CH666897A5

CH666897A5 - Fractions d'acide hyaluronique non inflammatoire, procedes et compositions pharmaceutiques.

Info

Publication number: CH666897A5
Application number: CH4866/84A
Authority: CH
Inventors: Valle Francesco Della; Aurelio Romeo; Silvana Lorenzi
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1983-10-11
Filing date: 1984-10-10
Publication date: 1988-08-31
Also published as: KR850002957A; IE57931B1; EP0138572A2; ES8507573A1; BE900810A; AU575861B2; NO169637B; KR860001148B1; HUT36834A; FI79554B; DK485384A; FR2553099A1; AU3414884A; DE3482812D1; NO844054L; DK171029B1; FI843990A0; HU195523B; PT79339B; FI79554C

Description

DESCRIPTION

L'invention concerne des fractions de poids moléculaire spécifique d'acide hyaluronique (désigné ci-après sous le nom «HA») présentant des applications thérapeutiques et qui sont non inflammatoires. L'une des fractions de HA selon l'invention est utile pour faciliter la guérison des plaies, tandis que la seconde fraction de HA possède une application intra-oculaire, et peut se substituer aux fluides endobulbaires ou s'utiliser en injection intra-articulaire pour le traitement des articulations osseuses endommagées. Les fractions de HA se sont encore révélées utiles en tant que véhicule pour médicaments à applications ophtalmiques, procurant des formulations compatibles avec l'épithélium cornéen et améliorant l'activité des médicaments ophtalmiques.

L'acide hyaluronique est un hétéropolysaccharide existant à l'état naturel constitué de résidus alternés d'acide D-glucoronique et de N-acétyl-D-glucosamine. Le HA est un polymère linéaire de poids moléculaire élevé, généralement d'environ 8 à 13 millions, et on le trouve dans le revêtement des cellules, la substance de base extracellulaire des tissus conjonctifs des vertébrés, dans le fluide synovial des articulations, dans les fluides endobulbaires de l'œil, dans le tissu du cordon ombilical humain et dans les crêtes de coqs.

Des études antérieures sur l'utilisation du HA sont décrites dans les travaux de Balazs (brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 4 141 973) décrivant une fraction de HA utile au remplacement des fluides endobulbaires aussi bien qu'à d'autres applications thérapeutiques. Ce brevet est, cependant, dirigé spécifiquement vers une fraction de HA ayant un poids moléculaire moyen supérieur à environ 750 000 et de préférence supérieur à environ 1200 000.

Balazs enseigne, spécifiquement, que des fractions de HA ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 750 000 ne sont pas utilisables en thérapeutique à cause de leur activité inflammatoire. Ces fractions de HA, de poids moléculaire inférieur, sont rejetées par Balazs. Cependant, cela revient à rejeter environ 90% de la quantité totale de HA disponible susceptible d'être obtenue à partir des tissus, et revient à utiliser seulement une faible quantité (environ 10%) du HA disponible.

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Contrairement aux enseignements de Balazs, la titulaire a découvert que les fractions de HA de poids moléculaire inférieur ont, en fait, une activité pharmaceutique utile. Ainsi, selon la présente invention, environ 80% du HA que l'on peut obtenir à partir de diverses sources sont utilisés. En particulier, la titulaire a découvert une fraction de HA qui est utile à la stimulation de la guérison des plaies, et une seconde fraction de HA qui est utilisable en injection intra-oculaire, et peut se substituer aux liquides endobulbaires de l'œil et est utilisable en injections intra-articulaires pour le traitement des articulations endommagées.

La figure 1 est une courbe montrant les différentes fractions d'acide hyaluronique et qui ont été identifiées par la titulaire.

Comme discuté ci-dessus, les études antérieures sur le HA telles que par exemple celles du brevet de Balazs ont été orientées vers l'utilisation de fractions de poids moléculaires élevés ayant un poids moléculaire moyen supérieur à 750 000. La titulaire a isolé et caractérisé deux nouvelles fractions de HA, l'une ayant un faible poids moléculaire et l'autre ayant un poids moléculaire moyen, qui sont considérées comme étant sensiblement pures et n'ayant pas d'activité inflammatoire. Ces nouvelles fractions de HA peuvent être obtenues à partir de divers tissus conjonctifs qui contiennent des quantités ex-tractibles d'acide hyaluronique. Les fractions spécifiques du produit selon l'invention sont différenciées et séparées selon des techniques de filtration moléculaire.

La première fraction isolée a été nommée «hyalastine» et elle a un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à environ 100000.

Cette fraction de hyalastine a été déterminée comme pouvant convenir en utilisation thérapeutique vétérinaire et humaine à cause de son activité de guérison des plaies. La second fraction isolée a été dénommée «hyalectine» et elle a un poids moléculaire moyen d'environ 500000 à environ 730 000. Cette fraction de hyalectine est susceptible d'être utilisée dans la chirurgie oculaire en tant que substitut des liquides endobulbaires et dans les thérapeutiques vétérinaire et humaine des traumatismes et des maladies dégénératives des articulations.

La hyalastine peut être administrée soit en injection intradermique, soit en application topique pour la guérison des plaies. La hyalectine, d'autre part, convient aux injections intra-oculaire et intra-articulaire.

La titulaire a procédé à des études importantes sur les diverses fractions de HA et elle a, de façon significativement plus précise qu'auparavant, déterminé de façon spécifique les fractions thérapeu-tiquement utiles de HA et les fractions inflammatoires et non utiles de HA. Ces études ont eu, pour résultats, de permettre l'identification et l'investigation de deux caractéristiques spécifiques des fractions de HA, à savoir l'activité mobilisatrice des cellules et la viscosité intrinsèque. Le processus de guérison des plaies chez les animaux est facilité par la mobilisation cellulaire et, particulièrement, la mobilisation des fibroblastes. D'autre part, la mobilisation cellulaire ou l'activité de prolifération (c'est-à-dire la mitose) doit être évitée dans les cas de chirurgie à l'intérieur du globe oculaire. Cela est particulièrement vrai dans les opérations destinées à corriger le décollement de la rétine où une vitesse accrue de cicatrisation pourrait avoir des effets nocifs.

La viscosité intrinsèque est également un paramètre important à considérer dans la détermination de l'utilité d'une fraction de HA. Une fraction ayant une viscosité intrinsèque élevée est utile en chirurgie pour le traitement des traumatismes et des maladies dégénératives des articulations et dans le remplacement des liquides endobulbaires.

D'autre part, une viscosité élevée est une caractéristique indésirable des fractions destinées à être utilisées comme médicament pour faciliter la cicatrisation des plaies. En fait, les fractions à utiliser dans la cicatrisation des plaies doivent avoir une faible viscosité de façon à être plus facilement utilisées dans l'application pratique.

Il a été constaté que la fraction de hyalastine identifiée par la titulaire présente une bonne activité de mobilisation ou de prolifération des cellules et des caractéristiques de faible viscosité. Par conséquent, la hyalastine présente les caractéristiques souhaitables pour une matière servant à favoriser la cicatrisation des plaies.

Les mêmes caractéristiques rendent la fraction de hyalastine indésirable pour les traitements comprenant une injection intra-oculaire ou intra-articulaire.

Il a été en outre constaté que la fraction de hyalectine identifiée par la titulaire présente une activité de mobilisation des cellules ou de prolifération négligeable, tandis que, en même temps, elle possède une viscosité élevée. Ces caractéristiques rendent donc la fraction de hyalectine utile pour des traitements demandant des injections intra-oculaires ou intra-articulaires. Mais, d'autre part, la hyalectine ne peut convenir pour les traitements de cicatrisation des plaies, car cette fraction ne présente pas d'activité de mobilisation des cellules.

Lorsque l'on isole des fractions utiles d'acide hyaluronique, il est également important d'obtenir ces fractions qui n'aient pas d'activité inflammatoire. Le brevet de Balazs indiqué ci-dessus enseigne qu'en vue d'obtenir des fractions d'acide hyaluronique sans activité inflammatoire, on doit utiliser exclusivement des fractions ayant un poids moléculaire moyen de plus de 750000. Ainsi, Balazs rejette les fractions ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 750 000 comme étant non utiles à cause de leur activité inflammatoire. Contrairement aux enseignements de Balazs, la titulaire a trouvé que l'activité inflammatoire attribuée par Balazs aux fractions ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 750 000 était en fait due à des impuretés ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 30 000. Ainsi, la présente invention procure une méthode qui comprend une série de techniques de filtration moléculaire associées à des méthodes chimiques permettant l'élimination des fractions inflammatoires ayant un poids moléculaire inférieur à 30 000.

Par les méthodes selon l'invention, il est possible d'obtenir des fractions utiles d'acide hyaluronique n'ayant pas d'activité inflammatoire et qui, lorsqu'on les considère ensemble, constituent un rendement total d'environ 80% de l'acide hyaluronique total disponible à partir des matières de départ particulières. Ce rendement de 80% en acide hyaluronique disponible comprend une fraction combinée qui est une combinaison des fractions de hyalectine et de hyalastine et qui a un poids moléculaire moyen d'environ 250 000 à environ 350 000. Plus spécifiquement, la fraction de hyalectine est obtenue avec un rendement d'environ 30% du HA disponible et la fraction de hyalastine est obtenue avec un rendement d'environ 50% du HA disponible à partir des tissus de départ. Ce facteur représente une amélioration importante par rapport au procédé du brevet de Balazs discuté ci-dessus en ce sens que la titulaire a découvert que des quantités significativement accrues de l'acide hyaluronique disponible étaient pharmaceutiquement utiles. En n'utilisant que la fraction ayant un poids moléculaire moyen supérieur à 750 000, le procédé de Balazs ne conduit qu'à un rendement d'environ 10% par rapport à l'acide hyaluronique original obtenu à partir des organes animaux, et il rejette environ 90% de l'acide hyaluronique disponible. Ainsi, selon la présente invention, l'emploi de l'extrait hyaluronique total est grandement augmenté.

Une comparaison des rendements relatifs de l'extraction des diverses fractions d'acide hyaluronique est présentée dans le tableau 1.

( Tableau en tête de la page suivante )

La figure 1 représente, graphiquement, les différentes fractions de HA que la titulaire a identifiées. La courbe, en traits pleins, en forme de cloche de la figure 1, représente la distribution approximative des fractions de HA disponibles à partir d'un tissu de départ. La zone «B» de la figure 1 représente la fraction de HA identifiée par Balazs dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 4143 973 comme étant utile en pharmacie. Les zones «A», I et II dans la figure 1 sont les

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Tableau 1

Type d'acide hyaluronique g par 100 g de tissu frais

%

Référence

Acide hyaluronique total à partir de crêtes de coqs

0,08

100

Swann D. A. 1968 Biochim., Biophys. Acta 156,17-29

HA (type Balazs)

0,08

10

Brevet U.S. N° 4141 973

Hyalectine 4- hamastine

0,6

80

Présente invention

Hyalectine

0,2

30

Présente invention

Hyalastine

0,4

50

Présente invention

Fraction inflammatoire

0,16

20

Présente invention fractions identifiées par la titulaire, la zone A étant la fraction inflammatoire ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 30 000, la zone I étant la fraction de hyalastine et la zone II étant la fraction de hyalectine. A partir de cette courbe, on peut voir que la méthode de Balazs rejette la grande majorité du HA extractible disponible en éliminant les fractions de HA ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 750 000. La présente invention, d'autre part, permet l'utilisation en pharmacie d'une proportion importante du HA disponible puisque la fraction d'acide hyaluronique de poids moléculaire faible ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 30000 occasionne l'activité inflammatoire que les chercheurs précédents avaient constatée avec divers extraits de HA.

La titulaire a découvert qu'un pourcentage important de HA disponible pouvait, en fait, être utilisé à des fins thérapeutiques si on opérait la séparation selon les enseignements de la présente invention en fonction de l'application thérapeutique particulière. Tandis que le brevet de Balazs enseigne de façon spécifique l'utilisation de seulement 10% environ du HA disponible, la présente invention permet l'utilisation d'environ 80% du HA disponible soit sous forme de fraction de hyalastine pour les applications de cicatrisation des plaies, soit sous forme de fraction de hyalectine pour les applications intra-oculaires et intra-articulaires, soit sous la forme d'une fraction combinée de hyalastine et de hyalectine qui peut aussi être utilisée pour des applications de cicatrisation des plaies.

Les caractéristiques chimiques et physiques des fractions identifiées ont également été étudiées par la titulaire, et ces caractéristiques sont résumées sur le tableau 2.

Le mélange qui en résulte est filtré jusqu'à obtention d'un liquide clair. Ce liquide clair subit, ensuite, une filtration moléculaire au moyen de membranes ayant une limite d'exclusion moléculaire de 30 000 pour retenir, sur la membrane, les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 30 000. Cinq à six volumes sont ultrafiltrés à l'origine et, en même temps, de l'eau distillée est continuellement ajoutée au produit. L'addition d'eau distillée est suspendue et le produit est ultrafiltro jusqu'à ce qu'il soit réduit à un tiers de son volume original.

Le résidu liquide est rendu 0,1 M par addition de chlorure de sodium et la température est portée à 50° C. 45 g de chlorure de cêthylpyridinium sont ajoutés tandis que le produit est agité à 60 g/min. Ce mélange est agité pendant 60 minutes, et ensuite on

Méthodes de préparation

Exemple 1: Procédé d'obtention d'un mélange de fractions de hyalastine et de hyalectine sans activité inflammatoire

Des crêtes de coqs soit fraîches, soit congelées (3000 g) sont émincées dans un hachoir à viande et elles sont ensuite soigneusement homogénéisées dans un homogénéiseur mécanique. La pâte qui en résulte est placée dans un récipient en acier inoxydable AISI 316 ou dans un récipient en verre en même temps que 10 volumes d'acétone anhydre. Le contenu total est ensuite agité pendant 6 heures à une vitesse de 50 g/min et on laisse la séparation se poursuivre pendant 12 heures, puis élimine l'acétone par siphon-25 nage et le rejette.

Ce procédé d'extraction est répété jusqu'à ce que l'acétone rejetée ait atteint le niveau d'humidité (méthode de Karl-Fisher).

La substance qui en résulte est alors centrifugée et séchée sous vide à une température convenable pendant 5 à 8 heures. Avec ce 30 procédé, on obtient approximativement 500 à 600 g de poudre sèche à partir des crêtes de coqs.

300 g de la poudre sèche sont alors soumis à un processus de digestion enzymatique avec de la papaïne (0,2 g) dans un milieu aqueux tamponné avec un tampon de phosphate en présence d'une 35 quantité convenable de chlorhydrate de cystéine. Ce mélange est alors agité pendant 24 heures à 60 g/min et à une température constante de 60 à 65° C. La masse entière est refroidie à 25° C, on ajoute 60 g de Célite® et l'agitation est maintenue pendant encore une heure.

ajoute 50 g de Célite® sous agitation, la température du produit est ramenée à 25° C et le précipité formé est recueilli par centrifugation. Le précipité ainsi obtenu est mis en suspension dans une solution de 0,01 M de chlorure de sodium (5 litres) contenant 0,05% de chlorure 60 de cêthylpyridinium. On l'agite encore pendant 60 minutes à 50° C. La température est abaissée à 25° C et le précipité est centrifugé.

Le processus de lavage est alors répété trois fois et le précipité est finalement rassemblé dans des récipients contenant trois litres d'une solution 0,05M de chlorure de sodium contenant 0,05% de chlorure 65 de cêthylpyridinium. On agite à 60 g/min pendant 60 minutes et on maintient une température constante de 25° C pendant une période de deux heures. Le produit surnageant est éliminé par centrifugation.

20

Tableau 2

Caractéristiques chimiques et physiques

Fractions

P.M.

Viscosité dynamique à 20° C

Titre en acide hyaluronique en % de poudre sèche

Teneur dans les protéines calculée en albumine bovine (%)

Teneur en mucopolysacchari-des sulfurés (%)

Hyalastine + hyalectine

250000-350000

100 mP • s (conc. 1% p/v)

>96"

<0,5

<1

Hyalastine

50000-100000

600 mP • s (conc. 5% p/v)

>96

<0,5

<1

Hyalectine

500000-730000

170 mP ■ s (conc. 1% p/v)

>96

<0,5

<1

a Les valeurs consignées représentent le titre en HA après élimination dans l'eau. Par exemple, un titre de 96% indique que, après élimination d'eau, la poudre contient 4% d'impuretés et 96% d'acide hyaluronique.

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Ce mode opératoire est alors répété trois fois avec une solution de chlorure de sodium 0,1M contenant 0,05% de chlorure de cêthylpyridinium. Le mélange est centrifugé et ce qui surnage est rejeté. Le précipité est dispersé dans une solution de chlorure de sodium 0,30M contenant 0,05% de chlorure de cêthylpyridinium (3 litres). 5 Le mélange est agité et l'on recueille à la fois le précipité et le liquide clair. L'extraction est répétée sur le précipité encore trois fois en utilisant chaque fois 0,5 litre de la même solution aqueuse.

Finalement, le précipité résiduel est éliminé et les liquides clairs sont rassemblés dans un récipient unique. On augmente la tempéra- 10 ture du liquide à 50° C tout en agitant. Le liquide est alors porté à 0,23M avec du chlorure de sodium. On ajoute 1 g de chlorure de cêthylpyridinium et l'agitation est maintenue pendant 12 heures. Le mélange est refroidi à 25° C et il est ensuite filtré tout d'abord à travers des garnissages de Célite® et ensuite à travers un filtre (1 n). 15

Le mélange qui en résulte subit alors une ultrafiltration moléculaire supplémentaire à travers des membranes ayant une limite d'exclusion moléculaire de 30 000, en ultrafiltrant 3 volumes originaux avec addition d'une solution de chlorure de sodium 0,33M. L'addition de la solution de chlorure de sodium est interrompue et le 20 volume de liquide est réduit à un quart de son volume original.

La solution ainsi concentrée est précipitée sous agitation (60 g/min) à une température de 25° C avec trois volumes d'éthanol (95%). Le précipité est recueilli par centrifugation et ce qui surnage est rejeté. Le précipité est dissous dans un litre de solution de chlo- 25 rure de sodium 0,1M et le processus de précipitation est répété avec trois volumes d'éthanol à 95%.

Le précipité est recueilli et lavé, tout d'abord avec de l'éthanol à 75% (trois fois), ensuite de l'éthanol absolu (trois fois) et troisièmement avec de l'acétone absolue (trois fois). 30

Le produit ainsi obtenu (fraction de hyalastine + hyalectine) a un poids moléculaire moyen compris entre 250 000 et 350 000.

Le rendement en acide hyaluronique est égal à 0,6% du tissu frais original.

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Exemple 2: Méthode d'obtention de la fraction de hyalastine à partir du mélange obtenu par la méthode décrite dans l'exemple 1

Le mélange obtenu par la méthode décrite dans l'exemple 1 est dissous dans une eau distillée exempte de pyrogène en proportion de 10 mg de produit par millilitre d'eau. La solution ainsi obtenue subit 40 une ultrafiltration moléculaire à travers une membrane ayant une limite d'exclusion moléculaire de 200 000 avec une technique de concentration et sans addition d'eau sur la membrane. Durant le processus de filtration à travers les membranes ayant une limite d'exclusion de 200 000, les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 45 200 000 ne passent pas, tandis que les molécules plus petites passent à travers la membrane en même temps que l'eau. Pendant le processus de filtration, on n'ajoute pas d'eau dans le compartiment situé au-dessus de la membrane; de ce fait, le volume dans ce compartiment diminue et il se produit en même temps une augmentation de la concentration des molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 200000. On procède alors à une ultrafiltration jusqu'à ce que le volume sur la membrane soit réduit à 10% du volume initial. Deux volumes d'eau bidistillée exempte de pyrogène sont ajoutés et la solution est, de nouveau, ultrafiltrée jusqu'à ce que le volume soit réduit à un tiers. L'opération est répétée encore deux fois.

La solution qui passe à travers la membrane est portée à 1,0M avec du chlorure de sodium et elle est ensuite précipitée avec quatre volumes d'éthanol à 95%. Le précipité est lavé trois fois avec de l'éthanol à 75% est ensuite séché sous vide.

Le produit ainsi obtenu (fraction de hyalastine) a un poids moléculaire moyen compris entre 50 000 et 100 000.

Le rendement en acide hyaluronique est égal à 0,4% du tissu frais original.

Exemple 3: Méthode d'obtention de la fraction de hyalastine

La solution concentrée, rassemblée dans un récipient à partir de la membrane d'ultrafiltration ayant une limite d'exclusion moléculaire de 200 000 décrite dans l'exemple 2, est diluée avec de l'eau jusqu'à ce que l'on obtienne une solution contenant 5 mg/ml d'acide hyaluronique telle que déterminée par une analyse quantitative basée sur un essai de l'acide glycuronique.

La solution est portée à 0,1M dans le chlorure de sodium et elle est ensuite précipitée avec 4 volumes d'éthanol à 95%. Le précipité est lavé trois fois avec de l'éthanol à 75% et il est ensuite séché sous vide.

Le produit ainsi obtenu (fraction de hyalectine) a un poids moléculaire moyen compris entre 500000 et 730000. Cela correspond à une fraction d'acide hyaluronique spécifique ayant une longueur de chaîne moléculaire définie d'environ 250000 à 350000 motifs sac-charides avec un degré de pureté élevé.

Le rendement en acide hyaluronique est égal à 0,2% du tissu frais original.

Evaluation de l'activité biologique et pharmacologique

1. Activité biologique de la mobilisation cellulaire des fractions d'acide hyaluronique

La méthode consistant en la détermination de l'activité de détachement des fibroblastes dans une culture est utilisée comme méthode d'évaluation de l'activité de mobilisation des cellules des fractions de HA.

Des cellules de souris BALB 3T3 sont cultivées sur un milieu de Dulbecco modifié Eagle avec du sérum de veau à 10%, de la pénicilline (250 unités/ml) et de la streptomycine (0,25 mg/ml), et elles sont incubées dans 5% de C02 humidifié, 95% d'air à 37° C. A des fins expérimentales, des cellules sont inoculées de façon classique dans des boîtes de culture de tissu en plastique d'un diamètre de 60 mm (6 x 105 cellules/boîte).

Des monocouches confluentes de cellules 3T3 sont décantées et l'on ajoute du milieu frais contenant 2,0 mg/ml de différentes fractions de HA. A des intervalles fixes, le détachement des cellules est observé à la fois au microscope et par comptage des cellules mobilisées dans un compteur de Coulter.

Essais de détachement

Pour mesurer la cinétique du détachement, des cellules sont inoculées dans des boîtes de plastique et on les laisse se développer pendant 24 heures. Après ce laps de temps, le milieu de culture est décanté et du milieu frais contenant 2,0 mg/ml de HA est ajouté. Toutes les 24 heures, deux boîtes, une de culture test et une de culture témoin, sont décantées et à la fois les cellules se trouvant dans le surnageant et les cellules liées sont comptées dans un compteur de Coulter. Le tableau 3 donne les résultats obtenus avec des tests utilisant les fractions obtenues dans les exemples de préparation 1 à 3 ci-dessus.

( Tableau en tête de la page suivante )

Les données indiquées sur le tableau 3 montrent que la fraction de hyalastine manifeste une activité de mobilisation de cellules élevée, ce qui rend cette fraction utile aux applications de cicatrisation des plaies. Cette activité de mobilisation des cellules de la hyalastine stimule la migration et la prolifération des nouvelles cellules lorsqu'une préparation pharmaceutique de la fraction est appliquée à une zone de tissu endommagée.

La fraction de hyalectine manifeste une activité très limitée de mobilisation des cellules et elle n'est par conséquent pas utile pour la cicatrisation des plaies. Cependant, la hyalectine, à cause de son poids moléculaire moyen élevé et de sa viscosité inhérente, est utile pour les injections oculaires et intra-articulaires, et le manque d'activité appréciable de mobilisation des cellules est une caractéristique importante de la fraction d'hyalectine qui la rend spécialement utile pour les injections intra-oculaires et intra-articulaires.

2. Activité inflammatoire biologique des fractions d'acide hyaluronique

Pour cette évaluation, on utilise la méthode du comptage des cellules envahissantes après administration intra-oculaire chez le lapin.

55

60

666 897

Tableau 3 Résultats des études de mobilisation

Fraction

Concentration (mg/ml)

Nombre de cellules détachées par comparaison avec les témoins

% d'efficacité (par comparaison avec les témoins)

Témoin

2 xlO6

Hyalectine+hyalastine

2

3,5 x 10s

75

Hyalectine

2

2,1 x 106

5

Hyalastine

2

X >—»

0

150

40

Méthode is

Cinq (5) lapins de Nouvelle-Zélande ou de Californie pesant environ 2 kg, ayant une vision considérée comme parfaite, sont utilisés pour ce test. L'extérieur de l'œil des lapins est vérifié pour les processus inflammatoires au niveau macroscopique, et l'intérieur de l'œil est vérifié à l'ophtalmoscope. Si le fond de l'œil est clairement 20 visible et normal, le test peut avoir lieu.

Les animaux sélectionnés subissent une anesthésie locale par instillation de quelques gouttes d'un anesthésique stérile convenant en ophtalmologie; on instille également quelques gouttes d'atropine en solution ophtalmologique. 25

Le test est mis en œuvre dans des conditions stériles. On fait ressortir le globe oculaire en exerçant une pression jusqu'à ce qu'il soit possible d'injecter, à travers la sclérotique à environ 5 à 6 mm du bord de la cornée, au centre de l'humeur vitrée, 100 [il de la solution à l'aide d'une aiguille de 26G. L'autre œil est pris comme témoin. On 30 instille deux gouttes de solution d'antibiotique dans l'œil traité, et les animaux sont alors placés seuls dans des cages.

Après 50 à 60 heures, le test peut continuer. Les yeux sont vérifiés de la même façon que ci-dessus pour la sélection des animaux. Les animaux sont sacrifiés avec une injection intraveineuse de pento- 35 thaï. Ensuite, l'humeur aqueuse est, tout d'abord, recueillie (environ 0,2 ml) au moyen d'une seringue à insuline avec une aiguille 26G. Les globes oculaires sont ensuite énucléés, débarrassés de toute matière étrangère, lavés dans une solution saline, séchés sur papier, incisés et ouverts dans des boîtes de Pétri; on sépare la partie principale de l'humeur vitrée et on la rassemble avec une seringue stérile (environ 0,7 ml). L'humeur vitrée est placée dans des petits tubes à essai de polyéthylène et l'on ajoute 50 (il de hyaluronidase (100 U NF/ml). Le mélange est alors maintenu à une température de 37° C pendant environ 3 heures pour rendre la solution moins visqueuse.

Un comptage de leucocytes est effectué au microscope à contraste de phase (120 x ) dans une chambre de Burker. Une série de comptages est effectuée sur chaque échantillon; on calcule les valeurs moyennes et l'on exprime le résultat en nombre de leucocytes par mm3.

Le test est considéré comme positif lorsque:

1. les yeux examinés ne montrent pas de signe de dommage, et

2. le nombre moyen de leucocytes provenant d'au moins quatre des cinq yeux traités n'excède pas 200 par mm3 et le nombre moyen de leucocytes provenant de chaque œil témoin n'excède pas 50 par mm3.

Le tableau 4 indique les résultats obtenus à partir de cette évaluation en utilisant les fractions de HA obtenues dans les exemples de préparation 1 à 3 discutés ci-dessus. 60

Les résultats indiqués sur le tableau 4 indiquent que les fractions de hyalastine et de hyalectine ne manifestent pas d'activité inflammatoire supérieure à celle du témoin, et la fraction combinée de hyalastine et de hyalectine montre seulement une augmentation négligeable de l'activité inflammatoire par rapport au témoin. Par consé- 65 quent, les fractions de hyalastine et de hyalectine sont pharmaceutiquement utiles sans manifester d'effets secondaires inflammatoires indésirables. Ces résultats confirment, également, encore la décou-

Tableau 4

Résultats des études d'activité inflammatoire

Fraction

Nombre de cellules envahissantes

Témoin

25

Hyalastine+hyalectine

32

Hyalastine

20

Hyalectine

22

Fraction inflammatoire (PM moyen de 30 000)

150

Acide hyaluronique total provenant de crêtes de coqs (RF. Swann D. A. 1968, B.B.A. 156, 17-29}

120

50

55

verte de la titulaire que c'est la fraction de HA ayant un poids moléculaire moyen faible inférieur à 30 000 qui est responsable de l'activité inflammatoire des préparations de HA. L'acide hyaluronique provenant des crêtes de coqs préparées selon la méthode décrite dans la littérature par Swann (Swann D.A., 1968, B.B.A. 156,17-29) présente une remarquable activité inflammatoire.

Il a été ainsi démontré que la fraction de hyalastine ayant un poids moléculaire moyen d'environ 50 000 à 100 000 manifeste une activité de mobilisation des cellules élevée et qu'elle est, par conséquent, utile dans les applications de cicatrisation des plaies sans manifester de réactions inflammatoires indésirables. La fraction de hyalectine ayant un poids moléculaire moyen d'environ 500000 à 730 000 a été démontrée comme étant utile pour faire des injections oculaires et intra-oculaires à cause de son poids moléculaire élevé et de sa viscosité inhérente et parce que, en même temps, elle ne stimule pas l'activité de mobilisation des cellules ou lès réactions inflammatoires qui sont des effets secondaires indésirables à éviter dans ces applications pharmaceutiques.

Plus spécifiquement, on a trouvé que la fraction de hyalastine était utile comme préparation de cicatrisation des plaies à cause des caractéristiques suivantes :

1. La préparation favorise un temps de cicatrisation remarquablement raccourci par comparaison aux thérapeutiques classiques, l'assainissement de la zone affectée étant rapide, une régularisation des bordures des ulcères, un développement vigoureux des tissus de granulation, une activation de la migration cellulaire des macrophages et des fibroblastes et une épithélisation précoce.

2. La préparation favorise une préparation accélérée de la chirurgie reconstructive dans les cas plus sévères.

3. Absence de formation de kéloïde ou de cicatrisation de rétraction avec remise en forme finale du tissu cicatriciel procurant de bons résultats esthétiques et fonctionnels.

On a trouvé que la préparation de hyalastine était utile pour le traitement de diverses plaies, y compris les escarres de décubitus (escarres de lits), ulcères trophiques, brûlures, plaies atones, ulcères post-traumatiques, ulcères variqueux et ulcères post-phlébitiques à la suite de diverses taches veineuses, nécroses radiologiques, lésions de la peau, greffes de peau et lésions de la peau dues à l'herpès

7

666 897

simplex. Pour ces traitements de cicatrisation des plaies, la préparation de hyalastine ou son sel de sodium peut être administrée par différentes méthodes telles que tampon de gaz, crème, pulvérisation ou ampoules pour injection intradermique. Pour les applications topiques sous forme de crème ou d'un tampon de gaz, la hyalastine est, de préférence, combinée avec un agent émulsionnant qui absorbe l'exsudat provenant de la zone exposée tout en procurant une excellente diffusion de l'acide hyaluronique et un excipient dis-persible dans l'eau, de telle sorte que le pansement de la plaie s'enlève facilement.

La fraction de hyalastine a été trouvée particulièrement utile pour le traitement des chevaux, particulièrement des chevaux de course souffrant de désordres et de maladies articulaires causés par un traumatisme aigu ou chronique, des infections ou des injections de corticostéroïde intra-articulaires répétées. Des désordres spécifiques que l'on peut traiter avec la hyalectine sont, par exemple, les ostéoarthroses avec ou sans signes inflammatoires, la synorithe aiguë ou chronique, les processus dégénératifs dans les cartilages articulaires et les maladies articulaires sèches. Les symptômes les plus fréquents de ces désordres sont, généralement, une douleur, une fonction endommagée de l'articulation et une flexion diminuée de l'articulation. On a trouvé que la fraction de hyalectine selon l'invention favorisait une réduction notable du temps de cicatrisation pour ces chevaux affectés, par comparaison aux thérapeutiques classiques, favorisant une amélioration précoce et durable du fonctionnement des articulations et réduisant la douleur et l'infirmité. On pense que ces effets cliniquement avantageux sont favorisés par une normalisation de la viscoélasticité du fluide synovial et par l'activation des processus de réparation des tissus dans les cartilages articulaires.

En outre, tous les effets avantageux ci-dessus sont favorisés par la fraction de hyalectine en l'absence d'effets toxiques, locaux et/ou systémiques. Une administration répétée de hyalectine ne donne pas de signe de réaction allergique ni d'aucun effet nocif ou durable.

Préparations pharmaceutiques

La description ci-dessus a montré que les fractions de hyalastine et de hyalectine avaient une bonne activité en applications pharmaceutiques. Les exemples suivants ne sont donnés que pour décrire des préparations pharmaceutiques susceptibles d'être employées pour une administration in vivo efficace des fractions de HA.

A. Préparations de cicatrisation des plaies Exemple 1: Ampoules pour injection intradermique Chaque ampoule contient:

— sel de sodium de hyalastine 4 mg

— chlorure de sodium 16 mg

— eau pour injection, q.s.p. 2 ml

Exemple 2: Ampoules pour injection intradermique Chaque ampoule contient:

— sel de potassium de hyalastine 5 mg

— chlorure de sodium 8 mg

— eau pour injection, q.s.p. 1 ml

Exemple 3: Bouteille de pulvérisation pour application topique Chaque bouteille contient:

— sel de sodium de hyalastine 20 mg

— chlorure de sodium 80 mg

— eau pour injection, q.s.p. 10 ml

Exemple 4: Bouteille de pulvérisation pour application topique Chaque bouteille contient:

— sel de potassium de hyalastine 30 mg

— mannitol 100 mg

— eau pour injection, q.s.p. 10 ml

Exemple 5: Crème pour application topique Chaque tube de crème contient:

— sel de potassium de hyalastine 25 mg

1000 mg 500 mg 150 mg 200 mg 150 mg 10 mg 7,5 mg 5 mg 10 g

30 mg 3 mg 1000 mg 500 mg 150 mg 200 mg 150 mg 10 mg 7,5 mg 5 mg 10 g

Exemple 7: Tampon de gaze contenant des médicaments pour application topique

Chaque tampon de gaze mesurant 10x10 cm, contient:

— sel de sodium de hyalastine 3 mg

— glycérol 1 g 30 — polyéthylèneglycol 2 g

— eau redistillée, q.s.p. 3 g

Exemple 8: Tampon de gaze chargé de médicament pour application topique

3J Chaque tampon de gaze mesurant 10 x 10 cm, contient:

— sel de potassium de hyalastine 6 mg

— gelée de paraffine 0,5 mg

— glycérol 1 g

— polyéthylèneglycol 2 g 40 — eau redistillée, q.s.p. 3 g

Exemple 9: Poudre sèche pour application en cicatrisation des plaies

Chaque gramme de poudre sèche contient:

— sel de sodium de hyalastine 10 mg 45 — mannitol 0,75 g

— glycine 0,24 g

B. Préparations pour utilisation intra-oculaire Exemple 10: Fioles de 1 ml

50 Chaque fiole contient:

— sel de sodium de hyalectine 10 mg

— chlorure de sodium 8 mg

— phosphate de sodium monobasique 2H20 0,25 mg

— phosphate de sodium dibasique 12H20 3 mg 55 — eau pour injection, q,s,p, 1 ml

Exemple 11: Fioles de 5 ml Chaque fiole contient:

— sel de potassium de hyalectine 60 mg 60 — mannitol 50 mg

— phosphate de sodium monobasique 2H20 1,25 mg

— phosphate de sodium dibasique 12H20 15 mg

— eau pour injection, q.s.p. 5 ml

65 Exemple 12: Seringues préremplies Chaque seringue contient:

— sel de sodium de hyalectine 40 mg

— chlorure de sodium 16 mg

— monostéarate de polyéthylèneglycol 400

— cétiole (ester décylique de l'acide oléique)

— lanette SX (alcool cétylstéarique + laurylsulfate 9/1)

— glycérol 5 — sorbitol

— déhydrocaétate de Na

— p-oxyméthylbenzoate

— p-oxypropylbenzoate

— eau redistillée, q.s.p.

10 Exemple 6: Crème pour application topique

Chaque tube de crème contient:

— sel de sodium de hyalastine

— gelée de paraffine

15 — monostéarate de polyéthylèneglycol 400

— cétiole (ester décylique de l'acide oléique)

— lanette SX (alcool cétylstéarique x laurylsulfate 9/1)

— glycérol

— sorbitol

20 — déhydroacétate de Na

— p-oxyméthylbenzoate

— p-oxypropylbenzoate

— eau redistillée, q.s.p.

666 897

8

— phosphate de sodium monobasique 2H20 0,8 mg

— phosphate de sodium dibasique 12H20 8,16 mg

— eau pour injection, q.s.p. 2 ml

C. Préparations pour utilisation intra-articulaire Exemple 13: Fioles de 2 ml Chaque fiole contient:

— sel de sodium de hyalectine 40 mg

— chlorure de sodium 16 mg

— eau pour injection, q.s.p. 2 ml

Exemple 14: Fioles de 4 ml Chaque fiole contient:

— sel de potassium de hyalectine 60 mg

— mannitol 35 mg

— glycine 10 mg

— eau pour injection, q.s.p. 4 ml

Exemple 15: Seringues préremplies Chaque seringue contient:

— sel de sodium de hyalectine 25 mg

— chlorure de sodium 12 mg

— mannitol 10 mg

— phosphate de sodium monobasique 2H20 0,5 mg

— phosphate de sodium dibasique 12HzO 6 mg

— eau pour injection, q.s.p. 2 ml

Bien que les préparations ci-dessus aient été décrites à titre d'exemples, on comprendra que d'autres formulations pharmaceutiques peuvent se préparer en combinant les fractions de hyalastine et de hyalectine découvertes par la titulaire, ou leurs sels de potassium ou de sodium, avec d'autres véhicules pharmaceutiquement acceptables, diluants ou excipients et, à diverses doses, en fonction de l'utilisation particulière de la formulation.

Pour des utilisations de cicatrisation des plaies, les préparations de fractions de hyalastine sont appliquées aux zones de la peau affectées sous une des formes de dosages discutées ci-dessus, c'est-à-dire soit sout forme de crème, de pulvérisation, de tampon de gaze, de poudre sèche ou d'injection intradermique. Pour des utilisations intra-articulaires, les préparations de hyalectine sont généralement administrées à une dose de 2 ml par articulation, soit à partir d'une fiole préparée, soit à partir d'une seringue préremplie, comme décrit ci-dessus.

Dans une étude supplémentaire, on a examiné la capacité et l'efficacité de l'acide hyaluronique comme véhicule de diverses molécules, en particulier comme véhicule de drogues ophtalmiques, garantissant une tolérabilité et une compatibilité parfaites (c'est-à-dire absence de phénomène de sensibilisation) avec l'épithélium cornéen. On considère que l'acide hyaluronique a un intérêt particulier comme véhicule ophtalmique. Comme discuté ci-dessus, le HA est un glycose aminoglycane présent dans divers tissus conjonctifs et liquides biologiques (tel que le fluide synovial et, en particulier, l'humeur vitreuse) où, à cause de sa nature physique et chimique et de ses caractéristiques viscoélastiques frappantes, il joue un rôle structural et biologique d'une importance fondamentale.

Ainsi, on a conduit une étude pour examiner l'utilisation de fraction de HA ayant différents poids moléculaires, notamment les fractions de hyalastine et de hyalectine et un mélange de celles-ci pour la préparation de diverses formes pharmaceutiques telles que collyres, gels, crèmes, inserts ou poudres sèches. De ce fait, des médicaments ophtalmiques de différents types sont étudiés en vue d'obtenir une large compréhension de l'utilisation potentielle de ce polymère biologique dans ces différentes fractions en tant que véhicule.

Les expériences décrites ci-après visent à déterminer si des formulations contenant de l'acide hyaluronique comme excipient sont capables d'améliorer la disponibilité biologique des médicaments véhiculés ou de produire un effet synergique en combinaison avec les médicaments véhiculés, notamment avec les médicaments ayant une activité ou une utilité ophtalmique. Ces capacités potentielles de HA comme véhicule sont étudiées dans l'œil du lapin avec quatre médicaments ophtalmiques ayant des types et des actions différents, en particulier le nitrate de pilocarpine, la triamcinolone, le facteur de croissance épidermique (EGF) et un antibiotique tel que la streptomycine et la gentamicine. Tous ces médicaments sont connus pour avoir une efficacité myotique anti-inflammatoire cicatrisante et antimicrobienne. En outre, l'évaluation de l'activité de l'antibiotique streptomycine véhiculé par l'acide hyaluronique est très importante, parce que c'est l'un des antibiotiques les plus largement utilisés dans les infections oculaires.

Les modèles expérimentaux étudiés et les expériences effectuées sont les suivantes:

1) activité myotique du nitrate de pilocarpine véhiculé par l'acide hyaluronique dans l'œil du lapin;

2) activité anti-inflammatoire de la triamcinolone véhiculée par l'acide hyaluronique dans le modèle de l'inflammation induite par le textrane dans l'œil du lapin;

3) activité cicatrisante du facteur de croissance de l'épiderme (EGF) véhiculé par l'acide hyaluronique dans un modèle de lésion épithê-lienne de cornée du lapin;

4) activité antimicrobienne de la streptomycine véhiculée par l'acide hyaluronique contre le Bacillus substilus 6633 sur des plantes d'agar-agar.

I. Activité myotique du nitrate de pilocarpine véhiculé par l'acide hyaluronique

Matières

Les matières suivantes sont utilisées comme excipients de la pilocarpine pour les diverses formulations de nitrate de pilocarpine:

— sel de sodium de l'acide hyaluronique, fraction de hyalastine (p.m. approximativement 100000) à une concentration de 10 mg/ml et 20 mg/ml;

— sel de sodium de l'acide hyaluronique, fraction de hyalectine (p.m. 500 000 à 730 000) à une concentration de 10 mg/ml et

20 mg/ml;

— alcool polyvinylique à 5% comme excipient ophtalmique comparatif.

Diverses formulations à 2% (collyre ou gel) de nitrate de pilocarpine sont préparées et véhiculées en ajoutant les deux fractions différentes de sels de sodium de HA à une concentration de 10 et 20 mg/ml. Les solutions suivantes sont préparées:

Formulation 1: solution saline avec nitrate de pilocarpine (PiN03) (2%), utilisée comme référence.

Formulation 2: solution de PiN03 (2%) véhiculée dans de l'alcool polyvinylique à 5% (utilisée comme référence).

Formulation 3: solution de PiN03 (2%) véhiculée dans du sel de sodium de la fraction de hyalastine (10 mg/ml).

Formulation 4: solution de PiN03 (2%) véhiculée dans du sel de sodium de la fraction de hyalastine (20 mg/ml).

Formulation 5: solution de PiN03 (2%) véhiculée dans du sel de sodium de la fraction de hyalastine (10 mg/ml).

Formulation 6: solution de PiN03 (2%) véhiculée dans du sel de sodium de la fraction de hyalastine (20 mg/ml).

Méthode

Des lapins albinos de Nouvelle-Zélande sont utilisés (poids 2 à 2,5 kg). La formulation à tester est instillée dans un œil avec une microseringue (10 1); l'autre œil sert de témoin. Dans tous les cas, on mesure le diamètre de la pupille à des intervalles de temps convenables. Chaque solution est testée sur au moins 8 lapins. Chaque œil n'est pas traité plus de trois fois et une période de repos d'au moins une semaine est observée entre chaque traitement.

Paramètres mesurés

Les diamètres de pupilles sont mesurés à divers intervalles en vue de déterminer la courbe d'activité myotique dans le temps. Les para5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

666 897

mètres d'activité suivants sont ensuite calculés à partir de la courbe myosis/temps:

Imax = différence maximum de diamètre de la pupille entre l'œil traité et la référence.

Temps de pic = temps nécessaire pour atteindre Imax. 5

Durée = temps nécessaire pour restaurer les conditions de base. Plateau = période d'activité myotique absolue.

AUC = zone sous myosis/courbe de temps.

Résultats 10

Les résultats des tests sont indiqués sur le tableau 5. On peut voir, d'après les données des divers paramètres mesurés à partir de la courbe de temps d'activité myotique pour toutes les solutions testées, que l'addition d'acide hyaluronique à une solution de nitrate 15 de pilocarpine à 2% donne lieu à une augmentation de l'activité myotique du médicament. En fait, la disponibilité biologique du médicament peut être jusqu'à 2,7 fois plus importante que celle de la solution aqueuse contenant du nitrate de pilocarpine à 2% (formulation 1). 20

On doit aussi noter qu'il y a une augmentation statistique significative d'activité lorsque la fraction de hyalectine et la fraction d'acide hyaluronique sont utilisées toutes les deux à 10 et 20 mg/ml comme véhicules (formulations 5 et 6), au contraire de la solution de nitrate de pilocarpine véhiculée par l'alcool polyvinylique (formula- 25 tion 2).

L'utilisation de l'acide hyaluronique comme véhicule est particulièrement intéressante parce que l'activité myotique du nitrate de pilocarpine dure plus longtemps lorsqu'elle est véhiculée avec cette substance. C'est-à-dire que, pour les formulations contenant l'acide hyaluronique, le temps nécessaire pour restaurer le diamètre de la pupille aux conditions de base va jusqu'à 190 minutes (formulation 6) par comparaison avec les 110 minutes nécessaires pour la pilocarpine avec une solution saline seule (formulation 1).

II. Activité anti-inflammatoire de la trianicinolone véhiculée par l'acide hyaluronique

Matières

On utilise les matières suivantes:

— une fraction de sel de sodium d'acide hyaluronique-hyalectine, p.m. entre 500000 et 730000,10 mg/ml dans une solution saline;

— solution de triamcinolone (10% dans une solution saline).

Méthode

Les expériences sont effectuées sur des lapins mâles de Nouvelle-Zélande (poids moyen 1,6 kg). Après une période d'adaptation de cinq jours, l'inflammation intra-oculaire est induite dans les lapins par injection intra-oculaire de dextrane (10%, 0,1 ml). L'administration est effectuée dans les deux yeux, sous anesthésie locale, avec de la Novésina à 4%, en insérant l'aiguille de la seringue de 4 mm dans la chambre antérieure à une distance de 2 mm du pourtour de la cornée. Le test est conduit sur dix animaux.

Tableau 5

Activité biologique de formulations ophtalmiques contenant pilocarpine-nitrate véhiculé par l'acide hyaluronique"

Formulation

Véhicule

Imax. mm

(à LF 95%)

Temps de pic (en min)

Durée (en min)

Plateau (en min)

AUC, cm2 (± LF 95%)

AUC relative

1

Solution saline

1,93±0,35

20

110

—

117± 28

1

2

Alcool polyvinylique à 5%

2,33 ±0,28

20

140

—

192 ±32

1,64

3

Hyalastine (10 mg/ml)

2,50 ±0,42

20

120

—

240 ±40

2,05

4

Hyalastine (20 mg/ml)

2,58 ±0,38

30

150

—

208 ±41

1,78

5

Hyalectine (10 mg/ml)

2,50 ±0,38

15

170

—

242 ±48

2,06

6

Hyalectine (20 mg/ml)

2,10±0,38

20

190

45

320 ±45

2,73

a Les valeurs indiquées représentent la valeur moyenne de huit essais.

Traitement

Un traitement est effectué sur chaque animal, à la fois dans l'œil droit et dans l'œil gauche par instillation de trois gouttes, trois fois par jour pendant six jours en tout de ce qui suit:

— une solution de triamcinolone (10% dans une solution saline) dans l'œil gauche (LE);

— une solution de sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction de hyalectine, (10 mg/ml) + triamcinolone (10%) dans l'œil droit (RE).

Paramètres

L'effet anti-inflammatoire sur la réaction phlogistique induite par le dextrane est évalué en observant l'œil avec une lampe fendue aux intervalles suivants: 0,1 heure, 3 heures, 24 heures, 48 heures, 3 jours, 4jours, 5 jours et 6 jours.

A ces intervalles, l'examen de l'œil conduit aux observations suivantes:

— l'état de la cornée et de la conjonctive pour déceler la présence possible d'hypermia, œdème et notamment observation de l'iris qui est normalement sensible au processus phlogistique après injection intra-oculaire d'agents inflammatoires;

— effet Tyndall dans lequel la présence d'une opacité plus ou moins intense («nubecula») est indicative de la présence d'éléments corpus-culents (inflammatoire) dans la chambre antérieure.

Le résultat des observations est exprimé en termes de notations subjectives (de 0 à 3) liées à la progressivité de l'effet observé.

45

Resultats

On peut voir, d'après les résultats reportés dans le tableau 6, que l'administration de la triamcinolone a un effet anti-inflammatoire sur l'iris et occasionne la disparition de l'opacité (effet Tyndall) dans 50 la chambre antérieure. Le processus inflammatoire qui est évident à partir de la première à la troisième heure jusqu'au quatrième jour décroît progressivement jusqu'à ce que des conditions sensiblement normales soient rétablies avec une limpidité parfaite de l'œil le sixième jour. D'autre part, l'administration du sel de sodium de 55 l'acide hyaluronique, fraction hyalectine, en même temps que la triamcinolone réduit l'inflammation intra-oculaire observée au moment discuté ci-dessus par rapport à l'administration de la triamcinolone seule. C'est-à-dire que le processus phlogistique dans l'iris et l'opacité dans la chambre antérieure semblent avoir diminué à la 24e heure, avec une réduction progressive jusqu'à la 48e heure et avec une absence totale de réaction inflammatoire à partir du 4e jour.

Dans la conjonctive et la cornée, on n'observe sensiblement pas de réaction notoire après injection intra-oculaire de dextrane. 65 Ainsi, l'administration de triamcinolone en même temps que de la fraction d'acide hyaluronique conduit à une activité améliorée du médicament, ce que met en évidence le rétablissement plus rapide de l'œil du lapin.

60

666 897 10

Tableau 6

Effet de la combinaison de l'acide hyaluronique et de la triamcinolone sur l'inflammation intra-oculaire induite par le dextrane

Intervalle d'observation

0

1 h

3 h

24 h

48 h

3 j

4j

5j

6j

Notation évaluée°

LE RE

Conjonctive Cornée Tyndall Iris

O O O O

o o o o o o o o o o o o

0,2 0,0 1,0 0,2 1,0 1,2 0,5 0,7

0,0 0,0 0,0 0,7 3,0 3,0 2,7 2,7

0,0 0,0 0,1 0,0 3,0 2,1 3,0 2,5

0,0 0,0 0,0 0,0 3,0 1,2 3,0 1,2

0,0 0,0 0,0 0,0 3,0 0,2 3,0 0,4

0,0 0,0 0,0 0,0 2,2 0,0 2,4 0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 1,2 0,0 1,5 0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,4 0,0 0,5 0,0

LE = œil gauche traité avec la triamcinolone.

RE = œil droit traité avec la triamcinolone et la hyalectine.

s Chaque valeur est la moyenne de sept observations sur un total de sept animaux et elle est exprimée en termes de notation subjective entre entre 0 et 3, en relation avec la progressivité de l'effet observé.

III. A ctivité de cicatrisation du EGF véhiculé dans l'acide hyaluronique

Matières

On utilise les matières suivantes:

Formulation A : EGF (facteur de croissance épidermique) dissous dans une solution saline (0,5 mg/5 ml).

Formulation B: sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalastine (p.m. approximativement 100000) dissous dans une solution saline (10 mg/ml).

Méthodes

Les expériences sont menées sur des lapins mâles albinos de Nouvelle-Zélande (poids moyen 1,8 kg). Les animaux, après une période d'adaptation d'environ 5 jours, subissent une lésion épithé-lienne de la cornée dans les conditions convenables d'anesthésie locale avec la Novésina (4%). La lésion consiste en une scarification monoculaire d'une zone circulaire de la zone optique effectuée par un cylindre de verre concave (3 mm) ayant un bord coupant.

Traitement

Les animaux sont subdivisés en groupes, chaque groupe étant constitué de cinq animaux, et ils sont soumis à un traitement phar-macologique par instillation dans la conjonctive de ce qui suit:

Le traitement est effectué sur l'œil droit (RE) par instillation dans la conjonctive de deux gouttes toutes les huit heures pour trois administrations au total.

Paramètres

La cicatrisation de l'épithélium cornéen est évaluée par observation de l'œil et par documentation photographique avec une lampe fendue à divers intervalles après scarification: 0, 8 heures, 16 heures, 24 heures, 32 heures, 40 heures et 48 heures.

Résultats

L'examen ophtalmologique 1, tel qu'indiqué sur le tableau 7, révèle que pour les témoins (groupe 1) une cicatrisation complète est obtenue (5 animaux sur 5) 48 heures après la lésion. Chez les animaux traités par EGF (groupe 2), le processus de cicatrisation est apparent déjà 24 heures après scarification avec une efficacité considérable (4 animaux sur 5). Chez les animaux traités avec la formulation C comprenant le sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction 25 hyalastine + EGF (groupe 3), le processus de cicatrisation est complet chez tous les animaux (5 sur 5) déjà 16 heures après scarification.

Ces résultats montrent que l'utilisation de la hyalastine, fraction d'acide hyaluronique comme véhicule pour l'EGF accélère le proces-30 sus de cicatrisation en favorisant une cicatrisation efficace plus rapide des lésions cornéennes.

(Tableau en tête de la page suivante)

IV. Activité antimicrobienne de la gentamicine véhiculée par l'acide 35 hyaluronique

Matières

On utilise les matières suivantes;

— gentamicine dissoute sans solution saline (50 mg/ml); 40 — sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction hyalectine (2 mg/ml).

Méthode

Une phlogose septique est causée dans chaque œil de 11 lapins par injection intra-oculaire d'une suspension titrée de Pseudomonas 45 aeruginosa (0,1 ml). Chez les lapins présentant une phlogose septique, on administre de l'acide hyaluronique, fraction hyalectine en combinaison avec de la gentamicine par instillation dans l'œil droit, et de la gentamicine dans un véhicule constitué d'une solution saline tamponnée est administrée dans l'œil gauche. Le traitement (trois 50 gouttes toutes les six heures) commence immédiatement après l'injection de l'agent infectant et on le poursuit jusqu'à ce que l'infection disparaisse. Les yeux sont observés tous les jours sous une lampe à fentes.

55 Résultats

Le traitement à l'aide de la combinaison gentamicine acide hyaluronique conduit à une disparition plus rapide de l'infection septique par comparaison avec le cas de l'administration de l'antibiotique seul. Cette conclusion apparaît d'après les données présentées 60 sur le tableau 8.

(Tableau en page suivante)

Les valeurs sont exprimées en pourcentage (nombre d'yeux guéris de la phlogose par rapport au nombre d'yeux traités). 65 + = différence significative par rapport au véhicule tampon (moins de 0,05, T-test exact de Fisher).

Des échantillons supplémentaires, bien que cette liste ne soit pas limitative, de médicaments ophtalmiques que l'on peut véhiculer

Groupes

Traitement

Groupe 1 (témoin) Groupe 2 Groupe 3

Solution saline

Solution EGF (formulation A)

Solution de sel de sodium d'acide hyaluronique, fraction de hyalastine+solution d'EGF

Combinaison de formulation A+formulation B dans un rapport 1/1, pour obtenir une formulation C

11

666 897

Tableau 7

Guérison des lésions de l'épithélium cornéen

Groupe

Traitement

Heures après scarification

16

24 48

Saline

+ + + + +

+ + +

+ + + + +

EGF (formulation A)

+ + + + +

Acide hyaluronique + EGF (formulation C)

+ + + + +

+ = œil non cicatrisé — = œil cicatrisé

Tableau 8

Effet de la gentamicine véhiculée par l'acide hyaluronique, fraction hyalectine sur la phlogose spectique intra-oculaire

Traitement

Jours à partir du début de la phlogose

1

2

3

4

5

6

7

Gentamicine + véhicule tampon salin Gentamicine + fraction acide hyaluronique hyalectine

O o ' o o o o o o

0,0 9,0+

0,0 27,2+

0,0

72,7+

36,3 100

100 100

avec des fractions de HA selon la présente invention sont les suivants:

antibiotiques chloramphênicol néomycine auréomycine myxine et polymyxine bacitricine mycétines hormones . nandrolone et sulfate de nandrolone anesthésiques (locaux) . . hénoxinate et son chlorhydrate antiviral ........ iodocéoxyuridine iodocéoxycytidine anti-inflammatoires . . . dexaméthasone et son phosphate vasopresseurs et vasocons-

tricteurs synéphrine et néosynéphrine

Conclusions

Sur la base des résultats obtenus à partir des expériences discutées ci-dessus, on peut conclure que des solutions de sels d'acide hyaluronique (à la fois dans les fractions hyalastine et hyalectine) peuvent être utilisées comme véhicules pour des médicaments ophtalmiques et s'avèrent très efficientes en tant que telles pour divers types de médicaments ayant différentes actions biologiques. Par exemple, des médicaments comprenant des agents antiglaucomes tels que le nitrate de pilocarpine, des agents antiallergiques et antiinflammatoires tels que triamcinolone, des agents favorisant la cicatrisation des tissus et la prolifération des cellules, des agents favorisant la cicatrisation des tissus de l'œil tels que EGF et des antibiotiques tels que streptomycine et gentamicine dont on indique respectivement les activités myotiques anti-inflammatoires, cicatrisantes et antimicrobiennes, peuvent tous être administrés avec efficacité en utilisant le HA comme véhicule.

35 Les formulations de médicaments ophtalmiques véhiculés dans les fractions d'acide hyaluronique ayant divers poids moléculaires sont parfaitement tolérés par l'hôte et compatibles avec l'épithélium cornéen sans donner lieu, cependant, à des phénomènes de sensibilisation.

40 II est également possible, à partir des données, d'observer que ce produit biologique, l'acide hyaluronique, est un véhicule efficace capable d'améliorer la disponibilité biologique in vivo des médicaments véhiculés, et de renforcer l'activité pharmacologique de ces médicaments. L'utilisation des fractions d'acide hyaluronique 45 comme véhicule de médicaments a particulièrement comme résultats:

— une augmentation de l'activité myotique du nitrate de pilocarpine, tout en prolongeant le temps d'activité du médicament;

— une augmentation d'activité anti-inflammatoire de la triamcino-50 Ione dans l'inflammation intra-oculaire induite par le dextrane, avec une régression du processus phlogistique dans des temps plus courts que ceux que l'on obtient avec la triamcinolone seule;

— augmentation de l'action protectrice du facteur de croissance épi-dermique (EGF) sur les lésions superficielles de la cornée avec un sy-

55 nergisme évident et réduction des temps de cicatrisation par comparaison avec le temps de récupération observé avec l'EGF seul, et

— augmentation dans l'activité biologique in vivo des antibiotiques tels que la gentamicine.

50 Les résultats obtenus en utilisant ce polymère biologique, l'acide hyaluronique, comme véhicule pour des médicaments avec des effets de natures si diverses, permettent l'extrapolation de son potentiel comme véhicule de nombreux autres médicaments ophtalmiques. On indique, ci-dessous, divers exemples de diverses formulations 65 de médicaments ophtalmiques pouvant se trouver sous forme de poudres, collyres, gels, crèmes ou inserts, dans lesquels l'acide hyaluronique sous la forme de ces différentes fractions hyalastine et hyalectine est le seul excipient utilisé.

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Exemple 2:

Collyre pouvant être utilisé comme «larmes artificielles» contenant:

Exemple 1 : Exemple 5:

Collyre pouvant être utilisé comme «larmes artificielles» conte- Une poudre pour application topique contenant de la streptomy-

nant: cine. 100 g de poudre contiennent:

- sel de sodium d'acide hyaluronique, ~ sel de sodium d'acide hyaluronique,

fraction hyalectine 10 mg 5 fraction hyalastine 70 mg

- solution saline tamponnée avec du phosphate à pH 6 10 ml - sel de sodlum d'ac,de hyaluronique,

fraction hyalectine 28,5 mg

— streptomycine 1,5 g

Bien que les préparations ci-dessus aient été données à titre d'exemple, on appréciera que les formulations pharmaceutiques peuvent se préparer en combinant les fractions hyaluroniques, no-sel de sodium d'acide hyaluronique, tamment les fractions hyalectines ou hyalastines ou la fraction com-

fraction hyalectine 20 mg binée hyalectine/hyalastine ou leurs sels de sodium ou de potassium

- solution saline tamponnée avec du phosphate à pH 6 10 mg avec d'autres médicaments actifs avec diverses doses en fonction de l'utilisation particulière de la formulation.

Exemple 3: L'acide hyaluronique, notamment dans les fractions de hyalec-

Un gel contenant de l'EGF dans lequel 100 g contiennent: tine et de hyalastine sensiblement pures, a donc été démontré comme

- sel de sodium d'acide hyaluronique, étant un véhicule ou exciPient efficace utilisable en combinaison avec fraction hyalastine 55 mg 20 diverses drogues médicaments ayant une utilité ou une activité oph-

- sel de sodium d'acide hyaluronique, talmique. Les compositions pharmaceutiques contenant les fractions fraction hyalectine 30 mg de comme véhicules de médicaments sont particulièrement utiles

— EGF 0,5 g parce que les fractions de HA manifestent un niveau élevé de toléra-

eau (^istillée 25 5 g Milité pour l'œil et une compatibilité élevée avec l'épithélium

25 cornéen.

.. , . L'utilisation des fractions de HA procure, en outre, un moyen h,X€tflDt€ 4 '

d'améliorer effectivement l'activité biologique in vivo des médica-

Un insert de 100 mg avec du nitrate de pilocarpine contenant: ments ophtalmiques. L'utilisation des fractions particulières hyalec-

— sel de sodium d'acide hyaluronique, tines et hyalastines du HA est, en outre, utile et importante parce fraction hyalastine - 100 mg 30 que ces fractions, quand on les administre dans l'œil, ne manifestent

— nitrate de pilocarpine 2 mg pas de réactions secondaires inflammatoires indésirables.

1 feuille dessin

Claims

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REVENDICATIONS

1. Fraction d'acide hyaluronique sensiblement pure, non inflammatoire, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 30 000 et 730000 et étant pratiquement exempte d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire inférieur à 30 000 ou son sel de sodium ou de potassium.
2. Fraction d'acide hyaluronique sensiblement pure, non inflammatoire, selon la revendication 1, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 250 000 et 350 000 ou son sel de sodium ou de potassium.
3. Fraction d'acide hyaluronique sensiblement pure, non inflammatoire, selon la revendication 1, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 000 et 100 000 ou son sel de sodium ou de potassium.
4. Fraction d'acide hyaluronique sensiblement pure, non inflammatoire, selon la revendication 1, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 500000 et 730000 ou son sel de sodium ou de potassium.
5. Procédé de purification visant à éliminer d'un mélange d'acide hyaluronique des substances inflammatoires, consistant à soumettre un mélange contenant de l'acide hyaluronique à une filtration moléculaire pour obtenir une fraction d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen de 30 000 à 730 000 qui est pratiquement exempte d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire inférieur à 30000 et qui est une fraction d'acide hyaluronique sensiblement pure, non inflammatoire.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel on soumet ledit mélange d'acide hyaluronique à une filtration moléculaire avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire supérieure à 30 000, et l'on retient ainsi sur ladite membrane une première fraction d'acide hyaluronique qui est pratiquement exempte d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire inférieur à 30 000.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite première fraction d'acide hyaluronique a un poids moléculaire moyen de 250000 à 350000.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel cette première fraction d'acide hyaluronique est soumise à une ultrafiltration moléculaire ultérieure avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de 200 000 pour exclure les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 200000; on poursuit l'ultrafiltration jusqu'à ce que le volume du mélange soumis à l'ultrafiltration soit réduit à 10% du volume initial et on recueille le mélange qui passe à travers la membrane pour obtenir ainsi une seconde fraction d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen de 50 000 à 100 000.
9. Procédé selon la revendication 8, consistant à recueillir le mélange retenu sur la membrane après l'étape d'ultrafiltration avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de 200 000, pour obtenir ainsi une troisième fraction d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen de 500 000 à 730 000.
10. Procédé de préparation d'une fraction d'acide hyaluronique selon la revendication 1, consistant:

— à déshydrater les tissus contenant une quantité disponible d'acide hyaluronique,

— à soumettre le tissu déshydraté qui en résulte à une digestion en-zymatique, et

— à soumettre le mélange qui en résulte à une filtration moléculaire avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de 300 000 pour obtenir une fraction d'acide hyaluronique pratiquement exempte d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 30 000.
11. Procédé de préparation selon la revendication 10, consistant:

— à soumettre la fraction d'acide hyaluronique obtenue à une filtration moléculaire avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire d'environ 200000, et

— à recueillir la solution qui passe à travers la membrane pour obtenir une fraction d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen de 50000 à 100000.
12. Procédé de préparation selon la revendication 10, consistant:

— à soumettre la fraction d'acide hyaluronique obtenue à une filtration moléculaire avec une membrane ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire d'environ 200 000, et

— à recueillir le mélange retenu sur la membrane pour obtenir une fraction d'acide hyaluronique ayant un poids moléculaire moyen de 500 000 à 730 000.
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel on soumet, avec la déshydratation, les tissus mis enjeu au départ à une extraction par de l'acétone.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la digestion enzymatique est effectuée au moyen de papaïne.
15. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace d'une fraction d'acide hyaluronique, selon la revendication 2 ou 3, comme agent de cicatrisation des plaies, et au moins un véhicule, excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace d'une fraction d'acide hyaluronique, selon la revendication 4, comme agent de traitement intra-articulaire, et au moins un véhicule, excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
17. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace d'une fraction d'acide hyaluronique, selon la revendication 1, comme agent ophtalmique.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17,

dans laquelle cette fraction d'acide hyaluronique a un poids moléculaire moyen de 50 000 à 100 000, de 250 000 à 350 000 ou de 500 000 à 730 000.