LU85582A1 - Fractions d'acide hyaluronique ayant une activite pharmaceutique,procedes pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

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Description

s s
FRACTIONS D'ACIDE HYALURONIQUE AYANT UNE ACTIVITE PHARMACEUTIQUE, PROCEDES POUR LEUR PREPARATION ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
LES CONTENANT
• 5 L'invention concerne des fractions de poids moléculaire spécifique d'acide hyaluronique (désigné ci-après sous le nom "HA") présentant des applications thérapeutiques et qui sont non inflammatoires. L'une des fractions de HA selon l'invention est utile pour faciliter la guérison des plaies, tandis que la seconde fraction de HA possède une application 10 intra-occulaire, et peut se substituer aux fluides endobulbaires ou ‘y s'utiliser en injection intra-articul aire pour le traitement des articulations osseuses endommagées. Les fractions de HA se sont encore révélées utiles en tant que véhicule pour médicaments à applications ophtalmiques, procurant des formulations compatibles avec l'épithélium 15 cornéen et améliorant l'activité des médicaments ophtalmiques.
L'acide hyaluronique est un hétéropolysaccharide existant à l'état naturel constitué de résidus alternés d'acide D-glucoronique et de N-acêtyl-D-glucosamine. Le HA est un polymère linéaire de poids molécu-* Taire élevé, généralement d'environ 8 à 13 millions, et on le trouve 20 dans la revêtement des cellules, la substance de base extra-cellulaire 4 des tissus conjonctifs des vertébrés, dans le fluide synovial des articulations, dans les fluides endobulbaires de l'oeil, dans le tissu du cordon ombilical humain et dans les crêtes de coqs.
Des études antérieures sur l'utilisation du HA sont décrites dans r? 25 les travaux de Balazs, (brevet des Etats Unis d'Amérique n° 4 141 973) décrivant une fraction de HA utile au remplacement des fluides endobul-;t baires aussi bien qu'à d'autres applications thérapeutiques. Ce brevet est, cependant, dirigé spécifiquement vers une fraction de HA ayant un poids moléculaire moyen supérieur à environ 750 000 et de préférence 30 supérieur à environ 1 200 000. Balazs enseigne, spécifiquement, que des fractions de HA ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 750 000 ne ί 2 sont pas utilisables en thérapeutique à cause de leur activité inflammatoire. Ces fractions de HA, de poids moléculaire inférieur, sont rejetées par Balazs. Cependant, ceci revient à rejeter environ 90% de la quantité totale de HA disponible susceptible d'être obtenue à partir des s 5 tissus, et revient à utiliser seulement une faible quantité (environ 10%) du HA disponible.
Contrairement aux enseignements de Balazs, la demanderesse a découvert que les fractions de HA de poids moléculaire inférieur ont, en fait, une activité pharmaceutique utile. Ainsi, selon la présente 10 invention, environ 80% du HA que l'on peut obtenir à partir de diverses sources sont utilisés. En particulier, la demanderesse a découvert une fraction de HA qui est utile à la stimulation de la guérison des plaies, et une seconde fraction de HA qui est utilisable en injection intra-occu-laire, et peut se substituer aux liquides endobulbaires de l'oeil et est 15 utilisable en injections intra-articulaire pour le traitement des articulations endommagées.
La figure 1 est une courbe montrant les différentes fractions ~ d'acide hyaluronique qui ont été identifiées par la demanderesse.
Comme discuté ci-dessus, les études antérieures sur le HA telles .
^ 20 que par exemple celles du brevet de Balazs ont été orientées vers l'utilisation de fractions de poids moléculaires élevés ayant un poids moléculaire moyen supérieur à 750 000. La demanderesse a isolé et caractérisé deux nouvelles fractions de HA, l'une ayant un faible poids moléculaire et l'autre ayant un poids moléculaire moyen, qui sont 25 considérées comme étant sensiblement pures et n'ayant pas d'activité inflammatoire. Ces nouvelles fractions de HA peuvent être obtenues à partir de divers tissus conjonctifs qui contiennent des quantités extractibles d'acide hyaluronique. Les fractions spécifiques du produit selon l'invention sont différenciées et séparées selon des techniques de 30 filtration moléculaire.
La première fraction isolée a été nommée "hyalastine" et elle a un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à environ 100 000. Cette fraction de hyalastine a été déterminée comme pouvant convenir en utilisation thérapeutique, vétérinaire et humaine à cause de son acti-35 vité de guérison des plaies. La seconde fraction isolée à été dénommée "hyalectine" et elle a un poids moléculaire moyen d'environ 500 000 à environ 730 000. Cette fraction de hyalectine est susceptible d'être utilisée dans la chirurgie occulaire en tant que substitut des liquides
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3 endobulbaires et dans les thérapeutiques vétérinaire et humaine des traumatismes et maladies dégénératives des articulations.
La hyalastine peut être administrée soit en injection intradermique, soit en application topique pour la guérison des plaies. La hyalec-r 5 tine, d'autre part, convient aux injections intra-occulaire et intra-arti-culaire.
La demanderesse a procédé à des études importantes sur les diver-ses fractions de HA et elle a, de façon significativement plus précise qu'auparavant, déterminé de façon spécifique les fractions thérapeu- 10 tiquement utiles de HA et les fractions inflammatoires et non utiles de HA. Ces études ont eu, pour résultats, de permettre l'identification et l'investigation de deux caractéristiques spécifiques des fractions de HA, â savoir l'activité mobilisatrice des cellules et la viscosité intrinsèque. Le processus de guérison des plaies chez les animaux est 15 facilité par la mobilisation cellulaire et, particulièrement, la mobilisation des fibroblasts. D'autre part, la mobilisation cellulaire ou l'activité de prolifération (c'est-à-dire la mitose) doit être évitée e dans les cas de chirurgie à l'intérieur du globe occulaire. Ceci est particulièrement vrai dans les opérations destinées à corriger le . 20 décollement de la rétine oü une vitesse accrue de cicatrisation pourrait avoir des effets nocifs.
La viscosité intrinsèque est également un paramètre important à considérer dans la détermination de l'utilité d'une fraction de HA. Une fraction ayant une viscosité intrinsèque élevée est utile en chirurgie — 25 pour le traitement des traumatismes et des maladies dégénératives des articulations et dans le remplacement des liquides endobulbaires.
D'autre part, une viscosité élevée est une caractéristique indésirable des fractions destinées à être utilisées comme médicament pour faciliter la cicatrisation des plaies. En fait, les fractions à utiliser dans la 30 cicatrisation des plaies doivent avoir une faible viscosité de façon à être plus facilement utilisées dans l'application pratique.
Il a été constaté que la fraction de hyalastine identifiée par la demanderesse présente une bonne activité de mobilisation ou de prolifération des cellules et des caractéristiques de faible viscosité. Par " 35 conséquent, la hyalastine présente les caractéristiques souhaitables pour une matière suivant à favoriser la cicatrisation des plaies.
Les mêmes caractéristiques rendent la fraction de hyalastine
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c 4 indésirable pour les traitements comprenant une injection intra-occu-lai res ou intra-articulaires.
Il a été en outre constaté que la fraction de hyalectine identifiée par la demanderesse présente une activité de mobilisation des = 5 cellules ou de prolifération négligeable, tandis que, en même temps, elle possède une viscosité élevée. Ces caractéristiques rendent donc la , fraction de hyalectine utile pour des traitements demandant des injections intra-occulaires ou intra-articulaires. Mais, d'autre part, la hyalectine ne peut convenir pour les traitements de cicatrisation des plaies 10 car cette fraction ne présente pas d'activité de mobilisation des cellules.
Lorsque l'on isole des fractions utiles d'acide hyaluronique, il est également important d'obtenir ces fractions qui n'aient pas d'activité inflammatoire. Le brevet de Balazs indiqué ci-dessus enseigne qu'en 15 vue d'obtenir des fractions d'acide hyaluronique sans activité inflammatoire, on doit utiliser exclusivement des fractions ayant un poids moléculaire moyen de plus de 750 000. Ainsi, Balazs rejette les frac-- tions ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 750 000 comme étant non utiles à cause de leur activité inflammatoire. Contrairement aux -, 20 enseignements de Balazs, la demanderesse a trouvé que l'activité inflam matoire attribuée par Balazs aux fractions ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 750 000 était en fait due â des impuretés ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 30 000. Ainsi, la présente invention procure une méthode qui comprend en une série de techniques de filtra-25 tion moléculaire associées à des méthodes chimiques permettant l'élimination des fractions inflammatoires ayant un poids moléculaire inférieur à 30 000.
Par les méthodes selon l'invention, il est possible d'obtenir des fractions utiles d'acide hyaluronique n'ayant pas d'activité inflamma-30 toire et qui, lorsqu'on les considère ensemble, constituent un rendement total d'environ 80% de l'acide hyaluronique total disponible à partir des matières de départ particulières. Ce rendement de 80% en acide hyaluronique disponible comprend une fraction combinée qui est une combinaison des fractions de hyalectine et de hyalastine et qui a un poids 35 moléculaire moyen d'environ 250 000 à environ 350 000. Plus spécifiquement, la fraction de hyalectine est obtenue avec un rendement d'environ 30% du HA disponible et la fraction de hyalastine est obtenue avec un rendement d'environ 50% du HA disponible à partir des tissus de départ.
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Ce facteur représente un amélioration importante par rapport au procédé du brevet de Balazs discuté ci-dessus en ce sens que la demanderesse a découvert que des quantités siginificativement accrues de l'acide hyaluronique disponible étaient pharmaceutiquement utiles. En n'utili-5 5 sant que la fraction ayant un poids moléculaire moyen supérieur à 750 000, v le procédé de Balazs ne conduit qu'à un rendement d'environ 10% par * rapport à l'acide hyaluronique original obtenu à partir des organes animaux et il rejette environ 90% de l'acide hyaluronique disponible. Ainsi, selon la présente invention, l'emploi de l'extrait hyaluronique 10 total est grandement augmenté.
Une comparaison des rendements relatifs de l'extraction des diverses fractions d'acide hyaluronique est présentée ci-dessous dans le tableau I.
TABLEAU I
15 --- type d'acide g par 100 g % rêfêï.ence hyaluronique de tissu frais acide hyaluronique « 20 total à partir de crêtes de coqs 0,08 100 Swann D.A. 1968
Biochim, Biophys.
Acta 156, 17-29 HA (type Balazs) 0,08 10 brevet U.S.
25 n° 4 141 973 hyalectine + hamastine 0,6 80 présente invention hyalectine 0,2 30 présente invention hyalastine 0,4 50 présente invention fraction inflammatoire 0,16 20 présente invention 30 ------
La figure 1 représente, graphiquement, les différentes fractions - de HA que la demanderesse a identifiée. La courbe, en traits pleins, en forme de cloche de la figure 1, représente la distribution approximative des fractions de HA disponibles à partir d'un tissu de départ. La zone 35 "B" de la figure 1 représente la fraction de HA identifiée par Balazs dans le brevet des Etats Unis d'Amérique n° 4 143 973 comme étant utile en pharmacie. Les zones "A", I et II dans la figure 1 sont les fractions
V
ir 6 identifiées par la demanderesse, la zone A étant la fraction inflammatoire ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 30 000; la zone I étant la fraction de hyalastine et la zone II étant la fraction de hyalectine. A partir de cette courbe, on peut voir que la méthode de ‘ 5 Balazs rejette la grande majorité du HA extractible disponible en y, éliminant les fractions de HA ayant un poids moléculaire moyen inférieur . à 750 000. La présente invention, d'autre part, permet l'utilisation en pharmacie d'une proportion importante du HA disponible puisque la fraction d'acide hyaluronique de poids moléculaire faible ayant un poids 10 moléculaire moyen inférieur à 30 000 occasionne l'activité inflammatoire que les chercheurs précédents avaient constatée avec divers extraits de HA.
La demanderesse a découvert qu'un pourcentage important de HA disponible pouvait, en fait, être utilisé à des fins thérapeutiques si 15 on opérait la séparation selon les enseignements de la présente invention en fonction de l'application thérapeutique particulière. Tandis que le brevet de Balazs enseigne de façon spécifique l'utilisation de c seulement 10¾ environ du HA disponible, la présente invention permet l'utilisation d'environ 80¾ du HA disponible, soit sous la forme de la 20 fraction de hyalastine pour les applications de cicatrisation des plaies, soit sous la forme de la fraction de hyalectine pour les applications intra-occulaires et intra-articulaires, soit sous la forme d'une fraction combinée de hyalastine et de hyalectine qui peut aussi être utilisée pour des applications de cicatrisation des plaies.
25 Les caractéristiques chimiques et physiques des fractions identi fiées ont également été étudiées par la demanderesse et ces caractéristiques sont résumées sur le tableau 2.
METHODES DEPREPARATION
EXEMPLE 1 - Procédé d'obtention d'un mélange de fractions de hyalastine 30 et de hyalectine sans activité inflammatoire.
Des crêtes de coqs, soit fraîches, soit congelées (3 000 g) sont émincées dans un hachoir à viande et elles sont ensuite soigneusement homogénéisées dans un homogénëiseur mécanique. La pâte qui en résulte est placée dans un récipient en acier inoxydable AISI 316 ou dans un 35 récipient en verre en même temps que 10 volumes d'acétone anhydre. Le contenu total est ensuite agité pendant 6 heures à une vitesse de 50 g/mn et on le laisse la séparation se poursuivre pendant 12 heures, puis élimine l'acétone par siphonnage et le rejète.
î 7
Ce procédé d'extraction est répété jusqu'à ce que l'acétone rejetée ait atteint le niveau d'humidité correct (méthode de Karl-Fisher) .
La substance qui en résulte est alors centrifugée et séchée sous ? 5 vide à une température convenable pendant 5 à 8 heures. Avec ce procédé, ^ on obtient approximativement 500 à 600 g de poudre sèche à partir des crêtes de coqs.
300 g de la poudre sèche sont alors soumis à un processus de digestion enzymatique avec de la papaïne (0,2 g) dans un milieu aqueux 10 tamponné avec un tampon de phosphate en présence d'une quantité convenable de chlorhydrate de cystéine. Ce mélange est alors agité pendant 24 heures à 60 g/mn et à une température constante de 60 à 65°C. La masse entière est refroidie à 25°C, on ajoute 60 g de Célite (R) et l'agitation est maintenue pendant encore une heure.
15 TABLEAU 2
CARACTERISTIQUES CHIMIQUES ET PHYSIQUES
--!---- ^ viscosité titre en acide teneur dans les teneur en muco- dynamique hyaluronique en protéines polysaccharides on Fractions P.M. , J , , „ , uv a 20 C % de poudre calculée en sulfures sèche albumine bovine hyalastine + 2g hyalectine 250.000-350.000 100 mP.s (conc. 1% p/v) >96%a <0,5% <1% hyalastine 50.000-100.000 600 mP.s (conc. 5% p/v) >96% <0,5% <1% hyalectine 500.000-730.000 170 mP.s 30 (conc. 1% p/v) >96% <0,5% <1% a les valeurs consignées représentent le titre en HA après élimination dans l'eau.
Par exemple, un titre de 96% indique que, après élimination d'eau, la poudre contient 4% d'impuretés et 96% d'acide hyaluronique.
35 Le mélange qui en résulte est filtré jusqu'à obtention d'un liqui de clair. Ce liquide clair subit, ensuite, une filtration moléculaire au moyen de membranes ayant une limite d'exclusion moléculaire de 30 000 pour retenir, sur la membrane, les molécules ayant un poids moléculaire 8 te supérieur à 30 000. Cinq à six volumes sont ultra-filtrës à l'origine et, en même temps, de l'eau distillée est continuellement ajoutée au produit. L'addition d'eau distillée est suspendue et le produit est ultra-filtrê jusqu'à ce qu'il soit réduit à un tiers de son volume : 5 original.
Le résidu liquide est rendu 0,1M par addition de chlorure de sodium et la température est portée à 50°C. 45 g de chlorure de céthyl-pyridinium sont ajoutés tandis que le produit est agité à 60 g/mn. Ce mélange est agité pendant 60 minutes, et ensuite on ajoute 50 g de 10 Célite^ sous agitation, la température du produit est ramenée à 25°C et le précipité formé est recueilli par centrifugation. Le précipité ainsi obtenu est mis en suspension dans une solution de 0,01M de chlorure de sodium (5 litres) contenant 0,05% de chlorure de cëthylpyri-dinium. On l'agite encore pendant 60 minutes à 50°C. La température est 15 abaissée à 25°C et le précipité est centrifugé.
Le processus de lavage est alors répété trois fois et le précipité est finalement rassemblé dans des récipients contenant trois litres ~ d'une solution 0,05M de chlorure de sodium contenant 0,05% de chlorure de cêthylpyridinium. On agite à 60 g/mn pendant 60 minutes et on main-r 20 tient une température constante de 25°C pendant une période de deux heures. Le produit surnageant est éliminé par centrifugation.
Ce mode opératoire est alors répété plusieurs fois avec une solution de chlorure de sodium 0,1M contenant 0,05% de chlorure de cêthylpyridinium. Le mélange est centrifugé et ce.qui surnage est 25 rejeté. Le précipité est dispersé dans une solution de chlorure de sodium 0,30M contenant 0,05% de chlorure de cêthylpyridinium (3 litres). Le mélange est agité et l'on recueille à la fois le précipité et le liquide clair. L'extraction est répétée sur le précipité encore trois fois en utilisant chaque fois 0,5 litre de la même solution aqueuse.
30 Finalement, le précipité résiduel est éliminé et les liquides clairs sont rassemblés dans un récipient unique. On augmente la température du liquide à 50°C tout en agitant. Le liquide est alors porté à 0,23M avec du chlorure de sodium. On ajoute 1 g de chlorure de chlorure de cêthylpyridinium et l'agitation est maintenue pendant 12 heures. Le 35 mélange est refroidi à 25°C et il est ensuite filtré tout d'abord à travers des garnissages de ce Célite^ et ensuite à travers un filtre (1U).
* * 9
Le mélange qui en résulte subit alors une ultrafiltration moléculaire supplémentaire à travers des membranes ayant une limite d'exclusion moléculaire de 30 000, en ultrafiltrant 3 volumes originaux avec addition d'une solution de chlorure de sodium 0,33M. L'addition de la - 5 solution de chlorure de sodium est interrompue et le volume de liquide est réduit à un quart de son volume original.
La solution ainsi concentrée est précipitée sous agitation (60 g/mn) à une température de 25°C avec trois volumes d'éthanol (95%). Le précipité est recueilli par centrifugation et ce qui surnage est rejeté. Le 10 précipité est dissous dans un litre de solution de chlorure de sodium Û,1M et le processus de précipitation est répété avec trois volumes d'éthanol à 95%.
Le précipité est recueilli et lavé, tout d'abord avec de l'éthanol à 75% (trois fois), ensuite de l'éthanol absolu (trois fois) et troisiè-15 mement avec de l'acétone absolue (trois fois).
Le produit ainsi obtenu (fraction de hyalastine + hyalectine) a un poids moléculaire moyen compris entre 250 000 et 350 000.
- Le rendement en acide hyaluronique est égal à 0,6% du tissu frais original.
20 EXEMPLE 2 - Méthode d'obtention de la fraction de hyalastine à partir du mélange obtenu par la méthode décrite dans l'Exemple 1.
Le mélange obtenu par la méthode décrite dans l'Exemple 1 est dissous dans une eau distillée exempte de pyrogène en proportion de 10 mg de produit par ml d'eau. La solution ainsi obtenue subit une 25 ultrafiltration moléculaire à travers une membrane ayant une limite d'exclusion moléculaire de 200 000 avec une technique de concentration et sans addition d'eau sur la membrane. Durant le processus de filtration à travers les membranes ayant une limite d'exclusion de 200 000, les molécules ayant un poids moléculaire supérieur- à 200 000 ne passent 30 pas tandis que les molécules plus petites passent à travers la membrane en même temps de l'eau. Pendant le processus de filtration, on n'ajoute pas d'eau dans le compartiment situé au-dessus de la membrane; de ce fait, le volume dans ce compartiment diminue et il se produit en même temps une augmentation de la concentration des molécules ayant un poids 35 moléculaire supérieur à 200 000. On procède alors à une ultrafiltration jusqu'à ce que le volume sur la membrane soit réduit à 10% du volume initial. Deux volumes d'eau bi-distillée exempte de pyrogène sont ajoutés et la solution est, de nouveau, ultrafiltrëe jusqu'à ce que le * 10 volume soit réduit à un tiers. L'opération est répétée encore deux fois.
La solution qui passe à travers la membrane est portée à 1,0M avec du chlorure de sodium et elle est ensuite précipitée avec quatre volumes d'éthanol à 95¾. Le précipité est lavé trois fois avec de l'éthanol à 5 75¾ et est ensuite séché sous vide.
^ Le produit ainsi obtenu (fraction de hyalastine) a un poids - moléculaire moyen compris entre 50 000 et 100 000.
Le rendement en acide hyaluronique est égal ä 0,4¾ du tissu frais original.
10 EXEMPLE 3 - Méthode d'obtention de la fraction de hyalectine.
La solution concentrée, rassemblée dans un récipient à partir de la membrane d'ultrafiltration ayant une limite d'exclusion moléculaire de 200 000 décrite dans l'Exemple 2, est diluée avec de l'eau jusqu'à ce que l'on obtienne une solution contenant 5 mg/ml d'acide hyaluronique 15 telle que déterminée par une analyse quantitative basée sur un essai de l'acide glycuronique.
La solution est portée à 0,1M dans le chlorure de sodium et elle est ensuite précipitée avec 4 volumes d'éthanol à 95¾. Le précipité est lavé trois fois avec de l'éthanol à 75¾ et il est ensuite séché sous " 20 vide.
Le produit ainsi obtenu (fraction de hyalectine) a un poids moléculaire moyen compris entre 500 000 et 730 000. Ceci correspond à une fraction d'acide hyaluronique spécifique ayant une longueur de chaîne moléculaire définie d'environ 250 000 à 350 000 motifs saccha-25 rides avec un degré de pureté élevé.
Le rendement en acide hyaluronique est égal à 0,2¾ du tissu frais original.
EVALUATION DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE ET PHARMACOLOGIQUE
1.- Activité biologique de la mobilisation cellulaire des fractions 30 d'acide hyaluronique
La méthode consistant en la détermination de l'activité de dëtache-î ment des fibroblasts dans une culture, est utilisée comme méthode d'évaluation de l'activité de mobilisation des cellules des fractions de t HA.
35 Des cellules de souris BALB 3T3 sont cultivées sur un milieu de
Dulbecco modifié Eagle avec du sérum de veau à 10¾, de la pénicilline (250 unités/ml) et de la streptomycine (0,25 mg/ml), et elles sont incubées dans 5¾ de CO2 humidifié, 95¾ d'air à 37°C. A des fins expéri- * 11 * mentales, des cellules sont inoculées de façon classiques dans des boites de culture de tissu en plastique d'un diamètre de 60 mm (6 x 10® cellules/boîte).
Des monocouches confluentes de cellules 3T3 sont décantées et l'on 5 5 ajoute du milieu frais contenant 2,0 mg/ml de différentes fractions de * HA. A des intervalles fixes, le détachement des cellules est observé à - la fois au microscope et par comptage des cellules mobilisées dans un compteur de Coulter.
Essais de détachement 10 Pour mesurer la cinétique du détachement, des cellules sont inoculées dans des boites de plastique et on les laisse se développer pendant 24 heures. Après ce laps de temps, le milieu de culture est décanté et du milieu frais contenant 2,0 mg/ml de HA est ajouté. Toutes les 24 heures, deux boites, une de culture test et une de culture 15 témoin, sont décantées et à la fois les cellules se trouvant dans le surnageant et les cellules liées sont comptées dans un compteur de Coulter. Le tableau 3 donne les résultats obtenus avec des test utilisant les fractions obtenues dans les exemples de préparation 1 ä 3 ci-dessus.
20 TABLEAU 3 Résultats des études de mobilisation
Nombre de cellules % d'efficacité Concentration détachées par (par comparaison 25 Fraction (mg/ml) comparaison avec avec les témoins) 1 es têmoi ns témoin 2 x 10® hyalectine+hyalastine 2 3,5 x 10® 75 30 hyalectine 2 2,1 x 10® 5 hyalastine 2 5 x 10® 150
k-1 ..................................â- —.....------------- I
Les données indiquées sur le tableau 3 montrent que la fraction de hyalastine manifeste une activité de mobilisation de cellules élevée ce 35 qui rend cette fraction utile aux applications de cicatrisation des plaies. Cette activité de mobilisation des cellules de la hyalastine stimule la migration et la prolifération des nouvelles cellules lorsqu'une préparation pharmaceutique de la fraction est appliquée à une zone de tissu endommagée.
9 12 *
La fraction de hyalectine manifeste une activité très limitée de mobilisation des cellules et elle n'est donc par conséquent pas utile pour la cicatrisation des plaies. Cependant, la hyalectine, à cause de son poids moléculaire moyen élevé et de sa viscosité inhérente, est 5 utile pour les injections occulaires et intra-articulaires, et le manque d'activité appréciable de mobilisation des cellules est une caractëris-- tique importante de la fraction d'hyalectine qui la rend spécialement utile pour les injections intra-occulaires et intra-articulaires.
2.- Activité inflammatoire biologique des fractions d'acide hyaluronique 10 Pour cette évaluation, on utilise la méthode du comptage des cellules envahissantes après administration intra-occulaire chez le lapin.
Méthode
Cinq (5) lapins de Nouvelles Zëlandes ou de Californie pesant 15 environ 2 kg, ayant une vision considérée comme parfaite, sont utilisés pour ce test. L'extérieur de l'oeil des lapins est vérifié pour les processus inflammatoires au niveau macroscopique et l'intérieur de l'oeil est vérifié à Vophtalmoscope. Si le fond de l'oeil est clairement visible et normal, le test peu avoir lieu.
20 Les animaux sélectionnés subissent une anesthésie locale par instillation de quelques gouttes d'un anesthésique stérile convenant en ophtalmologie, on instille également quelques gouttes d'atropine en solution ophtalmologique.
Le test est mis en oeuvre dans des conditions stériles. On fait 25 ressortir le globe occulaire en exerçant une pression jusqu'à ce qu'il soit possible d'injecter, à travers la sclérotique à environ 5 à 6 mm du bord de la cornée, au centre de l'humeur vitrée, 100 μΐ de la solution à l'aide d'une aiguille de 266. L'autre oeil est pris comme témoin. On instille deux gouttes de solution d'antibiotique dans l'oeil traité et 30 les animaux sont alors placés seuls dans des cages.
Après 50 à 60 heures, le test peut continuer. Les yeux sont ç vérifiés de la même façon que ci-dessus pour la sélection des animaux.
=, Les animaux sont sacrifiés avec une injection intra-veineuse de pento- thal. Ensuite, l'humeur aqueuse est, tout d'abord, recueillie (environ · 35 0,2 ml) au moyen d'une seringue à insuline avec une aiguille 26G. Les globes occulai res sont ensuite énuclés, débarrassés de toute matière étrangère, lavés dans une solution saline, séchés sur papier, incisés et ouverts dans des boîtes de Pétri; on sépare la partie principale de * » 13 l'humeur vitrée et on la rassemble avec une seringue stérile (environ 0,7 ml). L'humeur vitrée est placée dans des petits tubes à essai de poléthylène et l'on ajoute 50 μΐ de hyaluronidase (100 U NF/ml). Le mélange est alors maintenu à une température de 37°C pendant environ 53 heures pour rendre la solution moins visqueuse.
Un comptage de leucocytes est effectué au microscope à contraste i de phase (120 X) dans une chambre de Burker. Une série de comptage est effectuée sur chaque échantillon, on calcule les valeurs moyennes et l'on exprime le résultat en nombre de leucocytes par mm3.
10 Le test est considéré comme positif lorsque: 1. - les yeux examinés ne montrent pas de signe de dommage, et 2. - le nombre moyen de leucocytes provenant d'au moins quatre des cinq yeux traités n'excède pas 200 par mm3 et le nombre moyen _____ de leucocytes provenant de chaque oeil témoin n'excède pas 50 15 par mm3.
Le tableau 4 indique les résultats obtenus à partir de cette évaluation en utilisant les fractions de HA obtenues dans les exemples de préparation 1 à 3 discutés ci-dessus.
TABLEAU 4 20 Résultats des études d'activité inflammatoire
Fraction Nombre de cellules envahissantes . témoin 25 25 . hyalastine + hyalectine 32 . hyalastine 20 . hyalectine 22 . fraction inflammatoire (PM moyen de 30 000) 150 30 . acide hyaluronique total provenant de crêtes de coqs (RF. Swann D.A.
1968, B.B.A. 156, 17-29) 120
Les résultats indiqués sur le tableau 4, indiquent que les frac-35 tions de hyalastine et de hyalectine ne manifestent pas d'activité inflammatoire supérieure à celle du témoin et la fraction combinée de hyalastine et hyalectine montre seulement une augmentation négligeable de l'activité inflammatoire par rapport au témoin. Par conséquent, les » .
14 fractions de hyalastine et hyalectine sont pharmaceutiquement utiles sans manifester d'effets secondaires inflammatoires indésirables. Ces résultats confirment, également, encore la découverte de la demanderesse que c'est la fraction de HA ayant un poids moléculaire moyen faible 5 inférieur à 30 000 qui est responsable de l'activité inflammatoire des ^ préparations de HA. L'acide hyaluronique provenant des crêtes de coqs t préparées selon la méthode décrite dans la littérature par Swann (Swann D.A., 1968, B.B.A. 156, 17-29) présente une remarquable activité inflammatoire.
10 II a été ainsi démontré que la fraction de hyalastine ayant un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à 100 000 manifeste une activité de mobilisation des cellules élevée et qu'elle est, par conséquent, utile dans les applications de cicatrisation des plaies sans manifester de réactions inflammatoires indésirables. La fraction de hyalectine 15 ayant un poids moléculaire moyen d'environ 500 000 à 730 000 a été démontrée comme étant utile pour faire des injections occulaire et intra-occulaires à cause de son poids moléculaire élevé et de sa viscosité inhérente et parce que, en même temps, elle ne stimule pas l'activité de mobilisation des cellules ou les réactions inflammatoires qui 20 sont des effets secondaires indésirables à éviter dans ces applications pharmaceutiques.
Plus spécifiquement, on a trouvé que la fraction de hyalastine était utile comme préparation de cicatrisation des plaies à cause des caractéristiques suivantes: 25 1. la préparation favorise un temps de cicatrisation remarqua blement raccourci par comparaison aux thérapeutiques classiques, l'assainissement de la zone affectée étant rapide, une régularisation des bordures des ulcères, un développement vigoureux des tissus de granulation, une activation de la 30 migration cellulaire des macrophages et des fibroplasts et une épithélisation précoce.
v 2. la préparation favorise une préparation accélérée de la > chirurgie reconstructive dans les cas plus sévères.
3. absence de formation de kéloide ou de cicatrice de rétraction 35 avec remise en forme finale du tissu cicatriciel procurant de bons résultats esthétiques et fonctionnels.
On a trouvé que la préparation de hyalastine était utile pour le traitement de diverses plaies, y compris les escarres de dêcubitus * ► 15 (escarres de lits), ulcères trophiques, brûlures, plaies atones, ulcères post-traumatiques, ulcères variqueux et ulcères post-phlébitiques à la suite de diverses tâches veineuses, nécroses radiologiques, lésions de la peau, greffes de peau et lésions de la peau dues à l'herpès simplex.
5 Pour ces traitements de cicatrisation des plaies, la préparation de ^ hyalastine ou son sel de sodium peut être administrée par différentes f méthodes telles que tampon de gaz, crème, pulvérisation ou ampoules pour injection intradermique. Pour les applications topiques sous la forme de crème ou d'un tampon de gaz, la hyalastine est, de préférence, combinée 10 avec un agent émulsionnant qui absorbe l'exsudât provenant de la zone exposée tout en procurant une excellente diffusion de l'acide hyaluronique et un excipient dispersible dans l'eau de telle sorte que le pansement de la plaie s'enlève facilement.
La fraction de hyalectine a été trouvée particulièrement utile 15 pour le traitement des chevaux, particulièrement des chevaux de course souffrant de désordres et de maladies articulaires causés par un traumatisme aigu ou chronique, des infections ou des injections de corticostéroïde intra-articulaires répétées. Des désordres spécifiques que Ton peut traiter avec la hyalectine sont, par exemple, les ostéoarthroses 20 avec ou sans signes inflammatoires, la synorithe aiguë ou chronique, les processus dégénératifs dans les cartilages articulaires et les maladies articulaires sèches. Les symptômes les plus fréquents de ces désordres sont, généralement, une douleur, une fonction endommagée de l'articulation et une flexion diminuée de l'articulation. On a trouvé que la 25 fraction de hyalectine selon l'invention favorisait une réduction notable du temps de cicatrisation pour ces chevaux affectés par comparaison aux thérapeutiques classiques, favorisant une amélioration précoce et durable du fonctionnement des articulations et réduisant la douleur et l'infirmité. On pense que ces effets cliniquement avantageux 30 sont favorisés par une normalisation de la visco-élasticité du fluide synovial et par l'activation des processus de réparation des tissus dans ^ les cartilages articulaires.
En outre, tous les effets avantageux ci-dessus sont favorisés par la fraction de hyalectine en l'absence d'effets toxiques, locaux et/ou 35 systémiques. Une administration répétée de hyalectine ne donne pas de signe de réaction allergique ni d'aucun effet nocif ou durable.
Préparations pharmaceutiques
La description ci-dessus a montré que les fractions de hyalastine 16 % * et de hyalectine avaient une bonne activité en applications pharmaceutiques. Les exemples suivants ne sont donnés que pour décrire des préparations pharmaceutiques susceptibles d'être employées pour une administration in vivo efficace des fractions de HA.
5 A.- Préparations de cicatrisation des plaies ^ Exemple 1 : ampoules pour injection intradermique : * chaque ampoule contient : . sel de sodium de hyalastine .. 4 mg . chlorure de sodium ........... 16 mg 10 . eau pour injection, q.s.p. ... 2 ml . Exemple 2 : ampoules pour injection intradermique : chaque ampoule contient : . sel de potassium de hyalastine 5 mg . chlorure de sodium........... 8 mg 15 . eau pour injection, q.s.p..... 1 ml
Exemple 3 : bouteille de pulvérisation pour application topique chaque bouteille contient : . sel de sodium de hyalastine .. 20 mg . chlorure de sodium ........... 80 mg 20 . eau pour injection, q.s.p. ... 10 ml
Exemple 4 : bouteille de pulvérisation pour application topique chaque bouteille contient : . sel de potassium de hyalastine 30 mg . mannitol ..................... 100 mg 25 . eau pour injection, q.s.p. ... 10 ml é Exemple 5 : crème pour application topique chaque tube de crème contient : . sel de potassium de hyalastine 25 mg . monostëarate de polyéthylène- 30 glycol 400 ................... 1000 mg . cétiole (ester décylique de c l'acide oléique) ............. 500 mg ^ . lanette SX (alcool cétyl- stéarique + laurylsulfate 9/1) 150 mg 35 . glycérol ..................... 200 mg . sorbitol ..................... 150 mg . dêhydroacëtate de Na ......... 10 mg . p-oxymëthylbenzoate .......... 7,5 mg 4 17 . p-oxypropylbenzoate .......... 5 mg . eau redistillée, q.s.p....... 10 g
Exemple 6 : crème pour application topique chaque tube de crème contient : 5 . sel de sodium de hyalastine .. 30 mg . gelée de paraffine ........... 3 mg - . monostéarate de polyéthylèneglycol 400 ................... 1000 mg . cétiole (ester décylique de 10 l'acide oléique) ............. 500 mg . lanette SX (alcool cétyl-stéarique + laurylsulfate 9/1) 150 mg . glycérol ..................... 200 mg . sorbitol ..................... 150 mg 15 . déhydroacétate de Na ......... 10 mg . p-oxymëthylbenzoate .......... 7,5 mg . p-oxypropylbenzoate .......... 5 mg . eau redistillée, q.s.p....... 10 g
Exemple 7 : tampon de gaz contenant des médicaments pour 20 application topique, chaque tampon de gaz mesurant 10 x 10 cm, contient : . sel de sodium de hyalastine .. 3 mg . glycérol ..................... 1 g . polyéthylèneglycol ........... 2g 25 . eau redistillée, q.s.p....... 3 g . Exemple 8 : tampon de gaz chargé de médicament pour application topique, chaque tampon de gaz mesurant 10 x 10 cm, contient : . sel de potassium de hyalastine 6 mg 30 . gelée de paraffine ........... 0,5 mg . glycérol ..................... 1 g g . polyéthylèneglycol ........... 2g . eau redistillée, q.s.p....... 3 g
Exemple 9 : poudre sèche pour application en cicatrisation des 35 plaies - chaque gramme de poudre sèche contient: . sel de sodium de hyalastine .. 10 mg . mannitol ..................... 0,75 g 18 V ¥ • glycine ...................... 0,24 g B.- Préparations pour utilisation intra-occulaire Exemple 10 : fioles de 1 ml - chaque fiole contient: *5 .sel de sodium de hyalectine .. 10 mg ^ . chlorure de sodium ........... 8 mg K . phosphate de sodium monobasique 2H20 ..................... 0,25 mg . phosphate de sodium dibasî- 10 que 12H^0 .................... 3 mg . eau pour injection, q.s.p. ... 1 ml
Exemple 11 : fioles de 5 ml - chaque fiole contient: . sel de potassium de hyalectine 60 mg 15 . mannitol ..................... 50 mg . phosphate de sodium monobasique 2H20 ..................... 1,25 mg . phosphate de sodium dibasi- que 121^0 .................... 15 mg 20 . eau pour injection, q.s.p. ... 5 ml
Exemple 12 : seringues pré-remplies -chaque seringue contient: . sel de sodium de hyalectine .. 40 mg . chlorure de sodium ........... 16 mg 25 , phosphate de sodium monobasique 2H20 ..................... 0,8 mg . phosphate de sodium dibasi- que 12H20 .................... 8,16 mg . eau pour injection, q.s.p. ... 2 ml 30 C.- Préparations pour utilisation intra-articulaire Exemple 13 : fioles de 2 ml -v- chaque fiole contient: - . sel de sodium de hyalectine ., 40 mg . chlorure de sodium ........... 16 mg 35 . eau pour injection, q.s.p. ... 2 ml
Exemple 14 : fioles de 4 Ml - chaque fiole contient: . sel de potassium de hyalectine 60 mg * * 19 . mannitol ..................... 35 mg . glycine ...................... 10 mg . eau pour injection, q.s.p. ... 4 ml
Exemple 15 : seringues pré-remplies -5 chaque seringue contient: Ä . sel de sodium de hyalectine .. 25 mg - . chlorure de sodium........... 12 mg . mannitol ..................... 10 mg . phosphate de sodium monobasi- 10 que 2H2O ..................... 0,5 mg . phosphate de sodium dibasi- que I2H2O .................... 6 mg . eau pour injection, q.s.p. ... 2 ml _ Bien que les préparations ci-dessus aient été décrites à titre 15 d'exemples, on cpmprendra que d'autres formulations pharmaceutiques peuvent se préparer en combinant les fractions de hyalastine et de hyalectine découvertes par la demanderesse ou leurs sels cle potassium ou de sodium avec d'autres véhicules pharmaceutiquement acceptables, diluants ou excipients et, à diverses doses, en fonction de Vutilisa-20 tion particulière de la formulation.
Pour des utilisations de cicatrisation des plaies, les préparations de fractions de hyalastine sont appliquées aux zones de la peau affectées sous une des formes de dosage discutées ci-dessus, c'est-à-dire soit sous forme de crème, de pulvérisation, de tampon de gaz, de 25 poudre sèche ou d'injection intradermique. Pour des utilisations intra-. articulaires, les préparations de hyalectine sont généralement adminis trées à une dose de 2 ml par articulation, soit à partir d'une fiole préparée, soit à partir d'une seringue prë-remplie comme décrit ci-dessus.
30 Dans une étude supplémentaire, on a examiné la capacité et l'effi cacité de l'acide hyaluronique comme véhicule de diverses molécules, en particulier comme véhicule de drogues ophtalmiques, garantissant une tolérabilité et une compatibilité parfaites (c'est-à-dire absence de phénomène de sensibilisation) avec l'épithélium cornëen. On considère 35 que l'acide hyaluronique a un intérêt particulier comme véhicule ophtalmique. Comme discuté ci-dessus, le HA est un glycose aminoglycane présent dans divers tissus conjonctifs et liquides biologiques (tel que le fluide synovial et, en particulier, l'humeur vitreuse) où à cause de 20 sa nature physique et chimique et de ses caractéristiques visco-élastiques frappantes, il joue un rôle structural et biologique d'une importance fondamentale.
Ainsi, on a conduit une étude pour examiner l'utilisation de “ 5 fraction de HA ayant différents poids moléculaires, notamment les fractions de hyalastine et de hyalectine et un mélange de celles-ci pour = la préparation de diverses formes pharmaceutiques telles que collyres, gels, crèmes, inserts ou poudres sèches. De ce fait, des médicaments ophtalmiques de différents types sont étudiées en vue d'obtenir une 10 large compréhension de l'utilisation potentielle de ce polymère biologique dans ces différentes fractions en tant que véhicule.
Les expériences décrites ci-après visent à déterminer si des formulations contenant de l'acide hyaluronique comme excipient sont capables d'améliorer la disponibilité biologique des médicaments véhicu-15 15s ou de produire un effet cynergique en combinaison avec les médicaments véhiculés, notamment avec les médicaments ayant une activité ou une utilité ophtalmique. Ces capacités potentielles de HA comme véhicule i sont étudiées dans l'oeil du lapin avec quatre médicaments ophtalmiques ayant des types et des actions différents, en particulier le nitrate de 20 pilocarpine, la triamcinolone, le facteur de croissance épidermique (E6F) et un antibiotique tel que la streptomycine et la gentamicine.
Tous ces médicaments sont connus pour avoir une efficacité myotique anti-inflammatoire cicatrisante et anti-microbienne. En outre, l'évaluation de l'activité de l'antibiotique streptomycine véhiculé par l'acide 25 hyaluronique est très importante, parce que c'est l'un des antibiotique les plus largement utilisé dans les infections occulaires.
Les modèles expérimentaux étudiés et les expériences effectuées sont les suivantes: 1) activité myotique du nitrate de pilocarpine véhiculé par 30 l'acide hyaluronique dans l'oeil du lapin; 2) activité anti-inflammatoire de la triamcinolone véhiculé par l'acide hyaluronique dans le modèle de l'inflammation induite 7 par le textrane dans l'oeil du lapin; 3) activité cicatrisante du facteur de croissance de l'épiderme 35 (EGF) véhiculé par l'acide hyaluronique dans un modèle de lésion épithélienne de cornée du lapin; * * 21 4) activité anti-microbienne de la streptomycine véhiculé par l'acide hyaluronique contre le Bacillus substilus 6633 sur des plaques d'agar-agar.
I.- Activité myotique du nitrate de pilocarpine véhiculé par l'acide *' 5 hyaluronique
Matières i Les matières suivantes sont utilisées comme excipients de la pilocarpine pour les diverses formulations de nitrate de pilocarpine: sel de sodium de l'acide hyaluronique, fraction de hyalastine 10 (p.m. approximativement 100 000) à une concentration de 10 mg/ml et 20 mg/ml; sel de sodium de l'acide hyaluronique, fraction de hyalectine (p.m. 500 000 à 730 000) à une concentration de 10 mg/ml et _ 20 Mg/ml; 15 - alcool polyvinylique à 5% comme excipient ophtalmique comparatif.
Diverses formulations à 2% (collyre ou gel) de nitrate de pilocarpine sont préparées et véhiculées en ajoutant les deux fractions différentes Ί de sels de sodium de HA à une concentration de 10 et 20 ml/ml. Les solutions suivantes sont préparées: 20 Formulation 1 - solution saline avec nitrate de pilocarpine (PiNO^) (2%), utilisée comme référence.
Formulation 2 - solution de PiNOg (2%) véhiculée dans de l'alcool polyvinylique S 5% (utilisée comme référence). Formulation 3 - solution de PiNOg (2%) véhiculée dans du sel de sodium 25 de la fraction de hyalastine (10 mg/ml).
. Formulation 4 - solution de PiNOg (2%) véhiculée dans du sel de sodium de la fraction de hyalastine (20 mg/ml).
Formulation 5 - solution de PiN03 (2¾) véhiculée dans du sel de sodium de la fraction de hyalastine (10 mg/ml).
30 Formulation 6 - solution de PiNO^ (2¾) véhiculée dans du sel de sodium de la fraction de hyalastine (20 mg/ml).
^ Méthode
Des lapins albinos de Nouvelle Zélande sont utilisés (poids 2 à e 2,5 kg). La formulation à tester est instillée dans un oeil avec une 35 micro-seringue (10 1); l'autre oeil sert de témoin. Dans tous les cas, on mesure le diamètre de la pupille à des intervalles de temps convenable. Chaque solution est testée sur au moins 8 lapins. Chaque oeil V φ- 22 n'est pas traité plus de trois fois et une période de repos d'au moins une semaine est observée entre chaque traitement.
Paramètres mesurés
Les diamètres de pupilles sont mesurés à divers intervalles en vue 5 de déterminer la courbe d'activité myotique dans le temps. Les paramètres d'activité suivants sont ensuite calculés à partir de la courbe t myosis/temps: = différence maximum de diamètre de la pupille entre l'oeil traité ιΊταΧ et la référence.
10 Temps de pic = temps nécessaire pour atteindre I .
Durée = temps nécessaire pour restaurer les conditions de base.
Plateau = période d'activité myotique absolue.
AUC = zone sous myosis/courbe de temps.
-, Résultats 15 Les résultats des tests sont indiqués sur le tableau 5. On peut voir, d'après les données des divers paramètres mesurés à partir de la courbe de temps d'activité myotique pour toutes les solutions testées K que l'addition d'acide hyaluronique à une solution de nitrate de pi 1o- carpine ä 2% donne lieu à une augmentation de l'activité myotique du 20 médicament. En fait la disponibilité biologique du médicament peut être jusqu'à 2,7 fois plus importante que celle de la solution aqueuse contenant du nitrate de pilocarpine à 2% (formulation 1).
On doit aussi noter qu'il y a une augmentation statistique significative d'activité lorsque la fraction de hyalectine et la fraction 25 d'acide hyaluronique sont utilisées toutes les deux à 10 et 20 mg/ml comme véhicules (formulations 5 et 6), au contraire de la solution de nitrate de pilocarpine véhiculée par l'alcool polyvinylique (formulation 2).
L'utilisation de l'acide hyaluronique comme véhicule est particu-30 lièrement intéressante parce que l'activité myotique du nitrate de pilocarpine dure plus longtemps lorsqu'elle est véhiculée avec cette c substance. C'est-à-dire, que pour les formulations contenant l'acide "5 hyaluronique, le temps nécessaire pour restaurer le diamètre de la pupille aux conditions de base va jusqu'à 190 minutes (formulation 6) 35 par comparaison avec les 110 minutes nécessaires pour la pilocarpine avec une solution saline seule (formulation 1).
23 V 4 II.- Activité anti-inflammatoire de la triamcinolone véhiculée par l'acide hyaluronique Matières
On utilise les matières suivantes: 5 - une fraction de sel de sodium d'acide hyaluronique-hyalectine, " p.m. entre 500 000 et 730 000, 10 mg/ml dans une solution saline; solution de triamcinolone (10¾ dans une solution saline).
Méthode
Les expériences sont effectuées sur des lapins mâles de Nouvelle 10 Zélande (poids moyen 1,6 kg). Après une période d'adaptation de cinq . jours, l'inflammation intra-occulaire est induite dans les lapins par injection intra-occulaire de dextrane (10%, 0,1 ml). L'administration est effectuée dans les deux yeux, sous anesthésie locale avec de la Novésina à en insérant l'aiguille de la seringue de 4 mm dans la 15 chambre antérieure à une distance de 2 mm du pourtour de la cornée. Le test est conduit sur dix animaux.
TABLEAU 5 i Activité biologique de formulations ophtalmiques 20 contenant pilocarpine-nitrate véhiculé par l'acide hyaluronique9
I ^ I I I ^^ I
Formu- , I , mm temps de pic durée plateau AUC, cm2 AUC
véhiculé max lation (à LF 95¾) (en mn) (en mn) (en mn) (± LF 95¾) relative 25 1 solution saline 1,93 ± 0,35 20 110 - 117 ±28 1 2 alcool polyviny- lique A 5¾ 2,33 ± 0,28 20 140 - 192 ± 32 1,64 3 hyalastine (lOmg/ml) 2,50 ± 0,42 20 120 - 240 ± 40 2,05 4 hyalastine (20mg/ml) 2,58 ± 0,38 30 150 - 208 ± 41 1,78 30 5 hyalectine (10ifig/ml) 2,50 ± 0,38 15 170 - 242 ± 48 2,06 6 hyalectine (20mg/ml) 2,10 ± 0,38 20 190 ^ 45 320 ± 45 2,73 â les valeurs indiquées représentent la valeur moyenne de huit essais.
35 * * 24
Traitement
Un traitement est effectué sur chaque animal, à la fois dans l'oeil droit et dans l'oeil gauche par instillation de trois gouttes, trois fois par jour pendant six jours en tout de ce qui suit: v 5 une solution de triamcinolone (10% dans une solution saline) dans l'oeil gauche (LE); - une solution de sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction de hyalectine, (10 mg/ml) + triamcinolone (10%) dans l'oeil droit (RE); 10 Paramètres L'effet anti-inflammatoire sur la réaction phlogistique induite par le dextrane est évalué en observant l'oeil avec une lampe fendue aux intervalles suivants: 0, 1 heure, 3 heures, 24 heures, 48 heures, 3 jours, 4 jours, 5 jours et 6 jours.
15 A ces intervalles, l'examen de l'oeil conduit aux observations suivantes: - l'état de la cornée et de la conjonctive pour déceler la présence possible d'hypermia, oedème et notamment observation de l'iris qui est normalement sensible au processus phlogistique après injection 20 intra-occulaire d'agents inflammatoires; - effet Tyndall dans lequel la présence d'une opacité plus ou moins intense ("nubecula") est indicative de la présence d'éléments corpusculents (inflammatoire) dans la chambre antérieure.
Le résultat des observations est exprimé en termes de notations 25 subjectives (de 0 à 3) liées à la progressivité de l'effet observé. Résultats
On peut voir, d'après les résultats reportés dans le tableau 6 que l'administration de la triamcinolone a un effet anti-inflammatoire sur l'iris et occasionne la disparition de l'opacité (effet Tyndall) dans la 30 chambre antérieure. Le processus inflammatoire qui est évident ä partir de la première à la troisième heure jusqu'au quatrième jour décroît v progressivement jusqu'à ce que des conditions sensiblement normales ^ soient rétablies avec une limpidité parfaite de l'oeil le sixième jour.
D'autre part, l'administration du sel de sodium de l'acide hyaluronique, 35 fraction hyalectine, en même temps que la triamcinolone réduit l'inflammation intra-occulaire observée au moment discuté ci-dessus par rapport à l'administration de la triamcinolone seule. C'est-à-dire que le processus phlogistique dans l'iris et l'opacité dans la chambre antê- t * 25 ri eure semblent avoir diminués à la 24ème heure, avec une réduction progressive jusqu'à la 48ëme heure et avec une absence totale de réaction inflammatoire à partir du 4ême jour.
Dans la conjonctive et la cornée, on n'observe sensiblement pas de * 5 réaction notoire après injection intra-occulaire de dextrane.
Ainsi, l'administration de triamcinolone, en même temps que de la fraction d'acide hyaluronique conduit à une activité améliorée du médicament, ce que met en évidence la cicatrisation plus rapide de 1'oeil du lapin.
10 TABLEAU 6
Effet de la combinaison de l'acide hyaluronique et de la triamcinolone sur l'inflammation intra-occulaire induite par le dextrane
Xnterval d'observation 15 0 lh 3 h 24 h 48 h 3 j 4 j 5 j 6 j notation évaluée
LE RE LE RE LE RE LE RE LE RE LE RE LE RE LE RE LE RE
20 conjonctive 0,0 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 cornée 0,0 0,0 1,0 0,2 0,0 0,7 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Eyndall 0,0 0,0 1,0 1,2 3,0 3,0 3,0 2,1 3,0 1,2 3,0 0,2 2,2 0,0 1,2 0,0 0,4 0,0
Iris 0,0 0,0 0,5 0,7 2,7 2,7 3,0 2,5 3,0 1,2 3,0 0,4 2,4 0,0 1,5 0,0 0,5 0,0 25 LE = oeil gauche traité avec la triamcinolone.
RE = oeil droit traité avec la triamcinolone et la hyalectine.
3 chaque valeur est la moyenne de sept observations sur un total de sept animaux et elle est exprimée en termes de notation subjective entre 0 et 3, en relation avec 30 la progressivité de l'effet observé.
*** III.- Activité de cicatrisation du EGF véhiculé dans l'acide c hyaluronique
Matières 35 On utilise les matières suivantes:
Formulation A - E6F (facteur de croissance épidermique) dissous dans une solution saline (0,5 mg/5 ml).
* ♦ 26
Formulation B - sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalastine (p.m. approximativement 100 000) dissous dans une solution saline (10 mg/ml).
Méthodes 5 Les expériences sont menées sur des lapins mâles albinos de * Nouvelles Zëlandes (poids moyen 1,8 kg). Les animaux, après une période 4 d'adaptation environ 5 jours, subissent une lésion épithélienne de la cornée dans les conditions convenables d'anesthésie locale avec la Novésina (4%). La lésion consiste en une scarification monoculaire d'une 10 zone circulaire de la zone optique effectuée par un cylindre de verre concave (3 mm) ayant un bord coupant.
Traitement
Les animaux sont subdivisés en groupes, chaque groupe étant __ constitué de cinq animaux et ils sont soumis à un traitement pharmaco- 15 logique par instillation dans la conjonctive de ce qui suit:
Groupes Traitement r, groupe 1 (témoin) solution saline 20 groupe 2 solution EGF (formulation A) groupe 3 solution de sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction de hyalastine + solution d1 EGF - combinaison de formulation A + formulation 25 B dans un rapport 1/1, pour obte
nir une formulation C
*
Le traitement est effectué sur l'oeil droit (RE) par instillation dans la conjonctive de deux gouttes toutes les huit heures pour trois 30 administration au total.
Paramètres i, La cicatrisation de l'épithélium cornéen est évaluée par observa- : tion de l'oeil et par documentation photographique avec une lampe fendue à divers intervalles après scarification: 0, 8 heures, 16 heures, 35 24 heures, 32 heures, 40 heures et 48 heures.
Résultats L'examen ophtalmologique 1, tel qu'indiqué sur le tableau 7, révèle que pour les témoins (groupe 1) une cicatrisation complète est » » 27 obtenue (5 animaux sur 5) 48 heures après la lésion. Dans les animaux traités par E6F (groupe 2), le processus de cicatrisation est apparent déjà 24 heures après scarification avec une efficacité considérable (4 animaux sur 5). Chez les animaux traités avec la formulation C 5 comprenant le sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalas--"r tine + EGF (groupe 3), le processus de cicatrisation est complet chez tous les animaux (5 sur 5) déjà 16 heures après scarification.
Ces résultats montrent que l'utilisation de la hyalastine fraction d'acide hyaluronique comme véhicule pour VEGF accélère le processus de 10 cicatrisation en favorisant une cicatrisation efficace plus rapide des lésions cornéenne.
TABLEAU 7
Guérison des lésions de l'épithélium cornëen 15 Groupe Traitement Heures après scarification 0 8 16 24 48 1 saline + + + + + + + + -20 + + + + + + + + + + + + -
2 EGF
(formulation A) + + + 25 + + +__ + + + * + + + + + + + 3 acide hyaluronique + 30 EGF (formulation C) + + + + - V + + + + 35 + = oeil non cicatrisé.
- = oeil cicatrisé.
-I + + - - - % » 28 IV.- Activité anti-microbienne de la qentanricine véhiculée par l'acide hyaluronique Matières
On utilise les matières suivantes: 5 - gentamicine dissoute sans une solution saline (50 mg/ml); - sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalectine (2 mg/ml).
- Méthodes
Une phlogose septique est causée dans chaque oeil de 11 lapins par injection intra-occulaire d'une suspension titrée de pneudomonas aerugi-10 nosa (0,1 ml). Chez les lapins présentant une phlogose septique, on administre de l'acide hyaluronique, fraction hyalectine en combinaison avec de la gentamicine par instillation dans l'oeil droit et de la gentamicine dans un véhicule constitué d'une solution saline tamponnée est administrée dans l'oeil gauche. Le traitement (trois gouttes toutes 15 les six heures) commence immédiatement après injection de l'agent infectant et on le poursuit jusqu'à ce que l'infection disparaisse. Les yeux sont observés tous les jours sous une lampe à fentes.
1 Résultats
Le traitement à l'aide de la combinaison gentamicine acide hyaluro-20 nique conduit à une disparition plus rapide de l'infection septique par comparaison avec le cas de l'administration de l'antibiotique seul.
Cette conclusion apparaît d'après les données présentées sur le tableau 8.
TABLEAU 8
Effets de la gentamicine véhiculée par l'acide hyaluronique, 25 fraction hyalectine sur la phlogose spectique intra-occulaire tr .
jours à partir du début de la phlogose
Traitement ---- 1 2 3 4 5 6 7 gentamicine + 30 véhicule tampon salin 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 36,3 100 gentamicine + fraction ^ acide hyaluronique p hyalectine 0,0 0,0 9,0+ 27,2+ 72,7+ 100 100
V
35 Les valeurs sont exprimées en pourcentage (nombre d'yeux guéris de la phlogose par rapport au nombre d'yeux traités).
+ = différence significative par rapport au véhicule tampon (moins de 0,05, T-test exact de Fisher).
» » 29
Des échantillons supplémentaires, bien que cette liste ne soit pas limitative, de médicaments ophtalmiques que l'on peut véhiculer avec des fractions de HA selon la présente invention, sont les suivants: . antibiotiques ................... chloromphénicol 5 néomycine "" auréomycine myxine et polymyxine bacitrincine mycétines 9 10 . hormones ........................ nandrolone et sulfate de nandrolone . anesthésiques (locaux) .......... hénoxinate et son chlorhy drate __ . antiviral ....................... iodocéoxyuridine 15 iodocéoxycytidine . anti-inflammatoires ............. dexaméthasone et son phosphate . vasopresseurs et vasoconstricteurs synéphrine et néosynéphrine
CONCLUSIONS
ΐ 20 Sur la base des résultats obtenus à partir des expériences discu tées ci-dessus, on peut conclure que des solutions de sels d'acide hyaluronique, (à la fois dans les fractions hyalastine et hyalectine) peuvent être utilisées comme véhicules pour des médicaments ophtalmiques et s'avèrent être efficientes en tant que telles pour divers types de 25 médicaments ayant différentes actions biologiques. Par exemple, des médicaments comprenant des agents anti-glaucomes tels que le nitrate de pilocarpine, des agents anti-allergiques et anti-inflammatoires tels que triamcinolone, des agents favorisant la cicatrisation des tissus et la prolifération des cellules, des agents favorisant la cicatrisation des 30 tissus de l'oeil tels que EGF et des antibiotiques tels que streptomycine et gentamicine dont on indique respectivement les activités myotiques v, anti-inflammatoires, cicatrisantes et anti-microbiennes peuvent toutes - être administrées avec efficacité en utilisant le HA comme véhicule.
Les formulations de médicaments ophtalmiques véhiculés dans les 35 fractions d'acide hyaluronique ayant divers poids moléculaires sont parfaitement tolérés par l'hôte et compatibles avec l'épithélium cornéen sans donner lieu, cependant, à des phénomènes de sensibilisation.
Il est également possible, à partir des données, d'observer que ce * » 30 produit biologique, l'acide hyaluronique, est un véhicule efficace capable d'améliorer la disponibilité biologique in vivo des médicaments véhiculés, et de renforcer l'activité pharmacologique de ces médicaments. L'utilisation des fractions d'acide hyaluronique comme véhicule de mëdi-Λ 5 caments a particulièrement comme résultats: - une augmentation de l'activité myotique du nitrate de pilo-carpine, tout en prolongeant le temps d'activité du médicament; - une augmentation d'activité anti-inflammatoire de la triam- 10 cinolone dans l'inflammation intra-occulaire induite par le dextrane, avec une régression du processus phlogistique dans des temps plus courts que ceux que l'on obtient avec la triamcinolone seule; - augmentation de l'action protectrice du facteur de croissance 15 épidermique (EGF) sur les lésions superficielles de la cornée avec un cynergisme évident et réduction des temps de cicatrisation par comparaison avec le temps de récupération observé ^ avec 1'EGF seul; et - augmentation dans l'activité biologique in vivo des antibio- 20 tiques tels que la gentamicine.
Les résultats obtenus en utilisant ce polymère biologique, l'acide hyaluronique, comme véhicule pour des médicaments avec des effets de nature si diverses, permet l'extrapolation de son potentiel comme véhicule de nombreux autres médicaments ophtalmiques.
25 On indique, ci-dessous, divers exemples de diverses formulations de médicaments ophtalmiques pouvant se trouver sous la forme de poudres, » collyres, gels, crèmes ou inserts, dans lesquels l'acide hyaluronique sous la forme de ces différentes fractions hyalastine et hyalectine est le seul excipient utilisé: 30 Exemple 1
Collyre pouvant être utilisé comme "larmes artificielles" conte- nant: . sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalectine ................. 10 mg 35 . solution saline tamponnée avec du phosphate à pH,6 .................... 10 ml * % 31
Exemple 2
Collyre pouvant être utilisé comme "larmes artificielles" contenant: . sel de sodium d'acide hyaluronique, * 5 fraction hyalectine ................. 20 mg ^ . solution saline tamponnée avec du phosphate à pH,6 .................... 10 mg
Exemple 3
Un gel contenant de 11 EGF dans lequel 100 g contiennent: 10 . sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalastine ................. 55 mg . sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalectine ................. 30 mg _ . EGF ................................. 0,5 g 15 . eau bi-distillée .................... 25,5 g
Exemple 4
Un insert de 100 mg avec du nitrate de pilocarpine contenant: ^ . sel de sodium d'acide hyaluronique, ; fraction hyalastine ................. 100 mg = 20 . nitrate de pilocarpine .............. 2 mg
Exemple 5
Une poudre pour application topique contenant de la streptomycine. 100 g de poudre contiennent: . sel de sodium d'acide hyaluronique, 25 fraction hyalastine ................. 70 mg . sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalectine ................. 28,5 mg • . streptomycine ....................... 1,5 g
Bien que les préparations ci-dessus aient été données à titre 30 d'exemple, on appréciera que les formulations pharmaceutiques peuvent se préparer en combinant les fractions hyaluroniques, notamment les frac-r tions hyalectines ou hyalastines ou la fraction combinée hyalectine/ m hyalastine ou leurs sels de sodium ou de potassium avec d'autres médica ments actifs avec diverses doses en fonction de l'utilisation parti culiê- a* 35 re de la formulation.
L'acide hyaluronique, notamment dans les fractions de hyalectine et hyalastine sensiblement pures a donc été démontré comme étant un véhicule ou excipient efficace utilisable en combinaison avec diverses 32 * » drogues médicaments ayant une utilité ou une activité ophtalmique. Les compositions pharmaceutiques contenant les fractions de HA comme véhicules de médicaments sont particulièrement utiles parce que les fractions de HA manifestent un niveau élevé de tolérabilité pour l'oeil et * 5 une compatibilité élevée avec l'épithélium cornéen.
L'utilisation des fractions de HA procure, en outre, un moyen d'améliorer effectivement l'activité biologique in vivo des médicaments ophtalmiques. L'utilisation des fractions particulières hyalectines et hyalastinés du HA est, en outre, utile et importante parce que ces » 10 fractions, quand on les administre dans l'oeil ne manifestent pas de réactions secondaires inflammatoires indésirables.
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Claims (17)

1. Procédé de préparation d'une fraction d'acide hyaluronique, sensiblement pure, non-inflammatoire, consistant: - à déshydrater les tissus contenant une quantité disponible 5 d'acide hyaluronique; - à soumettre le tissu déshydraté qui en résulte à une digestion enzymatique; - à soumettre le mélange qui en résulte à une filtration » moléculaire pour obtenir une fraction d'acide hyaluronique 10 ayant un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à environ 100 000, d'environ 250 000 à environ 350 000 ou d'environ 500 000 à environ 730 000.
2. Procédé de préparation d'une fraction d'acide hyaluronique, — sensiblement pure, non-inflammatoire, consistant: 15 - à déshydrater les tissus disponibles pour l'extraction de l'acide hyaluronique; - à soumettre la substance qui en résulte à une digestion ~ enzymatique; - à soumettre le mélange qui en résulte à une filtration 20 moléculaire avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de 30 000 pour exclure les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 30 000; - à recueillir le mélange retenu dans cette membrane, pour obtenir ainsi une première fraction d'acide hyaluronique 25 ayant un poids moléculaire moyen d'environ 250 000 à environ * 350 000.
3. Méthode de préparation d'une fraction d'acide hyaluronique, sensiblement pure, non-inflammatoire, selon la revendication 2, dans lequel cette première fraction d'acide hyaluronique est soumise à une 30 ultra-filtration moléculaire ultérieure avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire d'environ 200 000 pour exclure ^ les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 200 000, à pour suivre l'ultra-filtration jusqu'à ce que le volume du mélange soumis à l'ultra-filtration soit réduit à 10% du volume initial et à recueillir 35 le mélange qui passe à travers la membrane pour obtenir ainsi une seconde fraction d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à 100 000. * < 34
4. Procédé de préparation d'une fraction d'acide hyaluronique, sensiblement pure, non-inflammatoire, consistant à recueillir le mélange retenu sur la membrane après l'étape d'ultra-filtration avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire d'environ 5 200 000 selon la revendication 3, pour obtenir ainsi une troisième * fraction d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen d'environ 500 000 à environ 730 000.
5. Fraction d'acide hyaluronique, sensiblement pure, non-inflammatoire, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 30 000 et 10 730 000 ou son sel de sodium ou de potassium.
6. Fraction d'acide hyaluronique, sensiblement pure, non-inflammatoire selon la revendication 5, ayant un poids moléculaire moyen compris entre environ 250 000 et environ 350 000 ou son sel de sodium ou ___ de potassium. 15 7.- Fraction d'acide hyaluronique, sensiblement pure, non- inflammatoire selon la revendication 5, ayant un poids moléculaire moyen compris entre environ 50 000 et environ 100 000 ou son sel de sodium ou ^ de potassium de celle-ci. .8.- Fraction d'acide hyaluronique, sensiblement pure, non-Γ- 20 inflammatoire selon la revendication 5, ayant un poids moléculaire moyen compris entre environ 500 000 et environ 730 000 ou son sel de sodium ou de potassium.
9.- Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace en cicatrisation des plaies d'une fraction d'acide hyaluronique selon la 25 revendication 6, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, excipient ou diluant. »
10. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace en * cicatrisation des plaies d'une fraction d'acide hyaluronique selon la revendication 7, et au moins un véhicule, excipient ou diluant pharma- 30 ceutiquement acceptable.
11. Composition pharmaceutique contenant une quantité efficace en s traitement intra-occulaire ou intra-articulaire d'une fraction d'acide ^ hyaluronique selon la revendication 8, et au moins un véhicule, exci- - pient ou diluant pharmaceutiquement acceptable. "V* 35 12.- Composition pharmaceutique pour administration ophtalmique comprenant une quantité efficace d'une drogue ayant une activité ophtalmique comme ingrédient actif et véhicule support ou diluant pharmaceutiquement acceptable comprenant une fraction sensiblement pure d'acide 35 t f ^ * i hyaluronique ou d'un de ses sels.
13.- Composition pharmaceutique selon la revendication 12, dans laquelle cette fraction d'acide hyaluronique a un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à'environ 100 000, d'environ 250 000 à environ 5 350 000 ou d'environ 500 000 à environ 730 000.
14. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, dans laquelle cette fraction d'acide hyaluronique a un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à environ 730 000.
15. Méthode d'amélioration de la cicatrisation des plaies des 10 tissus consistant à administrer une quantité efficace du point de vue de la cicatrisation des plaies d'une fraction d'acide hyaluronique selon la revendication 7.
16. Méthode de traitement de maladies traumatiques et dégénéra- __ tives des articulations et d'amélioration du fonctionnement des articu- 15 lations consistant à injecter dans une articulation affectée une quantité efficace des plaies d'une fraction d'acide hyaluronique selon la revendication 8.
17. Méthode de traitement intra-occulaire consistant à injecter dans la zone occulaire une fraction d'acide hyaluronique selon la - 20 revendication 8 en substitution aux liquides endobulbaires.
18. Méthode de traitement de conditions ophtalmiques consistant à administrer un médicament ophtalmique à l'oeil d'un hôte en combinaison avec un véhicule comprenant une fraction sensiblement pure d'acide hyaluronique ou d'un sel de celui-ci. 25 19.- Procédé selon la revendication 18, dans lequel cette fraction d'acide hyaluronique à un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à environ 100 000, d'environ 250 000 à environ 350 000 ou d'environ 500 000 à environ 730 000.
20.- Procédé selon la revendication 18, dans lequel cette fraction 30 d'acide hyaluronique à un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à environ 730 000.
21. Procédé selon la revendication 19, dans lequel ce médicament est choisi dans le groupe constitué par nitrate de pilocarpine, triam-cinolone, facteur de croissance épidermique, streptomycine et gentami- 35 eine.
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