FR3057141A1 - Formulation de gel de cellules souches pour maintenir la viabilite de cellules cryoconservees et son utilisation - Google Patents
Formulation de gel de cellules souches pour maintenir la viabilite de cellules cryoconservees et son utilisation Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une formulation de gel pour maintenir la viabilité de cellules cryoconservées, et une formulation de gel de cellules souches qui contient des cellules souches. La formulation de gel comprend les composants suivants en pourcentage en masse : 1 %-3 % d'alginate de sodium, 1 %-5 % de diméthyle sulfoxyde, 1 %-5 % de propylène glycol, 1 %-5 %de polyphénol, 2%-10% de dextran, 1 %-5 % de sérumalbumine humaine et de l'eau ou une solution saline d'acide phosphorique supplémentaire. Cette formulation de gel est biocompatible et facile à utiliser, elle peut maintenir l'activité élevée de cellules et être cryoconservée directement sans cryoconservation traditionnelle à l'azote liquide. Après avoir été réanimée, la formulation de gel de cellules peut encore maintenir une activité élevée des cellules et le caractère souche de cellules, elle peut donc être utilisée pour le traitement d'une blessure cutanée ou d'une lésion mucosale.
Description
Titulaire(s) : BEIJING HEALTH AND BIOTECH STEM CELL INSTITUTE CO. LTD.
Demande(s) d’extension
Mandataire(s) : CABINET LAURENT ET CHARRAS.
FR 3 057 141 - A1 f54) FORMULATION DE GEL DE CELLULES SOUCHES POUR MAINTENIR LA VIABILITE DE CELLULES CRYOCONSERVEES ET SON UTILISATION.
©) La présente invention concerne une formulation de gel pour maintenir la viabilité de cellules cryoconservées, et une formulation de gel de cellules souches qui contient des cellules souches. La formulation de gel comprend les composants suivants en pourcentage en masse: 1 %-3 % d'alginate de sodium, 1 %-5 % de diméthyle sulfoxyde, 1 %5 % de propylène glycol, 1 %-5 %de polyphénol, 2%-10% de dextran, 1 %-5 % de sérumalbumine humaine et de l'eau ou une solution saline d'acide phosphorique supplémentaire. Cette formulation de gel est biocompatible et facile à utiliser, elle peut maintenir l'activité élevée de cellules et être cryoconservée directement sans cryoconservation traditionnelle à l'azote liquide. Après avoir été réanimée, la formulation de gel de cellules peut encore maintenir une activité élevée des cellules et le caractère souche de cellules, elle peut donc être utilisée pour le traitement d'une blessure cutanée ou d'une lésion mucosale.
FORMULATION DE GEL DE CELLULES SOUCHES POUR MAINTENIR LA VIABILITÉ DE CELLULES CRYOCONSERVÉES ET SON UTILISATION
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la biotechnologie, et concerne en particulier une formulation de gel pour une cryoconservation de cellules.
La présente invention concerne également une formulation de gel de cellules souches comprenant des cellules souches mésenchymateuses et la formulation de gel, et son utilisation.
ART ANTERIEUR
Pour être un substitut permanent, le matériau de support en ingénierie tissulaire doit être dégradable et sans immunogénicité, et les produits décomposés de celui-ci doivent n’avoir aucune toxicité ou réaction anormale vis-à-vis d’un tissu biologique. Bien qu'ayant une grande affinité pour des cellules, le collagène, qui provient en général d’un tissu animal, est immunogène et présente un risque élevé de contamination microbienne pathogène. De plus, le collagène n’est pas non plus économique, et a une faible performance mécanique, ce qui le rend nécessaire pour une utilisation de réticulation. Les produits cliniques actuels d’ingénierie tissulaire de la peau déclenchent encore un rejet immunitaire et ont seulement un faible effet de traitement. Le traitement classique d’une blessure cutanée consiste à désinfecter la plaie à l’aide d’un médicament à usage externe, et ensuite à exposer ou panser sur la peau endommagée. L'effet n’est cependant pas idéal. Des patients ayant une répercussion légèrer ressentent la douleur de la plaie, le gonflement ; les patients ayant une répercussion sévère génèrent un empyème sous la croûte et leur activité physique est limitée, ce qui affecte le travail normal des patients.
L'alginate de sodium est un polysaccharide anionique à chaîne rectiligne extrait d'algues marines brunes, qui a de grandes propriétés de biocompatibilité, biodégradabilité et immunoisolation, et est le matériau de bio-support le plus couramment utilisé. Une solution aqueuse d'alginate de sodium, un liquide colloïdal jaune clair semi-fluide, joue un rôle dans la protection et le support de cellules. Elle peut couvrir rapidement et uniformément la surface de la plaie, ralentir l'évaporation de l'eau en surface, et maintenir une activité cellulaire. C’est un bon support pour les médicaments à usage externe pour la réparation de tissus cutanés. Une solution aqueuse d'alginate de sodium peut également i
être utilisée comme matériau de support cellulaire de réparation de tissu intestinal et de réparation de tissu utérin.
Une cellule mésenchymateuse est l'une des meilleures sources de cellules de tissus en raison de ses avantages d’un historique génétique stable, d’une séparation, d’une culture et d'une expansion faciles, et de la capacité de maintenir leur caractère souche après une culture à long terme in vitro. Des cellules souches mésenchymateuses, ayant une faible immunogénicité, ne provoqueront pas une réponse immunitaire anormale, et peuvent libérer une variété de cytokines anti-inflammatoires, qui inhibent la réponse inflammatoire du corps. Elles peuvent aussi libérer une variété de facteurs pour favoriser la réparation de blessures tissulaires et mobiliser les propres cellules souches du corps pour prendre part à la réparation de blessures tissulaires. Un contact cellulaire direct avec des défauts ou des plaies inflammatoires peut maximiser la réparation et l'effet thérapeutique d’une cellule souche.
La méthode la plus couramment utilisée de maintien de viabilité d’une cellule en cryoconservation à long terme est la cryoconservation avec de l'azote liquide, qui maintient la viabilité cellulaire à plus de 80 %. Cependant, lors du transport et de l'application clinique de produits cellulaires, l'azote liquide n’est pas pratique à transporter, le transport par transfert de cellules dans de l'azote liquide est soumis à de fortes restrictions. Dans des applications cliniques, le lieu d’utilisation doit être équipé d'un dispositif de stockage à l'azote liquide et d’une alimentation en azote liquide soumis à des conditions et une géographie locales.
La demande de brevet Chinois CN101451124A décrit une méthode de préparation de la formulation de cellules souches mésenchymateuses provenant d’un cordon ombilical humain, dans laquelle la méthylcellulose est utilisée comme matrice cellulaire. La formulation contient de la gentamicine qui n’est pas adaptée aux personnes allergiques aux antibiotiques. En outre, un sérum de veau fœtal d’origine animale est produit lors de la préparation rapide de la formulation à usage externe, ce qui peut provoquer des allergies et des risques pour la sécurité des animaux. Une préparation rapide de la formulation a besoin de plusieurs étapes opérationnelles, dont le processus est compliqué, entraînant un risque de contamination microbienne. Un test de stérilité de 2 semaines ne peut être effectué avant le transport, ce qui constitue les exigences de la pharmacopée. La qualité du produit ne peut pas être garantie.
La demande de brevet Chinois CN 102670654A décrit une formulation de cellules souches pour une réparation de plaies. La formulation de cellules souches contient des cellules souches mésenchymateuses de cordon ombilical, placentaires ou amniotiques et un stabilisant macromoléculaire choisi parmi le groupe constitué de l'alginate de sodium, sodium hyaluronate, chitosan et amidon hydroxyéthylé. Du DMSO anticongélation pour cellule, du propylène glycol ou glycérol humectant peuvent également être contenus. Bien que la formulation ait un très bon effet thérapeutique, elle a pour inconvénient la stabilité et le taux de survie cellulaire.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
Le but de la présente invention est de fournir une formulation de gel pour maintenir la viabilité de cellules cryoconservées, qui peut maintenir une viabilité cellulaire sur une longue période de temps sous une condition de -80 °C sans cryoconservation à l'azote liquide. Cela met fin à la dépendance à l'égard de l'azote liquide pour la conservation cellulaire traditionnelle.
Un autre but de la présente invention est de fournir une formulation de gel de cellules souches comprenant des cellules souches mésenchymateuses et la formulation de gel.
Encore un autre but de la présente invention est de fournir l'utilisation de la formulation de gel de cellules souches pour la préparation de médicaments pour la réparation cutanée.
Selon un aspect de l'invention, une formulation de gel pour le maintien de l'activité des cellules cryoconservées comprend les composants suivants en pourcentage en masse : 1 %-3 % d’alginate de sodium, 1 %-5 % de diméthyle sulfoxyde, 1 %-5 % de propylène glycol, 1 %-5 % de polyphénol, 2%-10% de dextran, 1 %-5 % de sérumalbumine humaine et de l’eau ou une solution saline d'acide phosphorique supplémentaire. La solution de phosphate est constituée de 0,02 % de chlorure de potassium, 0,0047 % de chlorure de magnésium, 0,1158% de phosphate hydrogéné de disodium, 0,020%, de phosphate dihydrogéné de sodium, 0,8 % de chlorure de sodium et de l'eau pour injection.La formulation de gel comprend de préférence les composants suivants en pourcentage en masse : 3 % d’alginate de sodium, 3 % de diméthyle sulfoxyde, 5 % de propylène glycol, 2 % polyphénol, 6 % de dextran, 2 % de sérumalbumine humaine, et une solution de phosphate supplémentaire qui est constituée de 0,02 % de chlorure de potassium, 0,0047% de chlorure de magnésium, 0,1158% de phosphate hydrogéné de disodium, 0,020 %, de phosphate dihydrogéné de sodium, 0,8 % de chlorure de sodium et de l'eau pour injection.
À l’exception de l'alginate de sodium de l’art antérieur, le polyphénol, le dextran et la sérumalbumine humaine sont ajoutés à la formulation de gel de la présente invention. Le polyphénol a une activité antioxydante très forte, qui est aussi élevée qu’au moins 100 fois celle de la vitamine C et 25 fois celle de la vitamine E. Le polyphénol peut protéger les cellules et l’ADN vis-à-vis d’un dommage. Le dextran est l'un des meilleurs substituts de plasma actuels, qui peut améliorer considérablement la viabilité cellulaire et réduire l'utilisation de DMSO. L'ajout de sérumalbumine humaine fait que la formulation de gel de la présente invention ne contient pas d'ingrédients dérivés d'animal et améliore la sécurité et la stabilité de la formulation. De plus, la composition de la formulation de gel est criblée pour obtenir une formulation de gel adaptée au maintien de l'activité de cellules cryoconservées.
La formulation de gel de la présente invention peut être utilisée pour la cryoconservation de diverses cellules, qui contiennent, mais ne sont pas limitées à, diverses lignées de cellules tumorales, cellules animales, cellules souches et analogues.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est fourni une formulation de gel de cellules souches comprenant des cellules souches mésenchymateuses et la formulation de gel. De préférence, la concentration de cellules souches mésenchymateuses est de 0,5 x 106 à 3 x 106 pour 1 ml de la formulation de gel. Les cellules souches mésenchymateuses peuvent être dérivées d’un tissu de cordon ombilical, placentaire et amniotique, pour préparer la formulation de gel de cellules souches. Les cellules souches sont dérivées non seulement des tissus cités ci-dessus, mais aussi de toute autre source de cellules souches mésenchymateuses.
La formulation de gel de cellules souches selon l'invention est préparée par les étapes suivantes consistant à : (1) dissoudre et faire gonfler la poudre d'alginate de sodium dans de l’eau ultra pure ou une solution de phosphate à la température ambiante pendant 24 à 48 heures ; (2) remuer le mélange jusqu'à homogénéité, et ajouter les composants restants dans le mélange pour formuler la formulation de gel selon la revendication 1 ; (3) laisser reposer la formulation de gel obtenue à l’étape (2) pendant un certain temps, puis ajouter des cellules souches mésenchymateuses dans celle-ci ; (4) mélanger uniformément, et la formulation de gel riche en cellules souches selon l’invention est préparée.
Afin de maintenir la vitalité des cellules dans le gel, la taille optimale de l'alginate de sodium dans la formulation de gel est de 200 mesh et la viscosité est de 600 à 1 000 cps. Le pH de la solution est de 6,5 à 7,5. La formulation de gel riche en cellules peut être congelée directement entre -80 °C et -60 °C pour une conservation à long terme. La méthode de cryoconservation est un refroidissement non-programmé. La durée de vie est aussi longue qu’un an et demi. La formulation de gel riche en cellules récupérée peut être utilisée directement et la viabilité cellulaire peut être maintenue à 90 % ou plus. La formulation de gel peut également être stockée à 4 °C si elle n'est pas utilisée immédiatement, et la viabilité des cellules peut être maintenue à 80 % ou plus pendant
6 heures.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est fourni l'utilisation de la formulation de gel de cellules souches selon la présente invention pour la préparation de médicaments pour le traitement d’une blessure cutanée ou d’une lésion mucosale. La formulation de gel de cellules souches est préparée dans une formulation pharmaceutique qui est adaptée au transport et à la conservation et peut être utilisée pour le traitement de réparation cutanée. Les lésions cutanées ou les lésions mucosales comme décrit précédemment incluent, mais ne sont pas limitées à, des ulcères de la peau, des escarres de lit, un pied diabétique, une colite ulcéreuse, la maladie de Crohn, une blessure de l'endomètre.
La formulation de gel de l'invention présente une bonne biocompatibilité, et peut maintenir l'activité élevée des cellules sans utilisation d’une cryoconservation à l'azote liquide. La formulation de gel peut être directement stockée à basse température et est facile pour le transport et l'utilisation. La méthode de décongélation est simple et rapide, sans le processus de lavage et centrifugation des méthodes traditionnelles. Le risque de pollution et l'effet sur la viabilité et le rendement cellulaires causés par l’intervention humaine sont réduits. La formulation de gel de cellules peut être utilisée directement après décongélation, et maintient encore une activité cellulaire élevée et un caractère souche après réanimation.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Effets de différents matériaux d'alginate de sodium sur la viabilité cellulaire.
Figure 2 : Effets de différentes concentrations de DMSO sur la viabilité cellulaire.
Figure 3 : Effets de différentes concentrations de sérumalbumine humaine sur la viabilité cellulaire.
Figure 4 : Effets des différentes concentrations de polyphénol sur la viabilité cellulaire.
Figure 5 : Effets de différentes concentrations de dextran sur la viabilité cellulaire.
Figure 6 : Effets de l'utilisation combinée de polyphénols et de dextran sur la viabilité cellulaire.
Figure 7 : Comparaison de la formulation optimisée avec la formulation de gel d’origine.
Figure 8 : Fa viabilité de cellules souches mésenchymateuses provenant de sources différentes dans des gels d'alginate de sodium.
Figure 9 : Viabilité cellulaire dans des formulations de gel après cryoconservation à long terme.
Figure 10 : Effet thérapeutique de la formulation de gel de cellules de la présente invention sur des lésions cutanées de rat.
DESCRIPTION DES MODES PRÉFÉRÉS DE RÉALISATION
Les exemples ci-après illustrent et décrivent la présente invention, mais ne sont pas limitatifs.
Source de matériaux : Tous les matériaux sont disponibles dans le commerce, sauf autre indication.
Sources de cellules : Des cellules souches mésenchymateuses sont dérivées de, mais sans être limitées à, un tissu de cordon ombilical, de placenta, amniotique donné par des personnes en bonne santé, obtenu par séparation, culture et passage tissulaires.
Préparation d’une suspension cellulaire : Des cellules souches mésenchymateuses ont été cultivées de manière classique à 37 °C, sous une condition de 5 % de CCF en utilisant un milieu DMEM contenant du sérum de veau fœtal à 10 % (milieu complet) jusqu'à ce que la confluence des cellules soit d’environ 90 %, digérées à l’aide de trypsine à 0,25 %, puis la digestion a été stoppée à l’aide du milieu complet ci-dessus. La suspension cellulaire récoltée a été centrifugée et le surnageant a été jeté. Le culot cellulaire a été mis en suspension par un milieu DMEM sans sérum et on a ajusté les cellules souches mésenchymateuses à 0,4 χ 106 ~ 2.5 χ 107/ml.
Calcul de la viabilité cellulaire : Viabilité cellulaire (%) = nombre total de cellules vivantes / (nombre total de cellules vivantes + nombre total de cellules mortes) χ 100 % Calcul du rendement cellulaire : rendement cellulaire (%) = nombre total de cellules vivantes / nombre total de cellules vivantes d'origine x 100 %
Exemple 1 Criblage de l'alginate de sodium
Des poudres d'alginate de sodium de 200 mesh, 100 mesh et de 50 mesh sont formulées respectivement en solution à 1 %, 2 %, 3 % d'alginate de sodium. 3 % de diméthyle sulfoxyde, 5 % de propylène glycol, puis les cellules souches mésenchymateuses réanimées sont ajoutées dans la solution d'alginate de sodium formulée et bien mélangé, la formulation est placée dans un réfrigérateur à 4 °C. La viabilité cellulaire et le rendement cellulaire sont comparés à 0, 1,6 heures. Les résultats expérimentaux montrent que de l'alginate de sodium de 200 mesh est la taille la plus appropriée pour une survie cellulaire (Fig. 1).
Exemple 2 Criblage et optimisation de la formulation de gel
Afin d'optimiser la meilleure formulation de gel pour maintenir la viabilité cellulaire, les ingrédients de la formulation sont criblés un par un pour sélectionner la meilleure stratégie :
(1) Criblage de la concentration du gel en alginate de sodium
Une poudre d'alginate de sodium de 200 mesh est ajoutée à la solution de phosphate pour préparer une solution aqueuse d'alginate de sodium à 1 %, 2 %, 3 %, 4 % pour observer la clarté et la fluidité du gel. Les composants de solution de phosphate sont ici 0,02% de chlorure de potassium, 0,0047% de chlorure de magnésium, 0,158% de phosphate hydrogéné de di sodium, 0,020 % de phosphate dihydrogéné de sodium, 0,8 % de chlorure de sodium et de l’eau pour injection. Des gels d'alginate de sodium à 1 %,
2 % et 3 % montrent une bonne clarté, et le gel d'alginate de sodium à 4 % montre un problème d’insolubilité. La fluidité du gel a diminué avec l’augmentation de la concentration en alginate de sodium. Un gel d'alginate de sodium à 3 % montre la plus faible fluidité et la meilleure adhérence. Après synthèse des résultats de clarté et de la fluidité, de l'alginate de sodium à 3 % a en fin de compte été sélectionné.
(2) Criblage de la concentration de DMSO
L'expérience a été divisée en quatre groupes :
| Groupes | Composants | |||
| Alginate de sodium | Diméthyle sulfoxyde | Propylène glycol | Cellule souche mésenchymateuse | |
| 1 | 3 % | 0% | 5 % | + |
| 2 | 3 % | 1,5 % | 5 % | + |
| 3 | 3 % | 3 % | 5 % | + |
| 4 | 3 % | 10% | 5 % | + |
Les composants de chaque groupe sont soigneusement mélangés pour préparer les formulations de gel de cellules souches. Les formulations de gel de cellules souches avant d'être congelées sont prises comme échantillon de jour -1 pour un décompte et ensuite cryostockées toute la nuit. Trois formulations de gel de cellules souches sont prélevées à 1 heure, 6 heures et 24 heures après réanimation pour mesurer la viabilité cellulaire et le rendement cellulaire. Les résultats expérimentaux indiquent que du diméthyle sulfoxyde à
1,5 % et 3 % dans le gel avait une bonne protection vis-à-vis des cellules. Cette formule peut réduire le dosage de diméthyle sulfoxyde en partant du principe de protéger la viabilité cellulaire (Fig. 2).
(3) Criblage de la concentration de sérumalbumine humaine
L'expérience a été divisée en quatre groupes :
| Groupes | Composants | ||||
| Alginate de sodium | Diméthyle sulfoxyde | Propylèn e glycol | Sérumalbumine humaine | Cellule souche mésenchymateuse | |
| 1 | 3 % | 3 % | 5 % | 0% | + |
| 2 | 3 % | 3 % | 5 % | 0,5 % | + |
| 3 | 3 % | 3 % | 5 % | 1 % | + |
| 4 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | + |
Les composants ci-dessus sont soigneusement mélangés pour préparer une formulation de gel de cellules souches, et la formulation de gel de cellules souches a été prise comme le jour -1 pour un décompte avant d'être congelée. Les formulations de gel sont congelées à -80 °C utilisant la méthode de refroidissement non-programmé, puis 3 échantillons de formulation de gel sont réanimés aux jours 0, 1, 7 respectivement, pour détecter la viabilité cellulaire et le rendement cellulaire. Les résultats expérimentaux montrent que la sérumalbumine humaine peut mieux protéger les cellules congelées, et en fin de compte une concentration de 2 % est choisie comme la concentration de sérumalbumine humaine dans la formulation de gel. (Fig. 3).
(4) Sélection de polyphénols et de dextrane 10 1) Criblage de la concentration de polyphénol
L'expérience a été divisée en cinq groupes :
| Groupes | Composants | |||||
| Alginate de sodium | Diméthyle sulfoxyde | Propyl ène glycol | Sérum albumine humaine | polyphénol | Cellule souche mésenchymateuse | |
| 1 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 0% | + |
| 2 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 0,5 % | + |
| 3 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 1 % | + |
| 4 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 2% | + |
| 5 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 5 % | + |
Les composants ci-dessus de chaque groupe sont mélangés soigneusement pour préparer une formulation de gel de cellules souches, et la formulation de gel de cellules souches est prise comme le jour -1 pour un décompte avant d'être congelée. Les formulations de gel sont congelées à -80°C en utilisant la méthode de refroidissement non-programmé, puis 3 échantillons de formulation de gel sont réanimés aux jours 0, 1, 7 respectivement, pour détecter la viabilité cellulaire et le rendement cellulaire. Les résultats expérimentaux montrent que le polyphénol peut mieux protéger les cellules congelées, et en fin de compte une concentration de 2 % est choisie comme la concentration de polyphénols (Fig. 4).
2) Criblage de la concentration de dextran L'expérience a été divisée en cinq groupes :
| Groupes | Composants | |||||
| Alginate de sodium | Diméthyle sulfoxyde | Propylène glycol | Sérum albumine humaine | dextran | Cellule souche mésenchym ateuse | |
| 1 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 0% | + |
| 2 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 1 % | + |
| 3 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 2% | + |
| 4 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 3 % | + |
| 5 | 3 % | 3 % | 5 % | 2% | 6% | + |
Les composants ci-dessus sont mélangés soigneusement pour préparer une formulation de gel de cellules souches, et la formulation de gel de cellules souches est prise comme le jour -1 pour un décompte avant d'être congelée. Les formulations de gel sont congelées à -80 °C en utilisant méthode de refroidissement non-programmé, puis 3 échantillons de formulation de gel sont réanimés aux jours 0, 1, 7 respectivement, pour détecter la viabilité cellulaire et le rendement cellulaire. Les résultats expérimentaux montrent que le dextran peut mieux protéger les cellules congelées, et en fin de compte une concentration de 6 % est choisie comme la concentration de dextran (Fig. 5).
3) Utilisation combinée de polyphénol et dextran
L'expérience a été divisée en quatre groupes :
| Composants | Groupes | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Alginate de sodium | 3 % | 3 % | 3 % | 3 % |
| Diméthyle sulfoxyde | 3 % | 3 % | 3 % | 3 % |
| Propylène glycol | 5 % | 5 % | 5 % | 5 % |
| Sérumalbumine humaine | 2% | 2% | 2% | 2% |
| Cellule souche | + | + | + | + |
| polyphénol | - | - | + | + |
| dextran | - | + | - | + |
Les composants ci-dessus sont soigneusement mélangés. Douze formulations de cellules souches sont préparées dans chaque groupe. La formulation de gel de cellules souches est prise comme le jour -1 pour un décompte avant cryoconservation, puis congelée à -80°C avec la méthode de refroidissement non-programmé. Après les jours 0, 1, 7, une formulation de gel est ranimée dans chaque groupe respectivement, pour tester la viabilité et le rendement cellulaires. On peut voir d’après les résultats expérimentaux que la meilleure formule de gel pour maintenir la viabilité cellulaire est 3 % d'alginate de sodium, 3% de diméthyle sulfoxyde, 5% de propylène glycol, 2% de polyphénols, 6% de dextran, 2% d’albumine de sang humain (Fig. 6).
Exemple 3 Etude sur le taux de viabilité après réanimation et sur la stabilité à long terme de la formulation optimisée.
Afin d'étudier le taux de viabilité cellulaire après la réanimation et la stabilité à long terme de la formulation de la présente invention, la formule de gel témoin et la formule optimisée sont comparées. Ici, la formule de gel témoin est composée 3 % d'alginate de sodium, 3% de diméthyle sulfoxyde, 5% de propylène glycol, et la formulation de gel optimisée de la présente invention était composée 3 % d'alginate de sodium, 3% de diméthyle sulfoxyde, 5% de propylène glycol, 2% de polyphénols, 6% de dextran, 2% d’albumine de sang humain. La formulation de gel de cellules a été prise comme le jour -1 pour un décompte avant d'être congelée, et congelée à -80°C avec des méthodes de refroidissement non-programmé. Au jour 0, trois échantillons de gel de chaque groupe sontpris pour être réanimés, et ensuite placés à 4 C. 6 heures plus tard, la viabilité cellulaire et le rendement cellulaire sont mesurés. Après 7, 30 et 90 jours de cryoconservation, les trois échantillons de gel de chaque groupe sont pris pour être réanimés pour mesurer la viabilité cellulaire et le rendement cellulaire. Les résultats expérimentaux montrent que la formulation de la présente invention améliore la durée de vie des cellules après la réanimation, et accentue de manière significative la capacité de conservation à long terme, permettant de garder des cellules vivantes pendant une longue période dans des conditions sans azote liquide (Fig. 7).
Il
Exemple 4 Détection de viabilité de cellules souches mésenchymateuses dérivées de différents tissus dans des gels d’alginate de sodium
Les effets de deux formulations de gel sur la viabilité de cellules souches mésenchymateuses provenant de différents tissus sont comparés. La formule 1, 3 % d’alginate de sodium, 3% de diméthyle sulfoxyde, 5% de propylène glycol, 2% de polyphénols, 6% de dextran, 2% d’albumine de sang humain, et la formule 2, 3 % d’alginate de sodium, 3% de diméthyle sulfoxyde, 5% de propylène glycol, 5% de polyphénols, 10% de dextran, 1% d’albumine de sang humain sont préparées dans une solution de gel. Les solutions de gel sont mélangées avec des cellules souches mésenchymateuses dérivées de moelle osseuse, dérivées de cordon ombilical et dérivées de placenta, respectivement. Après mélange la solution de gel et les cellules souches mésenchymateuses sont congelées à -80°C conformément à la méthode de refroidissement non-programmé. Après 0, 1 et 15 jours de cryoconservation, la viabilité et le rendement cellulaire des échantillons de gel de chaque groupe sont respectivement détectés. Les résultats expérimentaux montrent que les deux formulations de gel d’alginate de sodium sont de bons supports pour des cellules souches mésenchymateuses provenant de divers tissus et peuvent maintenir l'activité de celles-ci (Fig. 8).
Exemple 5 Détection de la viabilité cellulaire dans une formulation de gel après cryoconservation à long terme
Les effets de deux formulations de gel sur la stabilité cellulaire sont comparés. La formule 1,3% d’alginate de sodium, 3% de diméthyle sulfoxyde, 5% de propylène glycol, 2% de polyphénols, 6% de dextran, 2% d’albumine de sang humain, et la formule 2, 3 % d’alginate de sodium, 3% de diméthyle sulfoxyde, 5% de propylène glycol, 5% de polyphénols, 10% de dextran, 1% d’albumine de sang humain, sont respectivement préparées en solutions de gel. Après mélange la solution de gel et les cellules souches mésenchymateuses, sont congelées à -80°C avec la méthode de refroidissement non-programmé. Aux 0e, 1er, 3e, 6e, 15e et 18e mois, trois formulations de gel de cellules sont prises pour détecter la viabilité cellulaire, le rendement cellulaire, le phénotype et la capacité de différenciation, respectivement. Les résultats expérimentaux montrent que ces deux formulations de gel de cellules peuvent être stockées à -80 °C pendant 18 mois avec stabilité (Fig. 9).
Exemple 6 Effet thérapeutique de la formulation de gel de cellules de la présente invention sur des lésions cutanées de rat
Des modèles de rat à lésions cutanées sont construits, et chaque rat présente deux plaies. Les modèles de rat sont divisés en quatre groupes, incluant un groupe à blanc, un groupe à dose élevée (3 x 106 cellules), un groupe à dose moyenne (1 x 106) et un groupe à dose faible (0,2 x 106). La taille des plaies est mesurée tous les 3 à 4 jours pour comparer le degré de rétablissement de plaie de chaque groupe. Les résultats montrent que le gel de cellules a commencé à fonctionner le troisième jour, et la vitesse de guérison de plaie est plus rapide que celle du groupe témoin à blanc, ce qui suggère qu’une formulation de gel de cellules peut favoriser une cicatrisation de plaie d'une manière dépendante de la dose (Fig. 10).
Claims (10)
- Revendications1. Formulation de gel pour maintenir la viabilité de cellules cryoconservées, comprenant les composants suivants en pourcentage en masse : 1 %-3 % d’alginate de sodium, 1 %-5 % de diméthyle sulfoxyde, 1 %-5 % de propylène glycol, 1 %-5 % de polyphénol, 2 %-10 % de dextran, 1 %-5 % de sérumalbumine humaine, et de l’eau ou une solution saline d'acide phosphorique supplémentaire.
- 2. Formulation de gel selon la revendication 1, dans laquelle la formulation de gel comprend : 3 % d’alginate de sodium, 3 % de diméthyle sulfoxyde, 5 % de propylène glycol, 2 % polyphénol, 6 % de dextran, 2 % de sérumalbumine humaine, et de l’eau ou une solution saline d'acide phosphorique supplémentaire ;dans laquelle, la solution saline d’acide phosphorique est constituée de 0,02 % de chlorure de potassium, 0,0047% de chlorure de magnésium, 0,1158% de phosphate hydrogéné de disodium, 0,020 %, de phosphate dihydrogéné de sodium, 0,8 % de chlorure de sodium et de l'eau pour injection.
- 3. Formulation de gel selon la revendication 1, dans laquelle l'alginate de sodium a une viscosité de 600 à 1 000 cps et une taille de particule de 200 mesh, et la formulation de gel a un pH de 6,5 à 7,5.
- 4. Formulation de gel de cellules souches, comprenant des cellules souches mésenchymateuses qui ne sont pas des cellules souches humaines embryonnaires et la formulation de gel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
- 5. Formulation de gel de cellules souches selon la revendication 4, dans laquelle il y a entre 0,5 x 106 et 3 χ 106 cellules souches mésenchymateuses pour 1 ml de la formulation de gel.
- 6. Formulation de gel de cellules souches selon la revendication 5, dans laquelle les cellules souches mésenchymateuses sont dérivées d’un tissu ombilical, placentaire ou amniotique.
- 7. Formulation de gel de cellules souches selon la revendication 4, dans laquelle les cellules souches peuvent être stockées pendant 18 mois sous des conditions de -80 °C à -60 °C par refroidissement non programmé, et après réanimation de la formulation de gel de cellules souches, la viabilité cellulaire de celles-ci est aussi élevée que plus de 90 %, et lorsque les cellules souches réanimées sont stockées à 4 °C pendant 6 heures, la viabilité cellulaire de celles-ci est aussi élevée que plus de 80 %.
- 8. Méthode de préparation de la formulation de gel de cellules souches selon la revendication 4, comprenant à la suite les étapes suivantes consistant à : (1) dissoudre et faire gonfler de la poudre d'alginate de sodium dans de l'eau ultra pure ou une solution de phosphate à la température ambiante pendant 24 à 48 heures ; (2) remuer le mélange jusqu'à homogénéité ; et ajouter les composants restants dans le mélange pour formuler la5 formulation de gel selon la revendication 1 ; (3) laisser reposer la formulation de gel obtenue à l'étape (2) pendant un certain temps, puis ajouter des cellules souches mésenchymateuses qui ne sont pas des cellules souches humaines embryonnaires dans celle-ci ; (4) mélanger uniformément, et la formulation de gel riche en cellules de cellules souches selon la revendication 4 est préparée.
- 10 9. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle l'alginate de sodium a une viscosité de 600 à 1 000 cps et une taille de particule de 200 mesh, et la formulation de gel a un pH de 6,5 à 7,5.10. Utilisation de la formulation de gel de cellules souches selon la revendication 4 pour la préparation de médicaments pour le traitement d’une blessure cutanée ou d’une
- 15 lésion mucosale.30571/4Viabilité cellulaire100.00%00-00%80.00%70.00%60.00%50.00%Temps (heure)50 mesh1%50 mesh2%50 mesh3%1ÜOmeshl%10Omesh2%10Gmesh3%20Omesh1%2Q0mesh2%200mesh3%
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