CN106538512A - 一种保持冻存细胞活性的干细胞凝胶制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种保持冻存细胞活性的凝胶制剂和含有干细胞的干细胞凝胶制剂。包括以质量百分比计的下述组分:1‑3%海藻酸钠,1‑5%二甲基亚砜,1‑5%丙二醇,1‑5%益多酚,2%‑10%右旋糖酐,1‑5%人血白蛋白,补足水或磷酸盐溶液。该凝胶制剂生物相容性好,操作简便,能够维持细胞的高活性,并能直接进行低温保存,不需要传统的液氮冻存,复苏后的细胞凝胶制剂仍能够维持细胞的高活性和细胞的干性,可以作为皮肤损伤或者粘膜损伤的治疗应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种用于细胞冻存的凝胶制剂;
本发明还涉及含有间充质干细胞和上述凝胶制剂的干细胞凝胶制剂;
本发明还涉及上述干细胞凝胶制剂的应用。
背景技术
组织工程支架材料要作为永久性的替代物,必须是可降解的生物材料,材料本身对组织应该没有免疫原性,而且材料降解的产物对生物组织应该没有毒性或异常反应。胶原虽然对细胞的亲和性好,但常来源于动物组织,病原微生物污染风险大,而且会有免疫原性,且价格较高,力学性能较差,需交联后使用。目前应用于临床的皮肤组织工程产品仍存在一定的免疫排斥反应,治疗效果欠佳。常规处理是在创面上涂外用药消毒、暴露或包扎,但效果并不理想,轻者患者感觉创口疼痛、红肿,重者痂下积脓,肢体活动受限,继而影响正常的工作。
海藻酸钠是从海洋的褐藻中提取的直链阴离子多糖,生物相容性好,具有生物降解吸收性和免疫隔离性能,是目前最常用的生物支架材料。海藻酸钠水溶液为淡黄色半流体胶状液体,可快速均匀的覆盖在创伤表面,减缓表面水分的蒸发,维持细胞活性,对细胞具有保护和支持作用,是细胞外用治疗皮肤组织修复的良好载体,也可以作为肠组织修复和子宫组织修复的细胞支架材料。
间充质细胞因其易于分离、培养、扩增的特点,体外长期培养能够始终保持其干性,具有稳定的遗传背景等独特优势,成为组织工程最好的种子细胞的来源之一。间充质干细胞具有低免疫原性,不会引起机体异常免疫反应;能够释放多种抑炎因子,抑制机体炎症反应,能够释放多种促进组织损伤修复的因子促进组织损伤修复;动员机体自身的干细胞参与组织损伤修复,细胞直接接触缺损或炎性创面可以最大程度的发挥干细胞的修复治疗作用。
保持细胞活性的长期冻存最常用的方法是液氮冻存,能够保持80%以上的细胞活率。但是在细胞制品的运输和临床应用中,液氮不易于通过交通工具运输,细胞液氮冻存在转移运输时受到很大限制。在临床应用时,应用地点需要配备液氮储存装置和液氮供应,受当地地域和条件限制。
申请号为200810136415.6的中国专利申请公开了一种使用甲基纤维素作为细胞基质的人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法,其含有抗生素庆大霉素,不适用于抗生素过敏人群;而且涂抹剂快速配制中含有动物源成分胎牛血清,有可能造成过敏以及具有动物源性安全隐患;快速配制中操作步骤多,过程繁杂,带来微生物污染风险,运输前不能按照药典要求完成2周的无菌检测,制品质量无法保证。
中国专利申请CN201210133427.X,公开了一种用于创面修复的干细胞制剂,其包含脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞以及高分子稳定剂,所述高分子稳定剂选自海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉,还可以含有细胞防冻剂DMSO,保湿剂丙二醇或丙三醇。该制剂虽然具有很好的治疗作用,但其在稳定性和细胞存活率方面还存在一定的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于保持冻存细胞活性的凝胶制剂,其无需液氮冻存能够长期维持细胞高活率,克服了依赖液氮的传统的细胞保存方式,在-80度条件下能够长期保持细胞高活性。
本发明的另一个目的在于提供一种含有间充质干细胞和所述凝胶制剂的干细胞凝胶制剂。
本发明的再一个目的在于提供所述干细胞凝胶制剂在制备皮肤修复药物中的应用。
根据本发明的一方面,一种用于保持冻存细胞活性的凝胶制剂,包括下述质量百分比的组分:1-3%海藻酸钠,1-5%二甲基亚砜,1-5%丙二醇,1-5%益多酚,2%-10%右旋糖酐,1-5%人血白蛋白,补足水或磷酸盐溶液。其中磷酸盐溶液成分为0.02%氯化钾,0.0047%氯化镁,0.1158%磷酸氢二钠,0.020%磷酸二氢钠,0.8%氯化钠和注射用水。
优选的组成为:3%的海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,2%益多酚,6%右旋糖酐和2%人血白蛋白,补足磷酸盐溶液。其中磷酸盐溶液成分为0.02%氯化钾,0.0047%氯化镁,0.1158%磷酸氢二钠,0.020%磷酸二氢钠,0.8%氯化钠和注射用水。
在现有配方含有海藻酸钠的基础上,本发明的凝胶制剂的组成上增加了益多酚、右旋糖酐和人血白蛋白,益多酚具有非常强的抗氧化活性,抗氧化活性至少是维生素C的100多倍,是维生素E的25倍,能够保护细胞和DNA受损害。右旋糖苷是目前最佳的血浆代用品之一,能够极大的提高细胞活率并降低DMSO的使用量。人血白蛋白的加入使得本发明的凝胶制剂中不含有动物来源成分,提高了制剂的安全性和稳定性。此外,对凝胶制剂各成分配比组成进行了筛选,形成了适于保持冻存细胞活性的凝胶制剂。
本发明的凝胶制剂可用于冻存各种细胞,包括但不限于,各种来源的肿瘤细胞系、动物细胞、干细胞等。
根据本发明的另一方面,提供一种干细胞凝胶制剂,含有间充质干细胞和所述凝胶制剂,优选地,每1ml凝胶制剂中含有0.5~3x106个间充质干细胞。所述间充质干细胞可来源于脐带、胎盘、羊膜组织,通过取上述组织制备,但不限于此,可以是任何来源的间充质干细胞。
本发明所述干细胞凝胶制剂按下述方法配制:将无菌海藻酸钠粉末溶于磷酸盐溶液中,室温溶胀24-48小时后,充分搅拌混匀,再加入其余组分配制成1-3%海藻酸钠凝胶制剂。静置后加入间充质干细胞,混合均匀,制成干细胞凝胶制剂。
为了保证细胞在凝胶中的活力,配制凝胶制剂的海藻酸钠的最适目数为200,粘度600-1000cps。溶液PH值为6.5-7.5。该富含细胞的凝胶制剂可以直接冻存于-80度~-60度长期保存,冻存方法为非程序降温。保存期限长达1年半。复苏该富含细胞的凝胶制剂后可以直接使用,细胞活率可以维持在90%以上。如果不立即使用,也可以放置到4度保存,6小时内细胞活率可以维持在80%以上。
根据本发明的再一方面,提供本发明所述干细胞凝胶制剂在制备治疗皮肤损伤或者粘膜损伤药物中的应用,将含有本发明的凝胶制剂与间充质干细胞的干细胞凝胶制剂制备成适于运输和保存的药物制剂,可用于皮肤修复治疗。所述皮肤损伤或者粘膜损伤包括但不限于皮肤溃疡,褥疮,糖尿病足,溃疡性结肠炎,克隆氏病,子宫内膜损伤。
本发明的凝胶制剂生物相容性好,能够维持细胞的高活性,不需要液氮冻存细胞,能直接进行低温保存,便于运输,方便使用。解冻方法简单快速,无需传统方法的洗涤,离心等步骤,减少人为操作对细胞的活率和得率的影响和可能造成污染的风险,解冻后直接使用,复苏后的细胞凝胶制剂仍能够维持细胞的高活性和细胞的干性。
附图说明
图1:不同海藻酸钠材料对细胞活率的影响;
图2:不同DMSO浓度对细胞活率的影响;
图3:不同人血白蛋白浓度对细胞活率的影响;
图4:不同益多酚浓度对细胞活率的影响;
图5:不同右旋糖酐浓度对细胞活率的影响;
图6:益多酚和右旋糖酐对细胞活率的影响;
图7:优化后配方与原有凝胶配方的比较;
图8:不同来源的间充质干细胞在海藻酸钠凝胶中的活率;
图9:长期冻存保存后,凝胶制剂中细胞活率;
图10:本发明细胞凝胶制剂对大鼠皮损的治疗作用。
具体实施方式
以下结合具体实施例,详细描述但不限制本发明。
材料来源:除特别注明外,所有材料均为商业购买。
细胞来源:间充质干细胞来源于但不限于健康人捐献的脐带、胎盘、羊膜组织,经过组织分离、培养扩增、传代获得。
细胞悬液的制备:使用含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基),于37℃、5%CO2的条件下对间充质干细胞进行常规培养,待细胞融合度达到90%左右时,用0.25%的胰蛋白酶进行消化,后用上述完全培养基中止,将所得细胞悬液进行离心,弃上清,再用无血清DMEM培养基对细胞沉淀进行悬浮,调整细胞悬液中间充质干细胞的含量达到0.4×106 ~2.5×107个/毫升备用。
细胞存活率的计算:细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%
细胞得率的计算:细胞得率(%)=检测点活细胞总数/初始活细胞总数×100%
【实施例1】:海藻酸钠的筛选
将200目,100目和50目的海藻酸钠粉末分别配制成1%、2%、3%的海藻酸钠溶液,加入3%二甲基亚砜,5%丙二醇,而后加入冻存复苏后的间充质干细胞进行混合,混合均匀后放置在4度冰箱内,在第0,1,6小时对细胞活率和细胞得率进行比较。由实验结果可以看出,200目的海藻酸钠是最适合细胞存活的凝胶材料(图1)。
【实施例2】:凝胶制剂配方的筛选及优化
为筛选维持细胞活率的最好的凝胶配方,将配方中的组分进行逐一筛选,选出最好的配方:
(1)海藻酸钠凝胶浓度的筛选
将200目的海藻酸钠粉末加入磷酸盐溶液,磷酸盐溶液成分为0.02%氯化钾,0.0047%氯化镁,0.1158%磷酸氢二钠,0.020%磷酸二氢钠,0.8%氯化钠和注射用水。配制成1%,2%,3%,4%的海藻酸钠水溶液,观察凝胶的澄明度,流动性。1%,2%和3%的凝胶的澄明度很好,4%的凝胶中有不溶物。凝胶的流动性随着海藻酸钠浓度的升高而减少,3%的凝胶的流动性最小,附着能力最好。综合澄明度和流动性的结果,最后选择3%作为的海藻酸钠的浓度。
(2)DMSO浓度的筛选
实验分为4组:
将各组组分充分混匀,制备干细胞凝胶制剂。在冻存前抽取干细胞凝胶制剂作为-1天计数,过夜冻存复苏后第1小时,6小时,24小时取各组3支干细胞凝胶制剂,进行细胞活率和细胞得率检测。由实验结果可以看出,1.5%和3%的二甲基亚砜在凝胶中均能很好的保护细胞,这个配方中可以在保证细胞活力的前提下减少二甲基亚砜的用量(图2)。
(3)人血白蛋白浓度的筛选
实验分为3组:
各组将以上组分充分混匀,制备干细胞凝胶制剂,在冻存前抽取干细胞凝胶制剂作为-1天计数,非程序降温方法冻存于-80度后第0,1,7天取各组3支干细胞凝胶制剂,复苏后进行细胞活率和细胞得率检测。由实验结果可以看出,人血白蛋白能够更好的保护冻存过的细胞,最后选择2%作为人血白蛋白的浓度(图3)。
(4)益多酚和右旋糖酐的选择
1)益多酚的浓度筛选
实验分为5组:
各组将以上组分充分混匀,制备干细胞凝胶制剂,在冻存前抽取干细胞凝胶制剂作为-1天计数,非程序降温方法冻存于-80度后第0,1,7天取各组3支细胞凝胶制剂,复苏后进行细胞活率和细胞得率检测。由实验结果可以看出,益多酚能够更好的保护冻存过的细胞,最后选择2%作为益多酚的使用浓度(图4)。
2)右旋糖酐的浓度筛选
实验分为5组:
各组将以上组分充分混匀,制备干细胞凝胶制剂,在冻存前抽取干细胞凝胶制剂作为-1天计数,非程序降温方法冻存于-80度后第0,1,7天取各组3支干细胞凝胶制剂,复苏后进行细胞活率和细胞得率检测。由实验结果可以看出,右旋糖苷能够更好的保护冻存过的细胞,最后选择6%作为右旋糖酐的使用浓度(图5)。
3)益多酚和右旋糖酐的联合使用
实验分为4组:
各组将以上组分进行混合。制成干细胞凝胶制剂各组12支,在冻存前抽取干细胞凝胶制剂作为-1天计数,按照非程序降温方法冻存于-80度。在0,1,7天后,各组各取3支复苏后进行细胞活率和细胞得率检测。由实验结果可见,维持细胞活率的最好的凝胶配方是3%的海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,2%益多酚,6%右旋糖酐,2%人血白蛋白(图6)。
【实施例3】:优化配方的复苏活率和长期稳定性研究
为研究本发明配方的细胞复苏活率和长期稳定性,以对照组凝胶配方:3%海藻酸钠,10%二甲基亚砜,5%丙二醇,与优化的凝胶配方(本发明配方):3%海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,2%益多酚,6%右旋糖酐和2%人血白蛋白。对两种配方在即时复苏活率和长期稳定性方面进行了比较,在冻存前抽取细胞凝胶制剂作为-1天计数,按照非程序降温方法冻存于-80度。在0天各组各取3支复苏后,4度放置6小时后检测细胞活率和细胞得率,后在冻存7,30,90天后各组各取3支复苏后进行细胞活率和细胞得率检测。由实验结果可见,本发明配方提高了细胞复苏后暂时保存的活率,同时显著的提升了长期保存的能力,使得细胞在非液氮条件下的长期保存成为现实(图7)。
【实施例4】:不同组织来源的间充质干细胞在海藻酸钠凝胶中的活率检测
比较两种凝胶配方对不同组织来源的间充质干细胞的活率的影响,本发明配方1:3%海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,2%益多酚,6%右旋糖酐,2%人血白蛋白,配方2:3%的海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,5%益多酚,10%右旋糖酐,1%人血白蛋白,分别配制成凝胶原液。将凝胶原液与骨髓来源的、脐带来源的、胎盘来源的间充质干细胞分别混合,混合均匀后,制成细胞凝胶制剂,按照非程序降温方法冻存于-80度。在0,1,15天后,各组各取3支进行细胞活率和细胞得率检测。由实验结果可见,两种海藻酸钠凝胶均是各种组织来源的间充质干细胞的良好载体,能够维持各种不同来源的间充质干细胞的活性(图8)。
【实施例5】:长期冻存保存后,凝胶制剂中细胞活率的检测
比较两种凝胶配方对细胞稳定性的影响,本发明配方1:3%的海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,2%益多酚,6%右旋糖酐,2%人血白蛋白,配方2:3%的海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,5%益多酚,10%右旋糖酐,1%人血白蛋白,分别配制成凝胶原液。将凝胶原液和间充质干细胞混合均匀后,按照非程序降温方法冻存于-80度。在第0,1,3,6,15,18个月,取细胞凝胶制剂3支进行细胞活率和细胞得率检测,并检测其表型,分化能力。由实验结果得出,这两种细胞凝胶制剂均可以在-80度长期保存18个月,能够保持稳定性(图9)。
【实施例6】:本发明细胞凝胶制剂对大鼠皮损的治疗作用
构建大鼠皮损模型,制造直径2cm的全皮缺损,每只大鼠有2个创面,共设4个组,包括空白组,高剂量组(细胞数3×106个),中剂量组细胞数(1×106个)和低剂量组(0.2×106个)。每隔3-4日测量创面大小。比较各组皮肤恢复的程度,结果表明:细胞凝胶在第3天就开始显效,伤口愈合速度快于空白对照组,提示细胞凝胶制剂能促进伤口愈合,并呈剂量依赖关系。
Claims (10)
1.一种保持冻存细胞活性的凝胶制剂,包括以质量百分比计的下述组分:1-3%海藻酸钠,1-5%二甲基亚砜,1-5%丙二醇,1-5%益多酚,2%-10%右旋糖酐,1-5%人血白蛋白,补足水或磷酸盐溶液。
2.根据权利要求1所述的凝胶制剂,其特征在于所述凝胶制剂包含3%海藻酸钠,3%二甲基亚砜,5%丙二醇,2%益多酚,6%右旋糖酐和2%人血白蛋白,补足水或磷酸盐溶液。
3.根据权利要求1所述的凝胶制剂,其特征在于所述海藻酸钠的粘度600-1000cps,粒度为200目,所述凝胶制剂PH值为6.5-7.5。
4.一种干细胞凝胶制剂,含有间充质干细胞和权利要求1~3任一项所述的凝胶制剂。
5.根据权利要求4所述的干细胞凝胶制剂,其特征在于所述制剂中每1ml凝胶制剂中含有0.5~3x106个间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述干细胞凝胶制剂,其特征在于所述间充质干细胞来源于脐带、胎盘或羊膜间组织。
7.根据权利要求4所述的干细胞凝胶制剂,其特征在于经非程序降温冻存于-80~-60℃,干细胞保存期限可至18个月,复苏该干细胞凝胶制剂后,细胞活率大于90%,放置到4℃保存,6小时内细胞活率大于80%。
8.权利要求4所述的干细胞凝胶制剂的制备方法,包括将海藻酸钠粉末溶于超纯水或磷酸盐溶液中,室温溶胀24-48小时后,充分搅拌混匀,再加入其余组分配制成凝胶制剂,静置后加入间充质干细胞,混合均匀,制成为富含细胞的干细胞凝胶制剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其中所述海藻酸钠的粘度600-1000cps,粒度为200目,凝胶制剂PH值为6.5-7.5。
10.权利要求4所述的干细胞凝胶制剂在制备治疗皮肤损伤或粘膜损伤药物中的应用。
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