CN109221088A

CN109221088A - 一种细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶、细胞凝胶、制备方法、使用方法及其应用

Info

Publication number: CN109221088A
Application number: CN201811161341.1A
Authority: CN
Inventors: 杨�远; 袁祥; 韩飞; 张中伟; 潘红伟
Original assignee: Chengdu Yuanshan Force Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Yuanshan Force Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2019-01-18

Abstract

本发明属于细胞保存和再生修复技术领域，公开了一种细胞低温保存液，主要由以下质量百分含量的组分组成：0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白、3％～7％低分子右旋糖苷、0.1～0.3％谷胱甘肽、0.5％～2％益多酚、3％～5％腺苷、0.5％～1％葡萄糖、0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％CaCl₂，余量为水。本发明提供了一种海藻酸钠凝胶，包括海藻酸钠、氯化钙、透明质酸和前述细胞低温保存液等，还提供了一种细胞凝胶及其制备方法，以及细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶和细胞凝胶的应用。本发明的优点在于，细胞低温保存液可在2～8℃下较长时间保持细胞活性，海藻酸钠凝胶可作为各种来源的细胞的临时短期保存材料和细胞组织工程的支架，细胞凝胶可作为医用湿性伤口敷料，用于软组织、难愈性伤口皮肤及粘膜创面损伤的修复。

Description

一种细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶、细胞凝胶、制备方法、使用方法及其应用

技术领域

本发明涉及细胞保存和再生修复技术领域，具体涉及一种细胞低温保存液、利用该细胞低温保存液制备的富含三维孔隙的海藻酸钠凝胶，还涉及利用该海藻酸钠凝胶制备的细胞凝胶，同时本发明还涉及到该细胞凝胶的制备方法和其中的细胞的分离活化方法，此外，本发明还涉及细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶和细胞凝胶应用。

背景技术

细胞广泛应用于科研和临床上，其中，细胞保存和运输是细胞应用中较为重要的部分。目前，细胞保存一般是将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验，这种方法的优点在于可保存的时间长。然而，这种保存方法存在以下问题：运输过程中细胞活性下降快，长时间运输后细胞的存活率很低，细胞大量死亡，直接影响后续的实验或临床效果；细胞复苏对操作要求高，不易活化；此外，大部分冻存液中需要添加DMSO等对组织细胞有毒性的物质，极大的限制了细胞产品的临床应用。因此，在临床医疗中，如何维持细胞活性是一项极大的挑战，在短时间内保存细胞时，往往使用生理盐水或者细胞培养基来维持细胞活性，然而细胞在生理盐水中活性降低速度非常快，在培养液中保存效果也不理想，一般为几小时。由于可保存时间短，受限较多，难以高效保存细胞生物活性，上述细胞保存方式不便于细胞的各种应用。由于细胞在低温保存液中缺乏天然细胞外结构和物质，易发生细胞膜膨胀；更多环境压力造成氧化损伤，生成大量脂质过氧化物，细胞保存液变酸；过多的生长因子和营养提高细胞基础代谢率，生成更多的代谢产物，这些代谢产物的堆积进一步损害细胞活性。这些特点导致低温保存的细胞非常容易受到细胞外环境影响，例如细胞保存液的渗透压、离子浓度、能量底物、抗凋亡和抗坏死物质，使得细胞死亡率高，复苏后状态不佳。目前，市面上有一些细胞低温保存液，是在生理盐水或培养基的基础上做一定的改进，但这类细胞低温保存液在2-8℃下仍然仅能保存1-2天左右。因此，急需开发一种组分比例适当，能应对细胞保存中的各种问题、方便临时保存或运输且保存时间长、细胞活性高的保存液。

创面愈合是一个复杂的病理生理过程，大体可分为炎症反应、肉芽组织形成、表皮和其他组织再生三个阶段，是一种多细胞参与的有序的变化过程。目前，难愈或不愈创面的治疗仍是外科难题。干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，可分泌多种细胞因子，同时具有免疫调节的功能。干细胞具有促进上皮化、减小炎症反应、加快肉芽组织形成、促进血管重建等功能。目前研究表明干细胞在治疗深度皮损、糖尿病足等难愈伤口的愈合中有积极作用。

目前干细胞的临床使用方式主要为静脉回输和局部注射。由于干细胞具有归巢效应，静脉回输后干细胞在趋化因子的作用下可富集于受损组织，参与组织的修复与再生。同时，也可在局部组织通过注射的方式让干细胞参与受损组织的修复和再生。对于局部软组织或皮肤粘膜组织的损伤，选择用干细胞作为治疗手段时，采用静脉回输的方式面临着局部受损部位干细胞富集量过低的问题，采用局部注射的方式又面临着不能参与皮肤或粘膜的表面修复，同时可能造成二次损伤的问题。因此，必须采取适合的组织工程支架材料来作为干细胞的载体，让干细胞能在受损组织表面趋化因子的作用下到达创面，参与修复。

随着对伤口病理生理研究的深入，伤口愈合理论由传统的“干性愈合”转向新兴的“湿性愈合”。湿性环境可以促进表皮细胞迁移，调节创面氧张力，促进毛细血管的形成，并且有利于坏死组织和纤维蛋白的溶解吸收，加速伤口愈合和减少疤痕的形成。

海藻酸钠是一种从海带、马尾藻等褐海藻中分离得到的一种天然多聚糖，属于阴离子型共聚物，具有很好的生物相容性。海藻酸钠对人体组织是无毒无免疫原性的，并且可以降解，降解的产物也是无毒无免疫性的。中国1987-10-01 颁布实施的卫生部标准中注明海藻酸盐可用于人体组织，美国FDA也早已批准海藻酸盐可用于人类伤口敷料。海藻酸钠可通过离子交联的方式形成含有三维孔隙的水凝胶，在一定制备工艺的条件下，制备的无菌水凝胶可均匀快速的覆盖于创面上，为创面修复提供湿性环境。采用钙离子交联形成的海藻酸钠凝胶具有三维孔隙，细胞可在其中附着生长，自由穿梭；含有三维孔隙的海藻酸钠水凝胶具有强大的快速吸收能力，有利于伤口湿性环境的保持，用钙离子交联还可以促进凝血。作为一种良好的组织工程材料，海藻酸钠盐还兼具抑制细菌生长繁殖的能力；同时，海藻糖可在恶劣环境下，在细胞表面形成一层保护膜，对细胞具有保护作用。

“一种保持冻存细胞活性的干细胞凝胶及其应用”(中国发明专利公开号CN106538512A)，使用海藻酸钠和二甲亚砜等制备而成，该种凝胶在-80℃～ -60℃冻存下可以将干细胞保存期限延长至18个月，但此种凝胶仍需在-80℃～ -60℃的低温保存条件，并且添加有二甲亚砜，在使用该凝胶时还需要对凝胶(其中的细胞)完成复苏，并不方便凝胶的保存运输和临床应用。因此，急需开发一种对低温要求低、便于保存、运输或用前无需复苏的海藻酸钠凝胶或细胞凝胶，以便于促进干细胞的临床应用。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种方便临时保存或运输且保存时间长、细胞活性高的细胞低温保存液，还提供了一种可在2～ 8℃下较长时间保持细胞活性且可作为细胞组织工程支架方便细胞在其中穿梭的海藻酸钠凝胶，还提供了一种对温度要求低、便于保存运输、可有效治愈创面且用前无需复苏的细胞凝胶、制备方法及使用方法，还提供了前述细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶和细胞凝胶的应用。

本发明所采用的技术方案为：

一种细胞低温保存液，主要由以下质量百分含量的组分组成：0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白、3％～7％低分子右旋糖苷、0.1～0.3％谷胱甘肽、 0.5％～2％益多酚、3％～5％腺苷、0.5％～1％葡萄糖、0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％ CaCl₂，余量为水。

本发明还提供了一种海藻酸钠凝胶，主要由以下质量百分含量的原料制备而成：主要由海藻酸钠高浓度溶胀液、氯化钙溶液、透明质酸溶液和前述细胞低温保存液组成；所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积比为 4:1，所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积之和、氯化钙溶液和透明质酸溶液的体积比依次为2:2:3；所述海藻酸钠高浓度溶胀液由海藻酸钠和生理盐水组成，所述海藻酸钠高浓度溶胀液中海藻酸钠的质量百分含量为10％；所述氯化钙溶液由氯化钙和前述细胞低温保存液组成，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为0.2％～1.0％；所述透明质酸溶液由透明质酸和前述细胞低温保存液组成，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量百分含量为0.2％～1.0％。

具体的，上述海藻酸钠凝胶，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为 0.4％～0.8％。

本发明还提供了一种细胞凝胶，由细胞和前述的海藻酸钠凝胶制备而成。

具体的，所述细胞凝胶，所述细胞为干细胞。

本发明还提供了一种前述的细胞凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)配置细胞低温保存液：称取NaCl、KCl和CaCl₂溶于无菌水水中，混匀，灭菌，加入甘露醇、人血白蛋白、低分子右旋糖苷、谷胱甘肽、益多酚、腺苷、葡萄糖溶液稀释至使用浓度，得到所述细胞低温保存液；

(2)配置海藻酸钠高浓度溶胀液：称取海藻酸钠溶于生理盐水，混匀，灭菌，得到海藻酸钠的质量百分含量为10％的海藻酸钠高浓度溶胀液；

(3)配置氯化钙溶液：称取氯化钙溶于所述细胞低温保存液，混匀，滤器过滤除菌，得到所述氯化钙溶液；

(4)配置透明质酸溶液：称取透明质酸溶于所述细胞低温保存液，混匀，得到所述透明质酸溶液；

(5)消化细胞，离心，得细胞沉淀，用上述细胞低温保存液重悬细胞，得到细胞悬液；

(6)向所述细胞悬液中按4:1的体积比加入所述海藻酸钠高浓度溶胀液，混匀，得到细胞悬液一；

(7)向所述细胞悬液一中加入所述透明质酸溶液，混匀，得到细胞悬液二；

(8)向所述细胞悬液二中加入所述氯化钙溶液，混匀，得到细胞悬液三；

将所述细胞悬液三摇晃1～2min后于2～8℃静置25-35min，得到所述细胞凝胶。

本发明还提供了一种前述的细胞凝胶中细胞的分离活化方法，包括如下步骤：向细胞凝胶中加入等体积的200mmol/L的柠檬酸钠溶液，消化，洗涤，离心去上清，加入培养基重悬后培养。

本发明还提供了一种前述的细胞低温保存液在细胞临时保存或细胞运输中的应用。

本发明还提供了一种前述的海藻酸钠凝胶在细胞临时保存、细胞运输或制作细胞组织工程支架材料中的应用。

本发明还提供了一种前述的细胞凝胶在制备医用湿性敷料或细胞组织工程支架材料中的应用，所述医用湿性敷料用于治疗软组织缺损、皮肤粘膜损伤、难愈性伤口、皮肤深度烧烫伤、溃疡、子宫内膜损伤、阴道粘膜损伤或糖尿病足。

本发明的有益效果为：

本发明提供的细胞低温保存液，以0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白和3％～7％低分子右旋糖苷作为细胞膜保护剂，以0.1～0.3％谷胱甘肽和0.5％～2％益多酚作为抗氧化剂，以3％～5％腺苷和0.5％～1％葡萄糖作为细胞营养剂，以0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％CaCl₂作为电解质溶液，使得该细胞低温保存液可较好地应对细胞保存过程中膜内外压力变化和代谢改变的问题，使得该低温保存液无需借助液氮和-80℃冻存，不添加DMSO和动物源性物质，无细胞组织毒性，可在2～8℃下较长时间保持细胞活性，也便于细胞的后续应用。

本发明提供的海藻酸钠凝胶，采用前述细胞低温保存液作为溶剂，以0.1％～0.9％的氯化钙溶液在有效交联2％～3％海藻酸钠溶液，使得该海藻酸钠凝胶富含三维孔隙，形成100～500μm的不规则三维网状结构，为保存其中的细胞提供了较好的胞外结构，pH值为7.2～7.4，适宜细胞存活，并且无细胞组织毒性，易于制得。其次，0.2％～1.0％的氯化钙溶液不会改变海藻酸钠凝胶中的渗透压，有利于维持细胞在海藻酸钠凝胶中的稳定性。再次，0.3％～0.5％透明质酸可增加海藻酸钠凝胶的粘度，透明质酸有较强的吸水保水性，在用于粘膜皮肤创面损伤时有利于湿性环境的维持，利于创面的愈合。总体而言，在该海藻酸钠凝胶中保存的细胞，使用时无需解冻复苏，7天内细胞活性约50％～70％，14天内细胞活性约30％～50％。综上，该海藻酸钠凝胶可作为各种来源的细胞的临时短期保存材料，还可用作制作细胞组织工程支架材料。

本发明提供的细胞凝胶，最适细胞浓度为5×10⁵～5×10⁶cells/mL，对细胞无吸附作用，细胞在能在其中自由通过并附着生长，可作为细胞组织工程支架用于再生修复治疗。当其中细胞为干细胞时，优选P0～P10代间充质干细胞，对组织和粘膜有较强修复效果，可作为医用敷料用于软组织、难愈性伤口皮肤及粘膜创面损伤的修复，包括但不限于皮肤烧烫伤、溃疡、子宫内膜损伤、阴道粘膜损伤、糖尿病足等，还可用作制作细胞组织工程支架材料。

附图说明

图1是不同溶剂制得的细胞凝胶中干细胞活性对比；

图2是不同种类细胞在海藻酸钠凝胶中的活性对比；

图3是不同保存温度下细胞凝胶中的干细胞的平均活性对比；

图4是第8天时细胞凝胶中不同干细胞消化重培养24h后的贴壁情况；

图5是第4天时家兔背部皮肤伤口恢复情况对比；

图6是本发明提供的细胞凝胶对家兔皮损后真皮毛囊和血管生成的治疗作用；

图7是本发明提供的细胞凝胶对家兔皮损后胶原纤维排列的治疗作用。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

除特别标注外，材料均为商业购买。除特别标注外，本发明中所述“％”均为质量百分含量。本发明中所提及的用于细胞保存或培养的液体均为无菌，与细胞相关的各类操作也应在无菌条件下进行。

为使最终制得的海藻酸钠凝胶能最大程度地维持细胞活性，同时制得的细胞凝胶作为皮肤粘膜创面的湿性敷料时，须具备有良好的粘度、硬度、和湿润度，本发明中对海藻酸钠凝胶的组分进行了筛选优化，具体见实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5。

实施例1

本实施例的目的在于筛选海藻酸钠的粘度。

市售常用的海藻酸钠粉末分为高粘度(300～500CPS)、中粘度(100～300 CPS)和低粘度(50～100CPS)三种。将高粘度、中粘度和低粘度的海藻酸钠粉末用生理盐水分别配成5％的海藻酸钠溶液，121℃高压蒸汽灭菌25分钟，加入 1％氯化钙溶液交联，比较三种粘度的海藻酸钠形成的凝胶的透明度、粘度和硬度。评判方式：++++代表较好，+++代表中等，++代表一般，+代表较差，后续筛选实验与此相同。结果如表1所示。

表1

	高粘度	中粘度	低粘度
				透明度	+++	++++	+++
粘度	++++	++	+
				硬度	+++	++	++

由表1可知，高粘度的海藻酸钠交联得到的凝胶粘度和硬度最佳，透明度中等，整体质地适中，因此，选择高粘度的海藻酸钠进行后续的筛选实验。

实施例2

本实施例的目的在于筛选海藻酸钠的浓度。

将高粘度海藻酸钠粉末加入生理盐水，配制成1％，2％，3％，4％，5％海藻酸钠溶液，121℃高压蒸汽灭菌25分钟，加入1％氯化钙溶液交联，比较不同浓度海藻酸钠溶液交联得到的凝胶的透明度、粘度和硬度。结果如表2所示。

表2

	1％	2％	3％	4％	5％
						透明度	++++	++++	++++	++	++
粘度	+	+++	++++	++	+
						硬度	++	+++	++	++	+

由表2可知，1％海藻酸钠溶液交联形成的凝胶的粘度较低，交联程度不够； 4％以上海藻酸钠硬度过高，过于交联，2％和3％海藻酸钠溶液交联形成的凝胶的质地适中，由此可见，海藻酸钠最适宜浓度为2％～3％。

实施例3

本实施例的目的在于筛选氯化钙的浓度。

用高粘度海藻酸钠粉末配置成3％海藻酸钠溶液，121℃高压蒸汽灭菌25分钟。细胞培养时溶液的最适渗透压范围为290mmol/L～310mmol/L，钙离子浓度为1.8～2.8mmol/L，氯离子浓度为130～160mmol/L。为尽可能的减少交联使用的氯化钙对渗透压的影响，根据计算设定了0.2％，0.4％，0.6％，0.8％和1.0％浓度的等体积氯化钙溶液进行交联，来确定最适合用于交联的氯化钙溶液浓度。不同氯化钙浓度交联情况所表3所示。

表3

氯化钙浓度	0.2％	0.4％	0.6％	0.8％	1.0％
						凝胶中渗透压浓度(mmol/L)	≈280	≈290	≈300	≈310	≈320
交联时间	＞180s	≈120s	≈90s	≈60s	＜30s
						透明度	++++	++++	+++	+++	+++
粘度	+	+++	++++	+++	+++
						硬度	+	+++	+++	++	++

由表3可知，使用0.2％～1.0％的氯化钙溶液交联得到的凝胶中的渗透压均适宜细胞生存，采用0.4％～0.8％的氯化钙溶液进行交联，凝胶交联速度适中，便于后续操作，凝胶的透明度、粘度和硬度较好。由此可见，氯化钙溶液最适宜浓度为0.4％～0.8％。

实施例4

本实施例的目的提供一种细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶和细胞凝胶。

配置海藻酸钠凝胶的溶剂需既满足细胞低温保存的需要，也要考虑凝胶中原有的各种离子的浓度，便于维持细胞在凝胶中的活性。根据实施例3的离子浓度，先以0.8％NaCl，0.2％KCl，0.1％CaCl₂配置电解质溶液，根据细胞低温保存的特性，向电解质溶液中加入细胞膜保护剂(1％甘露醇、2％～3％人血白蛋白和5％低分子右旋糖苷)、抗氧化剂(0.2％谷胱甘肽和1％益多酚)和细胞营养剂(3％腺苷和1％葡萄糖)，混匀，最终制得制备细胞低温保存液。在实际应用中发现，本发明提供的细胞低温保存液可用于不同来源的细胞的低温保存。其中，前述物质可在以下范围内波动，甘露醇0.8％～1.5％、人血白蛋白2％～ 3％、低分子右旋糖苷3％～7％、谷胱甘肽0.1～0.3％、益多酚0.5％～2％、腺苷 3％～5％、葡萄糖0.5％～1％。

以该细胞低温保存液作为溶剂溶解透明质酸和氯化钙，制备成0.2％～1.0％的氯化钙溶液(优选为0.4％～0.8％)和0.2％～1.0％的透明质酸溶液。先用生理盐水将海藻酸钠溶解，高压灭菌后得到无菌的海藻酸钠高浓度溶胀液，用细胞低温保存液重悬细胞后与海藻酸钠高浓度溶胀液混合，再加入氯化钙溶液和透明质酸溶液交联，最终制备的产品为细胞凝胶，除细胞的部分外即为海藻酸钠凝胶，所述细胞低温保存液(细胞低温保存液与细胞的混合液)和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积比为4:1，前述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积之和、氯化钙溶液和透明质酸溶液的体积比依次为2:2:3。利用前述细胞低温保存液、海藻酸钠高浓度溶胀液、氯化钙溶液和透明质酸溶液按照下述细胞凝胶的制备方法，最终制得细胞凝胶。

细胞凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：

(2)将无菌海藻酸钠粉末溶于生理盐水，高压灭菌得到海藻酸钠高浓度溶胀液(海藻酸钠的质量百分含量为10％)，以步骤(1)中所得细胞低温保存液为溶剂，分别配置0.2％～1.0％的氯化钙溶液(优选为0.4％～0.8％)和0.2％～ 1.0％的透明质酸溶液，用0.22um滤器对前述氯化钙溶液除菌；

(3)将需要保存的细胞消化后，1500rpm离心三分钟，吸去上清，得到细胞沉淀，用上述细胞低温保存液重悬细胞，得到细胞悬液；

(4)将步骤(3)所得的细胞悬液按4:1的体积比加入海藻酸钠高浓度溶胀液重悬，得到细胞悬液一；所述细胞悬液一中海藻酸钠的质量百分含量为 2％～3％；

(5)将步骤(4)所得的细胞悬液一以2:3的体积比加入上述透明质酸溶液，摇晃混匀，得到细胞悬液二；

(6)用1mL移液枪头吸取氯化钙溶液，以1秒1滴的速度滴入细胞悬液二，摇晃混匀，加入与步骤(4)中细胞悬液一等体积的氯化钙溶液，混匀，得到细胞悬液三；

(7)将步骤(6)得到的细胞悬液三摇晃1～2min后于2～8℃静置25-35min 后，优选30min，得到细胞凝胶，放入2～8℃保存。

有需要时，将步骤(7)中保存的细胞凝胶取出，加入等体积200mmol/L 柠檬酸钠溶液，消化1min后加入培养基洗涤一次，1500rpm离心3min后加入培养基重悬培养。

实施例5

本实施例的目的在于比较不同溶剂配置的细胞凝胶中细胞的活性。

分别用市售干细胞培养基(干细胞培养基组)、汉克斯液(汉克斯液组)、生理盐水(生理盐水组)和本发明提供的细胞低温保存液(保存液组)按已述步骤制备干细胞凝胶，检测不同保存时间点的凝胶中细胞的活性与干性，分组如下：

表4

各组按已述方式制得细胞凝胶，保存于4℃，以0、2、4、6、8、10、12、 14时间点每组各取出两支细胞凝胶，用200mmol/L柠檬酸钠溶解后，0.04％台盼蓝染色，检测细胞存活率，取均值。根据各个时间点描绘各组细胞存活率曲线，细胞存活率的计算：细胞存活率(％)＝检测点活细胞总数/初始活细胞总数×100％。由图1可知，保存液组的干细胞的存活率最高，制作凝胶时采用本发明提供的细胞低温保存液作为溶剂，可以极大的提高干细胞凝胶中细胞的存活率，表明本发明提供的细胞低温保存液或海藻酸钠凝胶可在2～8℃下较长时间保持细胞活性。

实施例6

本实施例的目的在于检测不同种类细胞在海藻酸钠凝胶中的活性。

按实施例4所述细胞凝胶的制备方法，制得含脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、成纤维细胞和免疫细胞的四组凝胶，凝胶中细胞浓度为10⁶/mL。

制得的凝胶分别于4℃和37℃保存，分别于第2、4、6、8、10、12、14天用柠檬酸钠溶液消化凝胶，取微量台盼蓝染色计数，计算每种细胞存活率，结果如图2所示，四种干细胞保存至10天时，存活率仍高于50％。由此可见，本发明提供的海藻酸钠凝胶可较好地保存各类干细胞。

由图3可知，无论哪个时间点，于37℃保存的细胞凝胶中的细胞的平均活性均低于4℃保存的细胞凝胶中的细胞的平均活性，即本发明涉及的细胞凝胶适宜在2～8℃的温度区间保存，尤其是在4℃低温保存。平均而言，7天时细胞存活率可以达到50％～70％，14天时细胞存活率可以达到30％～50％。

本发明提供的海藻酸钠凝胶可冻存各类间充质干细胞，包括来自于健康人体血液、胎盘、脐带、脂肪、皮肤和经血组织等，所有组织依次经原代分离和传代培养得到所述数目的细胞数后，用于制备细胞凝胶。本发明提供海藻酸钠凝胶最适宜P0～P10代间充质干细胞的保存，细胞凝胶中最适细胞浓度为 5×10⁵～6×10⁵cells/mL。

此外，在实践中发现，本发明提供的海藻酸钠凝胶除了能有效维持间充质干细胞在其中的活性外，也能较长时间的维持其他干细胞乃至其他细胞的活性，包括用于原代细胞经传代后的冻存和细胞系的冻存等，可用于科研实验，还可用于临床治疗用作细胞组织工程支架。

实施例7

本实施例的目的在于检测不同种类的间充质干细胞在凝胶中的活性和干性。

按前述方式，分别制得含脐带间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞的细胞凝胶，细胞凝胶中干细胞浓度为10⁶/mL，于4℃保存。在0、 2、4、6、8、10、12、14天各组各取一支凝胶，柠檬酸钠溶液消化凝胶后，取微量台盼蓝染色计数，计算活细胞存活率，再用干细胞培养基重培养细胞凝胶中的细胞，24h后观察贴壁梭形细胞情况。

结果如图4所示，在第8天时消化凝胶重培养，培养24h后仍有贴壁细胞，且贴壁后的细胞仍能大量增殖，活性较高，死亡率低。由实验结果可见，本发明涉及的海藻酸钠凝胶能较好地维持不同组织来源的间充质干细胞良好的活性和干性。

实施例8

本实施例的目的在于验证本发明提供的细胞凝胶(干细胞凝胶)对家兔深二度皮损的治疗修复作用。

构建家兔动物模型，家兔背部剃毛，麻醉后背部制造直径2cm深二度皮损，每只家兔背部有6个创面，设干细胞凝胶组，干细胞培养上清凝胶组，干细胞培养基凝胶组，EGF商品凝胶组，生理盐水凝胶组，空白对照组共6组。每隔一日更换凝胶，测量创面大小，比较各创面伤口恢复情况。第9天处死家兔，创面皮肤组织制成组织切片染色，观察具体修复情况。

结果如图5～7所示，干细胞凝胶在第4天开始较其他组有效，伤口愈合优于其他组(图5)；组织切片(HE染色)观察显示，干细胞凝胶可明显促进皮肤表皮延续、血管再生和胶原再生(图6)，并且促进胶原纤维排列，有效抑制炎症浸润(图7)。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims

1.一种细胞低温保存液，其特征在于，主要由以下质量百分含量的组分组成：0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白、3％～7％低分子右旋糖苷、0.1～0.3％谷胱甘肽、0.5％～2％益多酚、3％～5％腺苷、0.5％～1％葡萄糖、0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％CaCl₂，余量为水。

2.一种海藻酸钠凝胶，其特征在于，主要由以下质量百分含量的原料制备而成：主要由海藻酸钠高浓度溶胀液、氯化钙溶液、透明质酸溶液和权利要求1所述的细胞低温保存液组成；所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积比为4:1，所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积之和、氯化钙溶液和透明质酸溶液的体积比依次为2:2:3；

所述海藻酸钠高浓度溶胀液由海藻酸钠和生理盐水组成，所述海藻酸钠高浓度溶胀液中海藻酸钠的质量百分含量为10％；

所述氯化钙溶液由氯化钙和权利要求1所述的细胞低温保存液组成，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为0.2％～1.0％；

所述透明质酸溶液由透明质酸和权利要求1所述的细胞低温保存液组成，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量百分含量为0.2％～1.0％。

3.根据权利要求2所述的海藻酸钠凝胶，其特征在于：所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为0.4％～0.8％。

4.一种细胞凝胶，其特征在于：由细胞和权利要求2-3任意一项所述的海藻酸钠凝胶制备而成。

5.根据权利要求4所述的细胞凝胶，其特征在于：所述细胞为干细胞。

6.一种权利要求4-5任意一项所述的细胞凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(6)向所述细胞悬液中按4:1的体积比加入所述海藻酸钠高浓度溶胀液，

混匀，得到细胞悬液一；

(9)将所述细胞悬液三摇晃1～2min后于2～8℃静置25-35min，得到所述细胞凝胶。

7.一种权利要求4-5任意一项所述的细胞凝胶中细胞的分离活化方法，其特征在于，包括如下步骤：向细胞凝胶中加入等体积的200mmol/L的柠檬酸钠溶液，消化，洗涤，离心去上清，加入培养基重悬后培养。

8.一种权利要求1所述的细胞低温保存液在细胞临时保存或细胞运输中的应用。

9.一种权利要求2-3任意一项所述的海藻酸钠凝胶在细胞临时保存、细胞运输或制作细胞组织工程支架材料中的应用。

10.一种权利要求4-5任意一项所述的细胞凝胶在制备医用湿性敷料或细胞组织工程支架材料中的应用，所述医用湿性敷料用于治疗软组织缺损、皮肤粘膜损伤、难愈性伤口、皮肤深度烧烫伤、溃疡、子宫内膜损伤、阴道粘膜损伤或糖尿病足。