CN116897922B - 一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液，外泌体保存液由果胶和/或海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到，使用时，先将外泌体保存液加热制成胶体溶液，再加入新鲜外泌体，封存后可在常温条件下长期保存外泌体，保护液能够提高外泌体体系带电量，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化，保护外泌体的完整性，稳定性，使得外泌体能够长期保持其生物活性，并保持其内含物的稳定性。

Description

一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液。

背景技术

外泌体(exosomes)是一类大多数细胞分泌产生的纳米级胞外囊泡。外泌体中含有mRNA、miRNA、蛋白质和脂质等成分。2013年詹姆斯·罗斯曼、兰迪·谢克曼和托马斯·聚德霍夫因发现囊泡转运机制获得诺贝尔生理学或医学奖。作为一类重要的胞外囊泡，外泌体因其具有免疫调节、呈递抗原、参与细胞间信号转导以及用于疾病诊断和治疗等功能而受到广泛关注。在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。

现有的外泌体体外保存常采用低温保存，但是临床应用是在常温下使用的，这就导致在其保存、应用时分别需要增加降温、升温步骤，而且这种降温、升温必须非常缓慢，费时费事。为保证其活性，其保存时间应尽量控制在6小时之内，这个时间是非常紧张的，对距离稍长的运输是一个挑战。目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3至7天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。由此，如何有效地体外保持外泌体的稳定性，有效保持外泌体的完整性、理化性质仍有待开发。目前，外泌体保存液种类极少，并且其保存液保存效果不佳，容易造成外泌体在保存过程中结构被破坏，生物活性丧失，或内含物降解，影响对外泌体的后续检测、标记等下游的研究或应用。

胶体分散体系中的Zeta电位测定是一个重要的检测项目。Zeta电位的主要的用途之一就是研究胶体与电解质的相互作用。 Zeta电位(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。Zeta电位是用来表征胶体分散系稳定性的重要指标。运用新型的检测方法和成果来解决外泌体保存中的实际问题，为外泌体的稳定保存建立技术基础。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液。

本发明采用的技术方案是：一种提升外泌体稳定性的方法，由果胶和/或海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到外泌体保存液，将外泌体保存液加热处理制成胶体溶液，再将外泌体保存于冷却到室温的胶体溶液中，低温或常温保存。

优选地，外泌体保存液中包括果胶0.1-0.5%（w/w），和/或包括海藻酸钠0.1-0.5%（w/w）。

优选地，外泌体保存液由0.3%（w/w）果胶和/或0.5%（w/w）海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到。

优选地，将外泌体保存液置于60-80℃加热5-25min，形成胶体溶液。

优选地，取5 mL蛋白含量为250-300 μg/mL牛奶外泌体浓缩到150µL，加入等体积的外泌体保存液，保存。

一种外泌体保存液，通过磷酸盐缓冲液配置果胶和/或海藻酸钠得到外泌体保存液。

优选地，外泌体保存液中包括果胶0.1-0.5%（w/w），和/或包括海藻酸钠0.1-0.5%（w/w）。

本发明具有的优点和积极效果是：通过上述方法保存外泌体，能够在常温条件下长期保存外泌体，保护液能够提高外泌体体系带电量，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化，保护外泌体的完整性，稳定性，使得外泌体能够长期保持其生物活性，并保持其内含物的稳定性；常温的保存条件也避免了升温降温的步骤，操作简单，省时省力。

附图说明

图1为实验例牛奶外泌体表征图；

图2为样本1-9在常温条件下果胶和海藻酸钠对牛奶外泌体Zeta电位的影响结果；

图3为样本1-6在常温条件下的牛奶外泌体标记分子western blot结果图；PC：阳性对照；NC：阴性对照；

图4为样本7-9在常温条件下保存了28天的外泌体标记分子western blot结果图；

图5为样本7-9在常温条件下保存了28天的外泌体形态结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例做出说明。

本发明涉及一种外泌体提升稳定性的方法，具体为一种在常温状态下提升外泌体稳定性的保存方法。采用一种外泌体保存液，外泌体保存液由果胶和/或海藻酸钠与PBS缓冲液混合得到，先通过磷酸盐缓冲液配置果胶和/或海藻酸钠，得到外泌体保存液，在用于保存外泌体前，先将外泌体保存液通过加热制成胶体溶液，冷却到室温后加入外泌体即可常温保存。

通过添加果胶和海藻酸钠提升牛奶外泌体 Zeta 电位绝对值，使其在2～8℃或室温下仍可以长期保持形态结构和生物活性，且内含物稳定性较好。外泌体保存液中海藻酸钠的添加，对外泌体具有较好的保护作用，在低温条件下海藻酸钠能在外泌体表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持外泌体的生物活性；果胶本质上是一种线形的多糖聚合物，含有数百至约1000个脱水半乳糖醛酸残基，其相应的平均相对分子质量为50000-150000。果胶链很短，无法在水中形成连接在一起的长链，同时加热会使得果胶链两端携带负电荷，从而使它们之间互相排斥，形成粘稠的无味溶液。果胶的添加，果胶能显著提升经过热处理和未经过热处理的牛奶外泌体的Zeta电位绝对值，从而提高外泌体的稳定性；磷酸盐缓冲液与外泌体自然状态下的pH值、渗透压一致，具有维持外泌体渗透压、控制酸碱平衡的作用，同时磷酸盐缓冲溶液易与Ca²⁺离子、Mg²⁺离子以及重金属离子缔合生成沉淀，抑制外泌体内的生物化学反应以及多数酶的活性，进一步保护外泌体结构的完整性以及内含物的稳定性。因此外泌体保存液能长期保持外泌体的完整性、生物活性以及内含物稳定性。

本发明某些实施例中，先将PBS (pH=7.4)过0.22 µm膜除菌，再通过PBS配制果胶和/或海藻酸钠得到外泌体保存液，外泌体保存液中包括果胶0.1-0.5%，和/或包括海藻酸钠0.1-0.5%。使用外泌体保存液保存新鲜外泌体时，先通过加热将外泌体保存液制备成胶体溶液，具体可将外泌体保存液置于60-80℃加热5-25min，震荡混匀，形成胶体溶液；向冷却后的胶体溶液中加入新鲜外泌体后，即可用于常温状态下保存。根据储存条件，还可浓缩处理后储存。

本发明所设计的外泌体提升稳定性的储存方法适用于多种外泌体，尤其适合牛奶外泌体。相比细胞培养液来源的外泌体，牛奶外泌体具备诸多优势，比如产量高，成本低，此外，由于人类饮用牛奶的历史悠久，牛奶外泌体的毒性和免疫原性更是可以忽略不计。与其他类型外泌体比较，牛奶外泌体适于工业生产，因此在工业化过程中，其储存过程的稳定性需求就更加明显。选取经济易得的牛奶作为外泌体来源，并通过离子交换层析结合分子筛层析等工艺手段分离得到高纯度、高产量牛奶外泌体(milk exosome, MK-Exo)。通过上述方案将纯化后的牛奶外泌体与外泌体保存液混合，并添加有保存介质海藻酸钠/果胶添加剂，可提高牛奶外泌体在常温环境下的保存时间。使用海藻酸钠/果胶作为保护剂，成分简单，新鲜的外泌体使用海藻酸钠/果胶保护剂在较常温条件下进行保存，可以提高保存效果，保持外泌体的稳定性，提高体系带电量，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化。

下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

实施例1：新鲜牛奶外泌体的制备与表征

取含有外泌体的牛奶，先3000g-8000g离心，离心后取上清和/或过滤器除蛋白的方法去除沉淀蛋白，然后通过深层滤器进行深层过滤去除脂肪球，再经阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛层析，获得的流穿液为纯化后的外泌体溶液。具体如专利CN113444682A一种外泌体分离纯化方法所公开方法。通过离子交换层析结合分子筛层析等工艺手段分离得到高纯度、高产量牛奶外泌体，通过透射透射电镜、Western Blot、纳米流式、高效液相色谱分别表征牛奶外泌体的形态、外泌体标志物（CD9+、CD81+、TSG101+）、外泌体粒径分布和外泌体纯度，结果如图1和表1所示。

表1

实施例2：外泌体保存方法

将1x PBS溶液 (pH=7.4)过0.22 µm膜除菌，以下简称PBS溶液，使用PBS溶液配制得到含有0.1%(w/w)果胶、0.3%（w/w）果胶、0.5%（w/w）果胶、0.1%（w/w）海藻酸钠溶液、0.3%（w/w）海藻酸钠、0.5%（w/w）海藻酸钠溶液、0.3%（w/w）果胶及0.1%（w/w）海藻酸钠、0.3%（w/w）果胶及0.3%（w/w）海藻酸钠、0.3%（w/w）果胶及0.5%（w/w）海藻酸钠共9种溶液，依次命名为样本1-9。将上述溶液70℃水浴5min，震荡混匀，形成胶体溶液备用。

取6份5 mL实施例1制备得到的蛋白浓度为280 μg/mL牛奶外泌体样本，通过100kDa超滤管浓缩至150 µL，再分别与等体积的含有0.1%（w/w）果胶、0.3%（w/w）果胶、0.5%（w/w）果胶、0.1%（w/w）海藻酸钠、0.3%（w/w）海藻酸钠、0.5%（w/w）海藻酸钠溶液混合得样本1-6，常温保存。

取3份5 mL实施例1制备得到的蛋白含量浓度为280 μg/mL牛奶外泌体样本中，通过100 kDa超滤管浓缩至150 µL（浓缩33倍），再分别与等体积的含有0.3%（w/w）果胶及0.1%（w/w）海藻酸钠、0.3%（w/w）果胶及0.3%（w/w）海藻酸钠、0.3%（w/w）果胶及0.5%（w/w）海藻酸钠溶液混合得样本7-9，常温保存。实验组样本1-9见表2。

表2

实施例3：外泌体表征

将实施例2制备得到的样本分别进行如下的检测和表征。

3.1 果胶和海藻酸钠溶液包裹外泌体带电属性及带电量检测：

将实施例2制备得到的各个样品分别取25 µL，并用PBS缓冲液稀释到400 µL，分别采用Zeta电位分析仪布鲁克海文Zeta Pals检测样本的带电属性及带电量。结果如图2所示，在常温条件下，样本7-9 Zeta电位的绝对值大于30 mV，表明样本7-9的溶液体系可以使外泌体胶体溶液稳定。

将样本7-9存放一段时间，分别在第1天、第8天、第15天和第28天检测其Zeta电位值，结果如表3所示，随着室温保存时间的延长，除了样本7的Zeta电位绝对值略低于30mV外，样本8和9的Zeta电位值均大于30 mV，说明样本8和9对应的溶液体系可以有效的保持外泌体的稳定性。

表3

3.2外泌体表面分子标记物检测实验：

将实施例2中样本1-6，放置28天的样本7-9进行分子标记物检测。将1 μL PMSF加入到100 μL蛋白裂解液RIPA中, 取100 μL上述9个样本与100μl RIPA混合，4 ℃超声裂解15 min，12 000 ×g离心 10 min, 取上清。BCA法测定蛋白浓度。吸取10 μg总蛋白。半干电转将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭。 一抗CD9(1׃1 000)于4 ℃孵育过夜。1׃2500稀释二抗，室温孵育1 h，显影后保存图像。样本1-6显影结果如图3所示，样本7-9显影结果如图4所示， Western blot结果显示，样本1-6及常温条件下放置了28天的样本7-9均有特异性的外泌体表面分子标记蛋白表达。

3.3外泌体的形态检测：

分别取50μl存放了28天的样本7-9、用等体积4% 多聚甲醛固定15min，然后将固定后的样本滴加至铜网上，3min后用滤纸吸干，再加入10 μL 2%醋酸双氧铀室温染色1 min。染色干燥后，样品置于透射电镜下观察并拍照。结果如图5所示，能够看出，虽然经过28天常温储存，外泌体依旧保持了完整的、典型的杯托状”结构。

综上所述，外泌体保存于一定质量百分浓度的果胶和/或海藻酸钠溶液中，经过28天常温储存，外泌体依旧保持了完整的、典型的杯托状”结构，溶液Zeta电位的绝对值大于30 mV，可以稳定的保存外泌体。本研究为外泌体的储存提供了一个新的选择，便于外泌体早日走向临床应用。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (5)

1.一种提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：由果胶和海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到外泌体保存液，将外泌体保存液加热处理制成胶体溶液，再将外泌体保存于冷却到室温的胶体溶液中，浓缩后低温或常温保存；

外泌体保存液中果胶的w/w为0.1-0.5%，海藻酸钠的w/w为0.1-0.5%。

2.根据权利要求1所述的提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：外泌体保存液由w/w为0.3%的果胶和w/w为0.5%的海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到。

3.根据权利要求1所述的提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：将外泌体保存液置于60-80℃加热5-25min，形成胶体溶液。

4.根据权利要求1所述的提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：取5 mL蛋白含量为250-300 μg/mL牛奶外泌体浓缩到150µL，加入等体积的外泌体保存液，保存。

5.一种外泌体保存液，其特征在于：通过磷酸盐缓冲液配置果胶和海藻酸钠得到外泌体保存液，外泌体保存液中果胶的w/w为0.1-0.5%，海藻酸钠的w/w为0.1-0.5%。