涉及一种人正常肝细胞冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用。

背景技术

无论是肝细胞移植还是肝细胞相关医学研究均需要大量的肝细胞。L-02细胞是上世纪80年代由国内学者自行建系的肝细胞系，具有体外培养容易、来源方便的优点，目前已被广泛应用于肝细胞相关医学研究。

在L-02细胞的科学研究和实际应用中，经常需要将细胞冷冻保存以满足长途运输或长期保存的需求。低温保存过程中不可控制的结冰会对细胞造成严重的机械损伤，从而直接造成细胞直接失活。因此冻存液是L-02细胞冻存必须使用的一种保护剂。

传统的冷冻保存剂通常含有DMSO、乙二醇等小分子物质，这些小分子物质是渗透性的，可透过细胞膜进入细胞内部，增强细胞内水的玻璃化能力，使细胞内水分在快速降温过程中直接进入玻璃态从而避免结冰。但DMSO具有细胞毒性，浓度越高对细胞危害越大，并且冻存后细胞状态也不佳；其次，含DMSO冻存液在复温过程中也会再次结冰和冰晶重结晶，目前常用的传统冷冻保存剂并不具有控制冰晶成核生长和抑制冰重结晶的效果，因此无法避免复温过程中的冰晶对细胞造成的损伤。因此，研发一种应用于人正常肝细胞的冷冻保存,具有抑制冰核形成、调控冰晶形貌和抑制冰晶重结晶的功能，有效降低冰晶对保存人正常肝细胞的机械损害的冻存液。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于，提供一种冻存液及其制备方法与在人正常肝细胞的应用。所述冻存液的配方合理，具有抑制冰核形成、调控冰晶形貌和抑制冰晶重结晶的功能，从而降低冰晶对保存样品的机械损害。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：

一种冻存液，其包括以下质量百分含量的组份：L-谷氨酸0.001％～0.01％、海藻酸钠0.001％～0.1％、三羟甲基氨基甲烷0.01％～0.04％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液2％～5％，余量为水,优选为注射用水。

一种冻存液的制备方法，其包括以下步骤：

(1)预备以下质量百分含量的组份：L-谷氨酸0.001％～0.01％、海藻酸钠0.001％～0.1％、三羟甲基氨基甲烷0.01％～0.4％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液2％～5％，余量为水；

(2)往所述水中先加入L-谷氨酸、海藻酸钠溶解，再加入三羟甲基氨基甲烷搅拌混合均匀，获得混合溶液；

(3)在混合溶液冷却至室温后，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节pH至6.2～8.2，并加入PBS缓冲液定容至预定体积，制得冻存液。

一种所述的冻存液在人正常肝细胞冷冻保存中的应用。具体应用步骤如下：

(S1)将人正常肝细胞加入所述的冻存剂中，采用移液器吹打混合均匀后获得含人正常肝细胞的冷冻保存液；

(S2)将含人正常肝细胞的冷冻保存液装入冻存管，然后放入程序降温盒，在室温平衡3～10min；

(S3)将程序降温盒放入-70～-90℃的环境中进行梯度降温，降温速率为1℃/min，超过6～8小时后转入液氮长期保存。

人正常肝细胞在液氮中冻存一段时间后，需要进行复苏并检测人正常肝细胞状态，其包括如下步骤：

1)人正常肝细胞复苏：提前将水浴锅预热至37℃，将冻存管从液氮中取出后迅速放入水浴锅，待其复苏(500μL复苏时间2min左右)；

2)人正常肝细胞计数测活率、回收率：吸出一小部分(50μL左右)细胞悬液进行离心前计数，其余加入至3mL提前预热的完全培养基中，离心(转速1000rpm,3min)，去除上清，500μL完全培养基重悬细胞沉淀；

3)人正常肝细胞增殖测定：

a)取2)中重悬的细胞悬液：细胞计数；

b)接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数(约4x10⁴cells/mL)，每孔200μL细胞悬液，同样的样本可做4个重复，然后放入37℃培养箱中培养；

c)加入CCK8：在细胞培养箱中分别培养24h、48h和72h后每孔加入20μLCCK8，加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀，然后放入细胞培养箱中孵育1h；

d)测定450nm吸光度：用酶标仪检测波长450nm的吸光度值。

本发明的有益效果为：本发明冻存剂的配方合理，所述L-谷氨酸、三羟甲基氨基甲烷可以通过氢键和疏水相互作用，在冰核形成后，特异性地吸附在冰晶晶面上，从而抑制了冰晶生长。并且上述成分在复温过程中，还可以吸附在冰晶界上，阻碍冰畴间水分子的扩散，从而抑制冰晶重结晶，保护细胞免受冻伤。海藻酸钠可以通过羟基和羧基水合部分自由水，降低可结冰水的比例。减少冻存中冰晶生成数量。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和PBS缓冲溶液可调节冻存液pH，使其维持在6.2～8.2之间。应用本发明冻存剂后，可以有效抑制冷冻保存过程中冰晶重结晶过程、调控冰晶形貌、降低冰晶生长速率，减小冰晶对人正常肝细胞(L-02)造成的损伤，同时可以很好的与细胞膜相互作用，增强其耐冰损害能力，使得人正常肝细胞(L-02)能够长期于液氮中保存。而且相对于传统冻存剂不包含DMSO等毒性分子和价格昂贵的血清等组分，不仅避免了DMSO对细胞的损害，还降低了生产成本，为人正常肝细胞在肝病医学研究领域的提供了强有力的支撑，利于广泛推广应用。

本发明提供的冻存剂的制备方法的步骤简单，易于实现，能快速制备出具有抑制结冰和冰晶重结晶、调控冰晶形貌等功能，从而降低冰晶对保存样品的机械损害。

下面结合附图与实施例，对本发明进一步说明。

附图说明

图1为PBS溶液对照组和本发明冻存液的冰晶重结晶实验结果。

图2为进口商品化冻存液和本发明冻存液的复苏后活率实验结果。

图3为进口商品化冻存液和本发明冻存液的复苏后回收率实验结果。

图4为L-02细胞经过进口商品化冻存液和本发明冻存液的冷冻保存后复苏后的增殖能力结果图。

图5为L-02细胞经过进口商品化冻存液和本发明冻存液冷冻保存复苏后培养24小时的细胞形态图。

具体实施方式

实施例1：本实施例以人正常肝细胞的冷冻保存和复苏为例进行说明，但不用来限制本发明的限制范围。

(一)冻存剂的制备：取90mL注射水放入置于4℃水浴的烧杯中，放入搅拌子，转速调节至500rpm；加入L-谷氨酸0.1g、海藻酸钠0.1g、三羟甲基氨基甲烷3g，搅拌10分钟；依次标准PBS缓冲液5mL、磷酸二氢钠0.3g和磷酸氢二钠0.7g，搅拌30分钟。

(二)人正常肝细胞细胞的冷冻保存：

(S1)10cm的培养皿(或者T75培养瓶)细胞培养生长至密度达到80％-90％时进行消化，加入2mL胰酶进行消化，4mL完全培养基(含10％的FBS)终止消化，收集细胞悬液；

(S2)将收集的细胞悬液离心(转速1000rpm，5min)，离心后能看到明显的细胞沉淀，去上清，加PBS重悬，取10μL重悬液加10μL AO/PI染料染色后用细胞计数仪计数(计数两次取平均值)；

(S3)计数得到细胞密度(xx个/mL)和细胞存活率(％)，根据细胞密度计算1x10⁶个细胞所需要细胞悬液体积(冻存密度为2x10⁶cells/mL，可以根据需求调整，建议冻存密度为10⁶cells/mL-10⁷cells/mL)；

(S4)离心管中加入1x10⁶个细胞所需要细胞悬液体积，离心(转速1000rpm,5min)后去上清，加入500μL冻存液重悬后转移至冻存管(冻存前抽样计数检测冻存管中的细胞数量和活率)；

(S5)冻存管放入程序降温盒(降温速率1℃/min)中室温平衡5min，放入-80℃超过8h之后转入液氮长期冻存。

(三)L-02细胞的复苏：L-02细胞在液氮中冻存10天后，进行复苏并观察细胞状态，其包括如下步骤：

1)人正常肝细胞复苏：提前将水浴锅预热至37℃，将冻存管从液氮中取出后迅速放入水浴锅，待其复苏(冻存液500μL复苏时间2min左右)；

2)人正常肝细胞计数测活率回收率：吸出一小部分(50μL左右)细胞悬液进行离心前计数，其余加入至3mL提前预热的完全培养基中，离心(转速1000rpm,3min)，去除上清，500μL完全培养基重悬细胞沉淀；

3)人正常肝细胞增殖测定：

a)取2)中重悬的细胞悬液：细胞计数；

b)接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数(约4x10⁴cells/mL)，每孔200uL细胞悬液，同样的样本可做4个重复，然后放入37℃培养箱中培养；

d)测定450nm吸光度：用酶标仪检测波长450nm的吸光度值。

参见图1，可以得知采用本发明冻存液形成的冰晶重结晶尺寸远小于PBS水溶液。

参见图2，可以得知采用本发明冻存液内用于L-O2细胞的冻存，细胞的最终复苏率达到94％，活细胞回收率达到96％，细胞获得率达到94％，均高于进口的含DMSO的商品化冻存液。

参见图3和图4，可以得知采用本发明冻存液用于L-O2细胞的冻存，维持了良好的细胞增殖能力。

参见图5，L-O2细胞经过新型冷冻保存剂10天的液氮冷冻保存后，形态没有改变，与新鲜未冻存的L-O2细胞对比没有明显差别。保存效果好，实现了L-O2细胞冷冻保存。

实施例2：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，冻存时的细胞密度为10⁴cells/mL、10⁵cells/mL、10⁶cells/mL、10⁷cells/mL。按实施例1提供的冻存液以及冻存方法冻存L-O2细胞，液氮中冻存10天后，进行复苏并检测细胞活率，结果见表1。

表1

结果表明，结果表明，试验组不同细胞浓度组的细胞成活率在10⁴cells/m1-10⁷cells/mL细胞浓度范围内，无显著性差异。

实施例3：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存剂包括以下质量百分含量的组份：L-谷氨酸0.003％、海藻酸钠0.002％、三羟甲基氨基甲烷0.04％、磷酸二氢钠0.2％、磷酸氢二钠0.5％、PBS缓冲液3％，余量为注射用水。

实施例4：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存剂包括以下质量百分含量的组份：L-谷氨酸0.008％、海藻酸钠0.002％、三羟甲基氨基甲烷0.02％、磷酸二氢钠0.4％、磷酸氢二钠0.2％、PBS缓冲液2％，余量为注射用水。

实施例5：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存剂包括以下质量百分含量的组份：L-谷氨酸0.005％、海藻酸钠0.006％、三羟甲基氨基甲烷0.04％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钠0.8％、PBS缓冲液4％，余量为注射用水。

实施例6：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存剂包括以下质量百分含量的组份：L-谷氨酸0.003％、海藻酸钠0.007％、三羟甲基氨基甲烷0.03％、磷酸二氢钠0.3％、磷酸氢二钠0.7％、PBS缓冲液2％，余量为注射用水。

上述实施例仅为本发明较好的实施方式，本发明不能一一列举出全部的实施方式，凡采用上述实施例之一的技术方案，或根据上述实施例所做的等同变化，均在本发明保护范围内。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制，采用与其相同或相似方法而得到的其它冷冻剂及其制备方法和应用，均在本发明保护范围内。

Claims

1.一种冻存液在人正常肝细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冻存液的制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的冻存液在人正常肝细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述的水为注射用水。

3.根据权利要求1所述的冻存液在人正常肝细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，应用步骤如下：

(S1)将人正常肝细胞加入所述的冻存液中，在混合均匀后获得含人正常肝细胞的冷冻保存液；

(S3)将程序降温盒放入-70～-90℃的环境中进行梯度降温，超过6～8小时后转入液氮长期保存。

4.根据权利要求3所述的冻存液在人正常肝细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述步骤(S1)采用移液器吹打混合均匀。

5.根据权利要求3所述的冻存液在人正常肝细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述步骤(S3)中的降温速率为1℃/min。