ITPD20120118A1 - "nuovo processo di produzione e purificazione dell'enzima collagenasi da vibrio alginolyticus" - Google Patents

Description

Descrizione di un’invenzione industriale dal titolo †̃†̃Nuovo processo di produzione e purificazione dell’enzima Collagenasi da Vibrio alginolyticusâ€

CAMPO DELL’INVENZIONE.

Le collagenasi sono metallo-enzimi con attività proteolitica che richiedono lo ione zinco nel sito attivo per poter espletare la loro specifica funzione di degradazione del collagene nativo. Esse sono in grado, al contrario delle altre proteasi, di idrolizzare il collagene in condizioni fisiologiche di pH e di temperatura. Sono note allo stato dell’arte diverse collagenasi prodotte da batteri ( Vibrio , Clostridium, Streptomyces, Pseudomonas),· quelle da Clostridium (Santyl®, Noruxol®) sono ampiamente impiegate in composizioni farmaceutiche per il trattamento di ulcere cutanee di varia origine, piaghe da decubito, ustioni di diverso grado e cicatrici ipertrofiche, in quanto sono in grado di degradare il collagene presente nel tessuto necrotico. In tale modo viene facilitata la rimozione del “debris†cellulare, che spesso costituisce un ostacolo alla migrazione delle cellule epiteliali nel corso del processo di rimarginazione e riepitelizzazione delle ferite (Rao, D. B. et al., 1975). Anche la collagenasi da Vibrio à ̈ stata recentemente impiegata per analoghi usi (EP1901755): tale brevetto descrive composizioni esclusivamente lipofile (lipogel) contenenti quale agente stabilizzante carragenina. È noto tuttavia all’esperto del ramo il ruolo infiammatorio che tale sostanza generalmente esplica. In ogni caso, indipendentemente dalla sua origine, la collagenasi ha una stabilità in veicolo acquoso estremamente bassa, perciò viene sempre formulata in veicoli totalmente lipofili; Santyl®, Noruxol® e Bionect Start® sono infatti unguenti a base interamente 1 ipofila nei quali l’enzima non à ̈ mai distribuito in forma omogenea ed à ̈ soggetto ad una consistente perdita di attività nel tempo.

Il veicolo lipofilo assicura la stabilità dell’enzima e la conservabilità del prodotto farmaceutico, pur penalizzando l’attività terapeutica; la collagenasi infatti viene rilasciata dal veicolo lipofilo molto lentamente e quindi la sua biodisponibilità à ̈ fortemente limitata. La collagenasi può trovare impiego anche nel trattamento sistemico, in particolare iniettivo, di malattie quali la “spalla congelata†o capsulite adesiva, la contrattura di Dupuytren, la malattia di Peyronie, ed ancora, cellulite ed adesioni post operatorie. Per queste applicazioni la stabilità in veicolo acquoso à ̈ fondamentale. Attualmente à ̈ in commercio un prodotto per il trattamento iniettivo della contrattura di Dupuytren (à ̈ un liofilo che viene ricostituito al momento del l’uso) che contiene una miscela di due collagenasi con un rapporto di peso ben preciso, estratte e purificate dalla fermentazione del batterio Clostridium histolyticum.

Come detto, quest'ultimo rappresenta una delle fonti più comuni di collagenasi; esso tuttavia à ̈ un microorganismo patogeno, che abbisogna di una fermentazione anaerobia (Mandi, I. et al., 1958, Arch Biochem Biophys, 74:465-475).

L’attività collagenolitica di alcuni ceppi di Achromobacter à ̈ stata identificata per la prima volta nel 1972 (Thomson, J.A., Woods, D.R. e Welton, R.L. 1972) e successivamente sono stati condotti i primi studi sul ceppo Achromobacter iophagus (successivamente riclassificato come Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus, Emod, I. et al 1983) che hanno mostrato la presenza di una collagenasi ad alta attività specifica (Welton e Woods 1973). Nella scelta del microorganismo da impiegare al fine di produrre collagenasi per via fermentativa, l’impiego del Vibrio alginolyticus risulta particolarmente vantaggioso rispetto al Clostridium histolyticum in quanto esso à ̈ non patogeno e consente di operare la fermentazione in ambiente aerobico, con notevoli vantaggi industriali. La patogenicità del ceppo batterico à ̈ un aspetto di non secondaria importanza, in quanto eventuali impurezze (residui batterici o proteici) del prodotto finito possono dare origine ad effetti collaterali importanti. Naturalmente, lavorare su ceppi patogeni implica un particolare impegno nelle fasi di purificazione e quindi una operatività industriale più complessa e dispendiosa.

La collagenasi batterica EC 3.4.24.3 prodotta dal Viàrio alginolyticus à ̈ una Zn<2+>metallo proteasi che si distingue inoltre dalle collagenasi prodotte da Clostridium histolyticum per una serie di ragioni, e precisamente:

• agisce specificamente sul peptide sintetico Pz-Pro-Leu-Gly-Ala-D-Arg (dove PZ= 4-fenil azobenzil ossicarbonile), che à ̈ il substrato sintetico di elezione per la valutazione dell’attività collagenolitica. La collagenasi da V. alginolyticus prodotta nell’ambito della presente invenzione à ̈ infatti l’unica in grado di degradare il collagene a livello del legame Leu-Gly (Keil, B., Gilles A.-M., Lecroisey, A., Hurion, N. and Tong, N.-T. 1975; Keil B. Matrix Suppl.

1992;1:127-33);

• ha un’attività proteolitica nettamente superiore a quella dimostrata dall’analoga ottenuta da Clostridium histolyticum ; • ha una specificità del sito di taglio sul collagene nativo; essa taglia la catena elicoidale del collagene nativo in 2 siti, preferenzialmente a 3/4 dall’estremità N-terminale a livello del legame Y-Gly della sequenza-Pro-Y-Gly-Pro dove Y à ̈ un aminoacido neutro. La collagenasi da Clostridium histolyticum presenta invece diversi siti di taglio a livello della catena del collagene nativo (Lecroisey, A. Keil, B.

1979);

Il ceppo di Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus produce una sola collagenasi, sebbene l’analisi in SDS-PAGE di prodotti di purificazione mostri la presenza di più bande a differente peso molecolare con mantenuta attività collagenolitica. Queste specie a basso peso molecolare sono state attribuite ad un processo di autoproteolisi dell’enzima che viene bloccato da buffer formulati in maniera specifica (Keil-Dlouha, V. 1976).

Nel 1992 Takeuchi e collaboratori sono riusciti a clonare l’intera sequenza codificante la collagenasi di Vibrìo alginolyticus. La sequenza aminoacidica dedotta dalla sequenza nucleotidica mostra che la collagenasi matura à ̈ formata da 739 aminoacidi con un peso molecolare di 81.875 Da. Le sequenze nucleotidica e aminoacidica della collagenasi da Vibrio alginolyticus non mostrano similarità significative con quelle di altre collagenasi (Takeuchi, H., 1992). Ad oggi, i processi per la produzione dell’enzima dal ceppo di nostro interesse sono caratterizzati da rese piuttosto modeste e forniscono prodotti con grado di purezza non soddisfacente soprattutto ai fini dell’impiego inietti vo. Da ricordare a questo proposito il brevetto EP 0115974, il quale descrive un processo di produzione e purificazione di collagenasi da V. alginolyticus·, il prodotto finale à ̈ una miscela di enzimi (collagenasi, proteasi neutre, endonucleasi), stabile solo dopo aggiunta di frammenti di collagene cutaneo bovino (ASF).

Il materiale ottenuto ha un grado di purezza molto basso ed inoltre la presenza di ASF può creare problemi nel momento dell’ allestimento delle forme farmaceutiche individuate o soprattutto, trattandosi di materiale di origine animale, quando le composizioni farmaceutiche prescelte vengano somministrate per via iniettiva.

Come già detto, inoltre, le composizioni farmaceutiche ad oggi note sono in forma di unguento, mentre sia per applicazioni topiche sia, soprattutto, sistemiche à ̈ fondamentale poter disporre dell’enzima collagenasi in forma estremamente pura e stabile in veicolo acquoso (al fine di migliorare la distribuzione dell’enzima stesso all’interno della composizione); si ricorda che il veicolo acquoso à ̈ assolutamente preferito nella terapia iniettiva.

La presente invenzione supera tali problemi, descrivendo un innovativo processo di produzione e purificazione dell’enzima collagenasi da V. alginolyticus, tale processo caratterizzato da alte rese, riproducibilità, stabilità ed elevato grado di purezza del prodotto finito. Il prodotto finito à ̈ inoltre stabile in soluzione acquosa e come tale lungamente conservabile, anche a temperature comprese tra -20 e -80°C senza subire danni significativi.

Grazie all’elevato grado di purezza ed alla specificità di taglio sulla catena del collagene, la collagenasi qui rivendicata trova applicazione anche nella dissociazione dei tessuti e nell’isolamento di cluster o singole cellule per tutte le procedure sperimentali e terapeutiche che richiedono di avere a disposizione cellule isolate.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione rivendica un nuovo processo per la produzione e la purificazione di Collagenasi batterica (Microbial Collagenase EC 3.4.24.3) prodotta dal batterio aerobio, non patogeno Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus (NCIMB Number: 11038 sinonimo LMG 3418, per brevità di seguito chiamato Vibrio alginolyticus ); tale processo permette di avere un'elevata produzione di collagenasi con un processo di fermentazione stabile, riproducibile e a bassi costi. La collagenasi prodotta dal Vibrio alginolyticus secondo il processo qui descritto presenta inoltre un’attività specifica superiore rispetto a quella di altre collagenasi di natura batterica, à ̈ più pura, à ̈ stabile in soluzione acquosa e può subire congelamento senza danni significativi. Ulteriore oggetto della presente invenzione sono composizioni farmaceutiche contenenti la collagenasi ottenuta secondo il processo di produzione e purificazione descritto, ai fini del trattamento terapeutico di patologie caratterizzate da accumulo di collagene o del trattamento di inestetismi/imperfezioni che trovino giovamento dalla riduzione degli accumuli locali di collagene; sono da ricordare, a titolo di esempio, ulcere cutanee di varia origine, piaghe da decubito, ustioni di diverso grado e cicatrici ipertrofiche, cellulite, adesioni post-chirurgiche ed ancora “spalla congelata†o capsulite adesiva, contrattura di Dupuytren, malattia di Peyronie.

La collagenasi ottenuta secondo quanto qui descritto trova inoltre applicazione nella dissociazione dei tessuti e nell’isolamento di cluster o singole cellule. Quest’applicazione à ̈ usata, per esempio, nella procedura di trapianto delle isole di Langerhans per isolare le cellule delle isole dal circostante tessuto pancreatico, e in generale in tutte le procedure sperimentali e terapeutiche che richiedono la dissociazione dei tessuti.

La collagenasi ottenuta mediante il processo di seguito descritto à ̈ caratterizzata da:

• Peso Molecolare 82 kDa

• attività specifica compresa tra 1000 e 1800 nkat/mg

• purezza compresa tra 98,0 e 100%;

• assenza di contaminanti batterici e proteici, più precisamente assenza di endotossine, DNA;

• stabilità a pH compreso tra 5,5 e 11 ;

• stabilità in soluzione acquosa a T comprese tra 4° e 40°C, particolarmente stabile a 37°C;

• stabilità in soluzione acquosa a 4°C per 30 giorni;

• stabilità in soluzione acquosa a T compresa tra -20°C e -80°C per 24-48 mesi;

• liofilizzabilità con ottenimento di una polvere liofila stabile. Essa à ̈ preferibilmente caratterizzata anche da

• sequenza N-terminale : H2N-Thr-Ala-Cys-Asp-Leu-Glu-Ala-Leu-Val-Thr-Glu-Ser-Ser-Asn-Gln

• inibizione da parte di sali di Ag e Cu e dell’agente chelante EDTA

• conservabilità a temperature comprese tra -20 e -80°C, quindi in forma congelata, senza perdita di attività enzimatica significativa (5-15%).

Il processo di produzione e purificazione della collagenasi oggetto dell’invenzione comprende le seguenti fasi:

Fase A: Inoculo del Vibrio Alginolyticus chemovar. Iophagus in beuta e fermentazione con brodo di coltura di origine animale non bovina;

Fase B: Chiarifica del brodo fermentato così ottenuto mediante ultrafiltrazione tangenziale (TFF1) con cassette da 100-500 kD Molecular Weight Cut-Off (MWCO), preferibilmente pari a 300kD;

Fase C: Dialisi e concentrazione del medium chiarificato ottenuto nella fase B, mediante ultrafiltrazione tangenziale (TFF2) con cassette da 5-30kD MWCO, preferibilmente lOkD MWCO;

Fase D: Purificazione della soluzione contenente collagenasi ottenuta nella fase C, mediante resina a scambio anionico portatrice di gruppi basici deboli, a pH compreso tra 6,9 e 7,4, preferibilmente pari a pH 7,1;

Fase E: Dialisi e concentrazione delle frazioni raccolte e aventi attività collageno litica, provenienti dalla fase D, mediante ultrafiltrazione tangenziale (TFF3) con cassette da 10-50kD MWCO, preferibilmente 30kD MWCO;

Fase F: Purificazione della soluzione così ottenuta, mediante resina a scambio anionico portatrice di gruppi basici forti, a pH compreso tra 6,9 e 7,4, preferibilmente pari a pH 7,1;

Fase G: Diafiltrazione e concentrazione delle frazioni ad attività collagenolitica > 95%, provenienti dalla fase F, mediante ultrafiltrazione tangenziale (TFF4) con cassette da 10-50kD MWCO, preferibilmente 30kD MWCO;

Fase H: Filtrazione della soluzione contenente collagenasi così ottenuta, mediante filtro assoluto da 0,2 pm e conservazione a temperatura compresa tra -20° e -80°C.

Al termine di ciascuna fase vengono eseguiti controlli con materiali e metodi descritti nel paragrafo “Metodi di Analisi†, riportato più oltre.

Fase A: à ̈ un processo fermentativo in batch; la preparazione dell’ inoculo avviene in beuta contenente un brodo di coltura formato da un peptone di origine animale non bovino, come per esempio di origine suina o una miscela di peptoni di originale animale non bovina e di originale vegetale, NaCl, CaCh e TRIS (tris-hydroxymethyl-aminomethane), a pH compreso tra 6.9 e 7.4, preferibilmente pari a 7.1. Quando la Densità Ottica misurata a 600 nm (ODóoonm) raggiunge un valore compreso tra 1 e 4 l’inoculo à ̈ pronto per il trasferimento nel fermentatore.

Il medium che si utilizza per la fermentazione à ̈ lo stesso utilizzato per la preparazione dell’ inoculo con l’aggiunta di una piccola quantità di antìfoam per evitare la formazione di schiuma dovuta all’aerazione e all’agitazione.

Una fermentazione ha la durata di 14-20 ore, normalmente 16 ore. Durante la fermentazione vengono prelevati sterilmente dei campioni per controllare la purezza, Γ ODóoonm, l’attività enzimatica e il pH.

Quando l’attività enzimatica à ̈ > 25.000 nkat/litro la fermentazione viene terminata e si aggiunge CaCl2per stabilizzare l’enzima. Si abbassa la temperatura sino a circa 8°C e si lascia sotto agitazione. Sulla soluzione ottenuta nella fase A si effettuano i seguenti test di controllo: OD6oonm;pH; attività enzimatica; concentrazione proteica; SDS-PAGE.

Il brodo di fermentazione proveniente dalla fase A presenta, oltre alla collagenasi di nostro interesse, altre proteasi prodotte dal batterio durante la fermentazione (principalmente serina proteasi), aggregati proteici ad alto peso molecolare e residui del medium. Fase B: il brodo fermentato proveniente dalla fase A viene chiarificato mediante ultrafiltrazione tangenziale (TFF1) con cassette da 100-500 kD MWCO, preferibilmente 300 kD; questo permette di eliminare le cellule batteriche e gli aggregati proteici ad alto peso molecolare.

Sulla soluzione ottenuta nella fase B si effettuano i seguenti test di controllo: pH; attività enzimatica; concentrazione proteica; SDS-PAGE; dosaggio caseinasi.

Fase C: il medium chiarificato proveniente dalla fase B viene concentrato e dializzato mediante ultrafiltrazione con cassette da 5-30kD MWCO, preferibilmente lOkD MWCO, circa 15-25 volte. La soluzione ottenuta nella Fase C tipicamente presenta un’attività enzimatica di 500-700 nkat/ml ed à ̈ stabile per 12 mesi a -20°C. L’obiettivo della filtrazione tangenziale con le cassette da 5-30 kD MWCO à ̈ quello di ridurre notevolmente il volume e sostituire il medium di coltura con il tampone TRIS-HC1 25mM, CaCl2lOmM pH 7,1 che stabilizza la collagenasi e sia adatto al successivo processo di purificazione.

Sulla soluzione ottenuta nella fase C si effettuano i seguenti test di controllo: pH; attività enzimatica; concentrazione proteica; SDS-PAGE.

Fase D: la soluzione contenente la collagenasi derivante dalla Fase C Ã ̈ sottoposta alla prima purificazione cromatografica con resina a scambio anionico portatrice di gruppi dietilaminoalchil, preferibilmente dietilaminoetil, come ed esempio la DE-52 (Dietilaminoetil cellulosa DEAE Whatman). Queste resine sono portatrici di gruppi basici deboli e pertanto hanno un grado di ionizzazione dipendente dal pH, con range di pH ristretti tra 6,9 e 7,4, preferibilmente pari a 7,1.

La soluzione contenente la collagenasi derivante dalla Fase C viene dunque caricata in colonna (Pali Chromatography Column Resolute Mod. 400-V-EP7040) impaccata con la resina DE-52. L’andamento della cromatografia à ̈ seguito da un rilevatore UV-vis a 280nm. Prima del caricamento la colonna viene equilibrata con lo stesso buffer, da qui in poi chiamato equilibration buffer (TRIS-HC1 25mM, CaCl2lOmM pH 7,1), in cui à ̈ stata dializzata la collagenasi durante la Fase C.

Dopo il caricamento, la resina con la collagenasi legata viene eluita con V equilibration buffer di cui sopra, per eliminare le proteine non legate alla resina. Un secondo lavaggio con un buffer a conducibilità maggiore, da qui in poi chiamato washing buffer (TRIS-HC1 300 mM e CaCl210 mM a pH 7,1) viene effettuato per eliminare le impurezze a basso peso molecolare. L’eluizione della collagenasi legata alla resina avviene aumentando ulteriormente la conducibilità con un terzo tampone definito elution buffer (TRIS-HC1 300 mM, NaCl 700 mM e CaCl210 mM a pH 7,1).

Fase E: le frazioni raccolte durante l’eluizione che presentano attività collagenolitica e mostrano in SDS-PAGE una buona purezza vengono unite e trasferite al sistema di ultrafiltrazione con cassette da 10-50 kD MWCO, preferibilmente 30 kD, per essere concentrate e dializzate in un tampone che stabilizza la collagenasi e che à ̈ adatto al successivo processo di purificazione.

Sulla soluzione ottenuta nella Fase E si effettuano i seguenti test di controllo: pH; attività enzimatica; concentrazione proteica; SDS-PAGE; dosaggio caseinasi.

Fase F: la soluzione proveniente dalla Fase E passa alla seconda purificazione mediante cromatografia a scambio anionico utilizzando una resina portatrice di gruppi scambiatori basici forti formati da ammonio quaternario, come ad esempio Sourceâ„¢15Q (GE Healthcare). L’andamento della cromatografia à ̈ seguito da un rilevatore UV-vis a 280nm.

La colonna (Millipore GS 70-550) impaccata con la resina Sourceâ„¢15Q prima del caricamento viene equilibrata con lo stesso buffer in cui à ̈ stata dializzata la collagenasi durante la Fase E, (equilibration buffer).

La soluzione contenente la collagenasi proveniente dalla fase E viene caricata in colonna e la resina con la collagenasi legata viene eluita con Γ equilibration buffer per eliminare le proteine non legate. L’eluizione della collagenasi legata alla resina avviene aumentando la conducibilità con un secondo tampone ( elution buffer 2 - TRIS-HC1 300 mM e CaCl210 mM a pH 7,1).

Fase G: le frazioni raccolte durante l’eluizione che hanno attività collagenolitica e mostrano in SDS-PAGE una purezza >95% vengono unite e trasferite al sistema di ultrafiltrazione con cassette da 10-50 kD MWCO, preferibilmente 30 kD, per essere concentrate e dializzate in un tampone che stabilizza la collagenasi.

Alla soluzione ottenuta nella fase G si effettuano i seguenti test di controllo: pH; attività enzimatica; concentrazione proteica; SDS-PAGE.

Fase H: la soluzione di collagenasi proveniente dalla fase G viene diluita in tampone stabilizzante e filtrata con filtro assoluto da 0,2 pm. La soluzione sterile così ottenuta à ̈ il prodotto finale del processo di purificazione e viene analizzata per le seguenti caratteristiche:

-concentrazione proteica

-attività enzimatica

-pH

-dosaggio caseinasi

-purezza SDS

-analisi dimeri e alto peso molecolare mediante UPLC SEC -endotossine

-test di sterilità

METODI DI ANALISI

Determinazione spettrofotometrica dell’ attività enzimatica della collagenasi (Wiinsch, E., & Heidrich, H. G. modificato)

Il presente metodo permette la determinazione dell’attività della collagenasi presente in soluzioni acquose. L’attività à ̈ espressa in katal che à ̈ definito come la quantità di enzima che catalizza la trasformazione di 1 mole di substrato in 1 sec nelle condizioni previste dal metodo. La quantità di enzima che catalizza la trasformazione del substrato in un tempo prestabilito a 37 °C e pH 7,1, rapportata alla quantità di soluzione analizzata, viene espressa in nkat/ml. Il principio del metodo si basa sulla reazione tra la collagenasi e il substrato sintetico PZ-L-prolil-L-leucil-glicil-L-prolil-D-arginina (dove PZ= 4-fenilazobenzilossicarbonile) specifico per la collagenasi. Dopo reazione con la collagenasi il substrato sintetico viene scisso in 2 frammenti, PZ-L-prolil-L-leucil e glicil-L-prolil-D-arginina. Il secondo frammento à ̈ incolore mentre il primo à ̈ un cromoforo e può essere determinato spettrofotometricamente dopo estrazione con una soluzione organica di acetato di etile acidificata con acido citrico. L’assorbanza del frammento a 320 nm à ̈ proporzionale all’attività enzimatica.

Per effettuare il dosaggio enzimatico à ̈ necessario preparare una serie di diluizione del campione in modo da avere una concentrazione enzimatica che vada a ricadere nel range di linearità del metodo.

Il campione da analizzare viene diluito in tampone Tris 25mM, CaCl2lOmM pH 7,1; 0,5ml di questa soluzione tamponata vengono messi a reagire a 37°C per 15 min con 2 mi di una soluzione l,23mM del substrato sintetico. Alla fine della reazione enzimatica 0,5 mi della miscela di reazione vengono sottoposti a estrazione con fase organica con una miscela di 5:1 acetato di etile e acido citrico allo 0,5% pH 3,5. La fase organica viene prelevata e disidratata tramite l’aggiunta di 300 mg di solfato di sodio anidro. La fase organica disidratata viene analizzata spettrofotometricamente a 320 nm contro acetato d’etile. I risultati dell’attività enzimatica espressi in nkat/ml vengono calcolati utilizzando la seguente formula:

(campione Abs^Q^iancoAbs^^Q )<x>Sid .Conc.pmoles/ml Attività nkal/ml-- y 5 Qxl 000 y fri Std Abs 22Q<~>biancoAbs 22Q

1000= fattore di conversione da Î1⁄4ιηοΠa nmol

900= secondi in 15 minuti

fd= fattore di conversione per Γ iniziale diluizione della soluzione di collagenasi

50= fattore di conversione per la diluizione del campione (0,5 mi e diluisci a 2,5 mi. 0,5 mi e diluisci a 5 mi)

Std Conc. (pmol/ml)= 0,02= 0,4 mi della soluzione a 250Î1⁄4Îœ diluito a 5 mi.

li bianco à ̈ dato dalla stessa reazione enzimatica della collagenasi in cui viene sostituita la soluzione contenente l’enzima con il tampone di riferimento (Tris 25mM, CaCl2lOmM pH 7,1).

Lo Standard à ̈ una soluzione 0,2504 mM del frammento di reazione PZ-L-prolil-L-leucina in acetato d’etile; 0,4 mi di questa soluzione vengono aggiunti ad una soluzione composta da 4,6 mi di acetato d’etile e 1 mi di acido citrico allo 0,5% pH 3,5. La fase organica viene prelevata e disidratata tramite l’aggiunta di 300 mg di solfato di sodio anidro. La fase organica disidratata viene analizzata spettrofotometricamente a 320 nm contro acetato d’etile.

Determinazione della concentrazione proteica mediante il metodo di Lowrv

La concentrazione proteica delle soluzioni contenenti collagenasi sono determinate mediante il metodo di Lowry secondo le seguenti referenze:

1. European Pharmacopoeia 5.0, Total Protein, Chapter 2.5.33 ; 2. Lowry, O. Het al. ,1951, “Protein measurement with thà ̈ Folin phenol reagent†, J. Biol. Chem., 193, 265-275.

UPLC a esclusione molecolare

L’analisi UPLC a esclusione molecolare à ̈ utilizzata per la determinazione di dimeri e di molecole ad alto peso molecolare (definite impurezze) e/o prodotti di degradazione della collagenasi. Lo strumento utilizzato à ̈ un Acquity UPLC H-Class con rivelatore PDA ελ attrezzato con colonna Acquity UPLC BEH 200 SEC. L’analisi viene effettuata in modalità isocratica utilizzando come buffer tampone fosfato pH 6, 4-6, 7 formulato nel seguente modo: Na2P048,9 gr/1, NaH2P046,9 gr/1 e NaCl 8,76 gr/1. Il buffer viene filtrato con filtri assoluti da 0,2pm prima di essere utilizzato. Si iniettano 1,5-4 pg di proteina per ogni test in 5Î1⁄41 di volume.

SDS-PAGE elettroforesi

L’analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide al 10% in presenza di sodio dodecil solfato (SDS) viene effettuata in accordo con il metodo di Laemmli (Laemli, U. K., 1970, “Cleavage of strucural proteins during thà ̈ aasembly of thà ̈ head of bacteriophage T4†, Nature , 227, 680-685.

Determinazione delle caseinasi

La determinazione delle caseinasi à ̈ utilizzato come metodo per il dosaggio delle proteasi aspecifiche presenti come impurezze nella soluzione di collagenasi. Il metodo di analisi à ̈ effettuato in accordo con Anson, M.L. (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89 e Folin, O. and Ciocalteu, V. (1927) J. Biol. Chem. 73, 627-650. La caseinasi viene determinata utilizzando come substrato la caseina. La reazione può essere schematizzata nel seguente modo:

Proteasi

Caseina H20 Aminoacidi

La quantità di tirosina prodotta dalla reazione viene determinata per via colorimetrica sfruttando la reazione con il reattivo di Folin-Ciocalteu che ha la proprietà di ossidare in ambiente alcalino la tirosina sviluppando una colorazione blu. Brevemente, 1 mi di soluzione da analizzare viene aggiunta a 5 mi di soluzione di caseina allo 0,65% (W/V) e si lascia reagire per 30 minuti a 37°C. Al termine dell’ incubazione si aggiungono 0,5 mi di acido tricloro acetico (TCA) e dopo 2 minuti si filtra il campione con filtri da 0,45pm. Il filtrato viene raccolto e si aggiungono 5 mi di Na2C030,5 M e 1 mi di Folin-Ciocalteu 0,5 N e si lascia reagire per 30 minuti a 37°C. Al termine della reazione il campione viene ulteriormente filtrato con filtri 0,45 pm e il filtrato viene analizzato allo spettrofotometro misurando Fassorbanza ad una lunghezza d’onda di 660 nm. Contemporaneamente si prepara il bianco e la retta di taratura con una soluzione di L-tirosina 1,1 mM come standard.

Si calcola il risultati con la seguente formula:

(^<â– >^<â– >sample Q-D'blank )<C>

xl0x6,5x8

Unit m xfd mi 1x 2

c= termine noto

m= coefficiente angolare

10= fattore conversione da 30 minuti a 5 ore

6,5= volume totale in mi di soluzione stop

8= volume totale della soluzione colorimetrica

1= mi di campione di collagenasi

2= mi di campione usato per lo sviluppo del colore

fd= fattore di diluizione

Misura della densità ottica ODsoonm

Questo metodo ci permette di valutare la crescita delle cellule durante le varie fasi del processo di produzione a partire dalla beuta da 5 litri fino al bioreattore da 1000 litri. Per effettuare la misurazione del ODóoonm si preleva 1 mi di sospensione cellulare e si centrifuga a 12000 rcf per 5 min, si elimina il sumatante e si risospendono le cellule in 1 mi di H20 distillata, quindi si effettua la lettura dell’assorbanza a 600 nm.

Dosaggio delle endotossine

Il dosaggio delle endotossine nella soluzione finale di collagenasi viene effettuato secondo quanto descritto in European Pharmacopoeia, Endotoxin Test, Chapter 2.6.14.

Determinazione dell’attività enzimatica della collagenasi tramite UPLC

Il presente metodo permette di quantificare l’attività della collagenasi mediante un’analisi UPLC. Il metodo si basa sulla quantizzazione del frammento prodotto dalla reazione enzimatica (in accordo col metodo di Wiinsch) contro standard esterno.

La quantità d’enzima che catalizza la trasformazione del substrato in un tempo prestabilito a 37°C e pH 7,1 rapportata alla quantità di soluzione analizzata, viene espressa in nkat/ml. Il katal à ̈ definito come la quantità di enzima che catalizza la trasformazione di 1 mol di substrato nel tempo di 1 s, nelle condizioni previste dal metodo. Il range d’impiego del metodo in condizioni di linearità si estende sino a circa 1.2 nkat/ml, come attività massima della collagenasi in soluzione analizzabile secondo la metodologia descritta, senza la necessità di operare “diluizioni†.

La soluzione acquosa di collagenasi à ̈ fatta reagire col substrato sintetico PZ-L-prolil-L-leucil-glicil-L-prolil-D-arginina (dove PZ= 4fenilazobenzilossicarbonile). In condizioni controllate (pH, temperatura, tempo) vengono rilasciati due frammenti: PZ-L-prolil-L-leucina; glicil-L-prolil-D-arginina. Il secondo frammento viene determinato tramite UPLC.

I parametri operativi del sistema UPLC sono:

flusso: 0,919 ml/min

durata della corsa: 3 minuti

lunghezza d’onda: 320 nm

volume d’iniezione: 1,4 Î1⁄4Î

temperatura della colonna: 25 °C

tempo (minuti) Acido citrico 0.5 % w/v pH 3.5 Acetonitrile 0 50 50

1.17 50 50

0.34 10 90

1.13 10 90

Sotto queste condizioni il substrato eluisce approssimativamente a 0,25 minuti e il frammento a circa 0,44 minuti.

La determinazione dell’attività enzimatica consta dei seguenti passaggi:

I. Preparazione di una soluzione tampone TRIS-HC1 25mM, CaCl2lOmM, pH 7.1 (Reattivo A).

II. Preparazione di una soluzione di acido citrico allo 0,5 % (Reattivo B).

III. Preparazione di una soluzione di substrato 1,23 mM (Reattivo C).

IV. Preparazione della soluzione di PZ-L-prolil-L-leucina c.a. 200 Î1⁄4Îœ in acetonitrile (reattivo E).

V. Preparazione della soluzione di collagenasi da analizzare (soluzione D). Diluire la soluzione enzimatica in un matraccio tarato con la soluzione tampone (Reattivo A), in modo da ottenere una soluzione con attività inferiore a 1.2 nkat/ml. VI. Reazione enzimatica. Pipettare in una provetta munita di tappo a vite, mediante pipetta di vetro, 2 mi di reattivo C e 0,5 mi della soluzione D. Lasciar reagire per 15 min a 37 °C in bagno termostatico. Al termine della reazione, chiameremo tale soluzione Y. Parallelamente preparare un “bianco†, W, nel modo seguente: 2 mi di reattivo C e 0,5 mi di soluzione tampone (reattivo A). Si lascia reagire per 15 min a 37 °C in bagno termostatico.

VII. Preparazione dei campioni prelevando 0,5 mi di soluzione Y, introdurli in matraccio da 10 mi contenente 2,0 mi di acido citrico 0,5 % e portare a volume con acetonitrile.

Vili. Preparazione della soluzione di riferimento introducendo in matraccio da 10 mi 0,5 mi di bianco W, 2,0 mi di acido citrico, 1 ,5 mi di reattivo E e portare a volume con acetonitrile.

IX. Iniettare 1,4Î1⁄41 della soluzione di riferimento e successivamente 1,4Î1⁄41 della soluzione da analizzare.

I risultati dell’attività enzimatica espressi in nkat/ml vengono calcolati utilizzando al seguente formula:

Sample Area x Standard Conc. ( pmoles/ml ) /000x 100 Activity nkat/ml = x - x fd Standard Area 900

Calcolo dell’attività enzimatica = nanomoli per secondo per mi di soluzione (nkat/ml) dove:

1000 = fattore di conversione da micromoli a nanomoli

100 = fattore di conversione per la diluizione del campione (0.5 mi a 2.5 mi. 0.5 mi a 10 mi)

900 = secondi in 15 minuti

Standard Conc.(pmoles/ml) = 0.03 (1.5 mi della soluzione a 200 Î1⁄4Îœ a 10 mi)

fd = fattore di diluzione della soluzione di collagenasi utilizzato per preparare la soluzione D

Caratterizzazione della proteina

Determinazione della sequenza N-terminale

La sequenza aminoacidica N-terminale della collagenasi proveniente dal Vibrio alginolyticus chemovar. lophagus à ̈ stata determinata in accordo con il metodo di degradazione di Edman utilizzando un sequenziatore automatico di proteine a fase liquida (ABI-Perkin Elmer mod. 477°). La sequenza ottenuta à ̈ stata verificata mediante analisi bioinformatica eseguendo il BLAST (Basic Logicai Allineament Search Tool) della sequenza contro l’intera banca dati di GenBank.

Analisi del Peptide Mapping

Per l’analisi della mappa peptidica la collagenasi viene prima ridotta con DTT, alchilata con iodoacetamide e successivamente desalificata utilizzando una colonna PD10 eluendo con acido acetico all’ 1%. L’eluito viene sottoposto a digestione triptica e i frammenti analizzati in MALDI-MS. Lo spettro globale à ̈ riportato in (Fig.l); questo ci ha permesso di verificare che oltre il 90% della sequenza aminoacidica risulta identica alla sequenza depositata in banca dati corrispondente alla collagenasi prodotta dal Vibrio alginolyticus chemovar iophagus.

Dicroismo circolare

Gli spettri di dicroismo circolare far UV (FUV-CD) sono stati registrati su uno spettro polarimetro Jasco, modello J-810, connesso ad un bagno termostatato a 25°C. Gli spettri sono registrati utilizzando una cuvetta da 0.1 cm, alla velocità di 20 nm/min, con una risposta ogni 8 sec, per una media di due accumuli. Ogni campione à ̈ stato saggiato in doppio.

Il segnale CD à ̈ stato espresso come ellitticità per residuo medio, calcolata con la formula [Î ̃] = 0obs x MRW/(10 x 1 x c), dove 0obs à ̈ Γ ellitticità osservata in mdeg, “MRW†à ̈ il peso molecolare medio per residuo, “1†à ̈ il cammino ottico in cm e “c†à ̈ la concentrazione in mg/ml. I campioni sono stati analizzati alla concentrazione di 0,2 mg/ml.

Esempio 1 Produzione e purificazione di collagenasi da Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus, in una fermentazione da 800 L. ( Fig.2 )

Fermentazione

La fermentazione à ̈ suddivisa in 2 fasi:

Fase 1 : Preparazione inoculo

Fase 2: Fermentazione

Fase 1: Il terreno di coltura à ̈ liquido ed à ̈ composto da una soluzione di TRIS 1,21 g/1, NaCl 23,4 g/1, CaCl20,29 g/1 e 15 g/1 di peptone di origine animale non bovina (suina, o una miscela con peptoni di origine suina e vegetatale) sciolti in acqua distillata (milliQ millipore). Il pH del terreno viene portato a 7,1 con HC1 e sterilizzato in autoclave a temperatura > 122°C per 30 min. Si inocula una fiala di 1,5 mi di Vibrio alginolyticus chemovar. Iophagus (WCB-Working Celi Bank) in una beuta da 5 L contenente 2 L di terreno di coltura e si incuba a 30°C con agitazione di circa 150 rpm, per un tempo che oscilla tra le 8 e le 16 ore. Quando Γ OD60onmraggiunge un valore compreso tra 1 e 4 l’inoculo à ̈ pronto per il trasferimento nel fermentatore.

Fase 2: il terreno di coltura à ̈ lo stesso di quello utilizzato per la Fase 1 con l’aggiunta di 0,25 g/1 antifoam Sigma 204, sterilizzato a > 122°C per 30 min all’interno del fermentatore stesso. I 2 L di inoculo vengono trasferiti sterilmente nel fermentatore contenente 800 L di brodo di fermentazione e i parametri di fermentazione vengono impostati come segue:

-temperatura 30°C ±1°C,

-agitazione 50-150 rpm,

-aria 10-80 Nm<3>/h

-ossigeno disciolto > 50%

-pH 7,1 ± 0,1

-pressione 0-0,4 Bar

Una tipica fermentazione ha la durata di 14-20 ore, normalmente 16 ore, che corrispondono al più alto livello di attività enzimatica della collagenasi durante l’intero processo di fermentazione. Durante la fermentazione vengono prelevati sterilmente dei campioni per controllare la purezza della coltura, rODóoonm, l’attività enzimatica. L’attività della collagenasi à ̈ determinata spettrofotometricamente in accordo con il metodo di Wunsch-Heidrich modificato (Wiinsch, E. & Heidrich, H. G. 1963).

Quando l’attività enzimatica à ̈ > 25.000 nkat/litro la fermentazione viene terminata e si aggiunge CaCl2 fino alla concentrazione finale di 1,47 g/1 per stabilizzare l’enzima. Si abbassa la temperatura sino a circa 8°C e si lascia sotto agitazione per circa 10-30 minuti. Tipicamente un brodo fermentato ha le seguenti caratteristiche:

1) Attività enzimatica tra 25.000 - 50.000 nkat/litro

2) ODgoonm compreso fra 5-8

3) Assenza di contaminanti batterici

Chiarifica TFF1 ultrafiltrazione con cassette da 300kD MWCO (Molecular Weight Cut-Off)

Il brodo di fermentazione, circa 800 litri, viene trasferito al sistema di ultrafiltrazione contenente Holder Sartocon II (Sartorius) dove sono alloggiate 5 cassette da 300kD MWCO (Cod 3021467907E-SG) ognuno con 0,5 m<2>di superficie filtrante. La membrana filtrante à ̈ in PoliEtherSulphone (PES) modificato che ha come caratteristica principale la bassa affinità per le proteine, consentendo un recupero >80%, e permettendo la chiarificazione del medium con bassa perdita di collagenasi.

L’obiettivo dell’ultrafiltrazione con cassette da 300 kD à ̈ quello di rimuovere la massa batterica dal brodo di fermentazione e di eliminare un aggregato proteico di circa 320 Kda.

Dialisi e concentrazione TFF2 ultrafiltrazione con cassette da lOkD MWCO

Dopo la chiarifica il medium viene concentrato e dializzato nel sistema di ultrafiltrazione PALL Mod UF-A-P0971 dove sono alloggiate 6 cassette da lOkD MWCO ( Cod 342930 12R) ognuna con 0,5 m<2>di superficie filtrante. La membrana filtrante à ̈ in PoliEtherSulphone (PES) modificato che ha come caratteristica principale la bassa affinità per le proteine, consentendo un recupero >80%. L’ultrafiltrazione con cassette da lOkD ci permette di ridurre il volume fino a 15-25 volte, eliminare i contaminanti a basso peso molecolare e sostituire il medium di coltura con il tampone Tris 25 mM, CaCb 10 mM pH 7,1, adatto al successivo processo di purificazione. Dopo le ultrafiltrazioni vengono eseguite le seguenti analisi:

1) Attività enzimatica

2) Dosaggio proteico

3) SDS-PAGE (Fig. 3)

Cromatografia anionica debole (DE-52 Whatman)

La soluzione contenente la collagenasi derivante dai processi di ultrafiltrazione à ̈ il materiale di partenza per la prima purificazione mediante cromatografia a scambio anionico debole utilizzando la resina DE-52 (Dietilaminoetil cellulosa DEAE Whatman).

L’andamento della cromatografia à ̈ seguito da un rilevatore UV-vis a 280nm. Tipicamente 10-25 litri della soluzione contenente la collagenasi con una concentrazione proteica di 0,8- 1,2 g/1 vengono caricati in colonna (Pali Chromatography Column Resolute Mod.

400-V-EP7040) impaccata con 10 Kg di resina DE-52. La quantità di proteine totali caricate in colonna à ̈ pari a 0,8-3 g/Kg di resina. La resina viene equilibrata con 10 volumi colonna (BV) di TRIS-HC1 25 mM e CaCl210 mM a pH 7,1, successivamente chiamato equilibration buffer.

Dopo il caricamento la resina con la collagenasi legata viene eluita con 2-4 BV, generalmente 2, di equilibration buffer per eliminare le proteine non legate alla resina e riportare i valori di conducibilità a quelli precedenti il caricamento del campione.

Per eliminare le impurezze a basso peso molecolare viene effettuata un’ulteriore eluizione con 3-5 BV, generalmente 4, di un buffer così formulato: TRIS-HC1 300 mM e CaCl210 mM a pH 7,1 ( washing buffer). L’eluizione della collagenasi legata alla resina avviene aumentando la conducibilità con 3-5 BV, generalmente 4, di un terzo tampone così composto: Tris-HCl 300 mM, NaCl 700 mM e CaCl210 mM a pH 7,1 ( elution buffer).

La frazione raccolta durante l’eluizione con V elution buffer viene sottoposta a dosaggio dell’attività enzimatica e analizzata mediante SDS-PAGE.

Un tipico profilo cromatografico presenta tre picchi ben distinti come mostrato in Fig.4:

- il primo corrisponde al non legato, che non presenta attività enzimatica.

- il secondo picco corrisponde all’eluizione con il washing buffer, che presenta attività collagenolitica ma viene scartato in quanto sono presenti anche molte impurezze.

- il terzo picco corrisponde all’eluizione con V elution buffer ed à ̈ il picco con maggior attività enzimatica e maggior purezza.

Tipicamente il picco contenente la collagenasi ha un volume di 18-22 litri e viene analizzato per le seguenti caratteristiche:

1) Attività enzimatica

2) Dosaggio proteico

3) SDS-PAGE (Fig. 5)

Dialisi e concentrazione TFF3 ultrafiltrazione con cassette da 30kD MWCO

La frazione corrispondente al terzo picco cromatografico viene concentrata e dializzata nel sistema di ultrafiltrazione Cogentâ„¢ (Millipore) dove sono alloggiate 2 cassette da 30K MWCO (Cod 31158044R) ognuno con 0,1 m di superficie filtrante. La membrana filtrante à ̈ in PoliEtherSulphone (PES) che ha come caratteristica principale la bassa affinità per le proteine, il che permette di avere un recupero >95%. L’ultrafiltrazione con cassette da 30kD consente di ridurre il volume fino a 3-6 volte, e sostituire il tampone di eluizione dalla DE-52 con il tampone Tris 25 mM, CaCl210 mM pH 7,1, adatto al successivo processo di purificazione. Nell’ ultrafiltrato si eseguono i seguenti controlli: 1) Attività enzimatica

2) Dosaggio proteico

Cromatografia anionica forte (Source â„¢15Q GE Healthcare!.

La soluzione di collagenasi proveniente dalla TFF3 à ̈ il materiale di partenza per la seconda purificazione mediante cromatografia a scambio anionico forte utilizzando la resina Sourceâ„¢15Q (GE Healthcare). L’andamento della cromatografia à ̈ seguito da un rilevatore UV-vis a 280nm. Tipicamente 3-6 litri di soluzione contenente la collagenasi con concentrazione proteica 0,8- 1,2 mg/ml vengono caricati in colonna (Millipore GBP 70-550), impaccata con 100-200 mi di resina Sourceâ„¢15Q; la quantità di proteine totali caricate in colonna à ̈ pari a 24-36mg/ml di resina. Prima del caricamento la colonna viene equilibrata con 10 volumi colonna (BV) di TRIS-HC1 25 mM e CaCl210 mM a pH 7,1, chiamato equilibration buffer.

Dopo il caricamento la resina con la collagenasi legata viene eluita con 5-7 CV di equilibration buffer per eliminare le proteine non legate e riportare la conducibilità ai valori iniziali. L’eluizione della collagenasi legata alla resina avviene con 5-10 BV di Tris-HCl 300 mM, e CaCl210 mM a pH 7,1 ( elution buffer). La frazione contenente la collagenasi viene eluita in un unico picco tipicamente di 1-2 litri, evidente nel cromatogramma di Fig. 6.

La frazione contenente la collagenasi raccolta durante l’eluizione viene sottoposta ai seguenti controlli:

1 ) Attività enzimatica

2) Dosaggio proteico

3) SDS-PAGE (Fig. 7)

Dialisi e concentrazione TFF4 ultrafiltrazione con cassette da 30kD MWCO

La frazione contenente la collagenasi à ̈ trasferita al sistema di ultrafiltrazione Cogentâ„¢ (Millipore) dove sono alloggiate 2 cassette da 30kD MWCO ognuna con 0,1 m<2>di superficie filtrante, con membrana in PoliEtherSulphone (PES). Questo step di ultrafiltrazione ci permette di dializzare e concentrare il campione contro tampone TRIS-HC1 25 mM e CaCl210 mM a pH 7,1.

Filtrazione e conservazione

La soluzione proveniente dalla TFF4 viene filtrata con filtri assoluti da 0,2pm in PoliEtherSulphone (PES) per la sterilizzazione finale del prodotto. Il prodotto finale viene stoccato in appositi contenitori e conservato a -20°C.

La soluzione di collagenasi cosi ottenuta viene analizzata per le seguenti caratteristiche: concentrazione proteica; attività enzimatica; pH; dosaggio proteasi aspecifiche; purezza SDS-PAGE (Fig. 8); purezza (analisi dimeri e alto peso molecolare) UPLC SEC; LAL Test per la determinazione delle endotossine (secondo Farmacopea Europea il prodotto deve contenere al massimo 5 IU/kg/ora). Le caratteristiche specifiche sono riassunte nella seguente Tabella 1.

Tabella 1

TEST SPECIFICHE

ntificazione:

LC esclusione molecolare -positivo

etto Soluzione limpida, incolore, in TRIS-HC1 25 mM, CaCl210 mM, pH 7,1 della soluzione 7,1 ± 0,2

ncentrazione proteica < 1,0 mg/ml di soluzione

ività Specifica 1000 - 1800 nkat/mg

ività Caseinasica < 1 ,0 U/ml

ezza in UPLC 98.0 - 100%

ntificazione Peso Molecolare 82KDa

ezza in SDS-PAGE 98.0 - 100%

otossine Assenti o conformi a Farmacopea

Europea

La collagenasi prodotta e purificata secondo la presente invenzione à ̈ stata testata dalla Richiedente per verificare le seguenti caratteristiche, ed à ̈ risultata:

• pura: ha purezza compresa tra 98 e 100%;

• priva di contaminanti batterici e proteici (endotossine, DNA);

• stabile a pH compreso tra 5,5 e 11 (verificata mediante test enzimatico)

• stabile in soluzione acquosa, ad esempio comprendente TRIS-HC1 25mM, CaCl210 mM, pH 7,1, a T comprese tra 4° e 40°C, particolarmente stabile a 37 °C

• stabile in soluzione acquosa a 4°C per 30 giorni

• stabile in soluzione acquosa a T compresa tra -20°C e -80°C per 24-48 mesi

• liofilizzabile con opportuni eccipienti (più oltre descritti) ottenendo una polvere liofila stabile.

Il liofilizzato di collagenasi, che à ̈ ulteriore oggetto della presente invenzione, viene infatti preparato con eccipienti particolarmente adatti a mantenerne la stabilità e può preferenzialmente contenere:

- Maltosio: 95-96 % preferibilmente 95,75%;

- Sali (ad esempio, TRIS-HCl+CaC^): 1,0- 1,5%, preferibilmente 1,3%;

- Collagenasi: 2, 5-3, 5 % preferibilmente 2,95%, ottenendo una polvere liofilizzata avente attività enzimatica compresa tra 7-20 nkat/mg di polvere.

Le quantità sopra indicate per il liofilizzato di collagenasi sono percentuali in peso rispetto al peso totale del liofilizzato.

La collagenasi ottenuta secondo il processo di produzione e purificazione risulta dunque adatta all’ allestimento di composizioni farmaceutiche di vario tipo, destinate come detto alla terapia di malattie caratterizzate da accumulo di collagene o del trattamento dermocosmetico di inestetismi/imperfezioni che trovino giovamento dalla riduzione degli accumuli locali di collagene. Le applicazioni più frequenti sono legate al trattamento topico e/o locale di ustioni di vario grado, scottature, piaghe da decubito, ulcere vascolari e diabetiche; in questi casi la collagenasi opera una efficace eliminazione dell’escara, permettendo così alle cellule vitali sottostanti di attivarsi ai fini del processo riparativo. Ulteriore applicazione terapeutica à ̈ quella su cellulite, adesioni post operatorie, cicatrici ipertrofiche e cheloidi; si tratta di situazioni in cui una abnorme produzione di collagene ha inficiato il regolare processo riparativo, e che possono trovare beneficio dalla lisi del collagene irregolarmente accumulato.

Altre patologie trattabili con collagenasi sono la “spalla congelata†o capsulite adesiva, la contrattura di Dupuytren, la malattia di Peyronie.

A seconda della patologia può essere richiesta un’applicazione topica o sistemica, in modo particolare iniettiva.

Per quanto riguarda le applicazioni topiche, la sorprendente stabilità in soluzione acquosa dell’enzima qui rivendicato permette la formulazione in veicoli idrofili; in modo particolare, si à ̈ trovato che la collagenasi può essere formulata con particolari polimeri che si idratano a contatto con l’essudato della lesione su cui vengono posti dando origine ad un gel. In questa situazione l’enzima viene rilasciato in modo graduale e quantitativamente superiore di quanto non si ottenga con i normali veicoli lipofili sino ad oggi impiegati, producendo un più consistente effetto terapeutico; si potrà inoltre ridurre il numero di applicazioni giornaliere migliorando anche la compliance del paziente. La forma farmaceutica topica preferita nell’ambito della presente invenzione à ̈ quella della polvere aspersoria, la cui preparazione a livello industriale non richiede particolari processi e che, in forma di preparazione farmaceutica, può essere facilmente dosata, correttamente depositata entro i bordi della lesione e lungamente conservata. Il polimero idrofilo da impiegare deve essere in grado di assorbire velocemente il liquido prodotto dalla ferita, producendo un materiale gelificato ed aderente. Tale gel deve avere naturalmente delle caratteristiche di viscosità che consentano la sua permanenza sul letto della ferita; un gel troppo solido tende a vetrificare, uno troppo liquido scivola dal letto della ferita portando con sé anche il principio attivo. Dovendo inoltre essere la preparazione sterile, à ̈ fondamentale che il polimero scelto conservi le sue proprietà reologiche dopo idratazione anche quando precedentemente sterilizzato con i comuni mezzi (solitamente, raggi γ). Per individuare quello più opportuno Γ Applicante ha eseguito una serie di test su numerosi polimeri (amido e derivati, alginati, derivati della cellulosa, polivinilacoli e derivati, gomme, pectine), secondo quanto qui brevemente descritto. In una capsula Petri di vetro con diametro di 5 cm si à ̈ creato un film continuo di soluzione fisiologica dello spessore di 2.5 mm sul quale si à ̈ spolverata la polvere del polimero da esaminare (1 g circa), facendola cadere da un setaccio di acciaio con pori di dimensione fissa. Ulteriore liquido veniva aggiunto sino a quando il polimero, trasformato in gel, era in grado di assorbirlo mantenendo una viscosità tale da non colare dalla piastra tenuta in posizione verticale. Valutando la velocità di assorbimento del liquido, la trasparenza e la consistenza del gel ottenuto si à ̈ ritenuto che, ai fini della presente invenzione, il polimero più adatto à ̈ l’amido di mais glicolato.

L’amido di mais glicolato à ̈ una polvere bianca, sottile, scorrevole e molto igroscopica che trova impiego nella fabbricazione di compresse e capsule per le sue proprietà disgreganti, ma mai era stata usata per applicazione diretta. L’amido di mais glicolato ha un pH tra 5.5 e 7.5, quindi vicino a quello del tessuto su cui andrà applicato, ed in acqua rigonfia fino a 300 volte il proprio volume. Oltre all’enzima collagenasi, la polvere aspersoria può contenere un ulteriore principio attivo, che stimoli la migrazione cellulare al fine di consentire una più rapida riepitelizzazione del letto della lesione, e dunque una chiusura più rapida della ferita. Tra i vari agenti possibili, particolarmente adatto a tali scopi à ̈ l’acido ialuronico; si tratta di un eteropolisaccaride composto da residui alternati di acido D-glucuronico e N-acetil-D-glucosammina. E’ un polimero a catena lineare con peso molecolare che può variare tra 50.000 e 13 x IO<6>Da, a seconda della fonte dalla quale viene ottenuto e dai metodi di preparazione impiegati. L’HA utilizzato nella presente invenzione può derivare da qualsiasi fonte, ad esempio, da estrazione da creste di gallo (EP 138572 Bl), da fermentazione (da Streptocuccus), o da biosintesi (da Bacillus ), ed avere un peso molecolare medio compreso tra i 400 e 3xl0<6>Da, in particolare tra lx 10<5>Da e lx 10<6>Da, ancor più in particolare tra 200.000 e 750.000 Da. Preferibilmente, HA qui impiegato nelle applicazioni topiche ha un peso molecolare (PM) medio compreso tra 130 e 230 kDa, preferibilmente tra 145 e 210 kDa ed ancor più preferibilmente tra 160 e 200 kDa; quest’ultimo per brevità verrà di seguito definito come HA con PM medio 200 kDa. Per le applicazioni iniettive viene invece impiegato HA con peso molecolare medio compreso tra 200 e 1800 kDa, preferibilmente compreso tra 500 e 1300 kDa, ancor più preferibilmente compreso tra 750 e 1200kDa. Va sottolineato che per peso molecolare medio si intende il PM medio ponderale calcolato col metodo della “intrinsic viscosity†(Terbojevich et al., CarbohydrRres, 1986, 363-377).

HA à ̈ presente in natura nei gel pericellulari, nella sostanza fondamentale del tessuto connettivo degli organismi vertebrati (dei quali rappresenta uno dei componenti principali), nel fluido sinoviale delle articolazioni, nell’ umor vitreo e nel cordone ombelicale.

E’ stato dimostrato che HA svolge un ruolo fondamentale nel processo di riparazione tissutale sia dal punto di vista strutturale (nell’organizzazione della matrice extracellulare e nella regolazione della sua idratazione) sia come sostanza stimolatrice di una vasta serie di processi in cui interviene direttamente ed indirettamente (formazione di coagulo, attività fagocitarla, proliferazione dei fibroblasti, neovascolarizzazione, riepitelizzazione, etc.) (Weigel P. et al., J Theoretical Biol, 1986:219-234; Abatangelo G. et al., J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K. et al., Drugs, 1994, 47:536-566). Il ruolo di HA all’ interno delle preparazioni qui descritte non à ̈ solo quello di favorire la cicatrizzazione, ma soprattutto quello di evitare che la collagenasi che si dispone ai margini della ferita possa danneggiare le cellule vive e sane che lì risiedono impedendone la migrazione verso le zone in cui à ̈ necessaria la rigenerazione. Inoltre, la presenza di HA che à ̈ a sua volta un polimero assorbente, aiuta la formazione del gel sul letto della ferita, e migliora il rilascio, perciò l’attività enzimatica, della collagenasi, come à ̈ stato dimostrato e di seguito sarà illustrato. All’interno delle formulazioni individuate può inoltre essere presente un agente che favorisca lo scorrimento delle polveri in fase di miscelazione; tra quelli più comunemente usati vi à ̈ il diossido di silicio colloidale, che può opzionalmente essere inserito in quantità variabili tra 0.1 e 3%, preferibilmente comprese tra 0.2 e 1%, secondo quanto noto all’esperto del ramo.

Nell’ambito della presente invenzione la Richiedente intende quindi rivendicare composizioni farmaceutiche ad uso topico in forma di polvere aspersoria comprendenti:

• collagenasi ottenuta secondo il processo sopra descritto, in quantità equivalente ad un’attività compresa tra 2 e 8 nkat/g di prodotto finito, preferibilmente pari a 5nkat/g di prodotto finito;

• opzionalmente, HA con PM medio ponderale compreso tra 130 e 230 kDa, preferibilmente tra 145 e 210 kDa ed ancor più preferibilmente tra 160 e 200 kDa, in quantità compresa tra 0,1 e 5 %, in particolare tra 0,2 e 2%

• opzionalmente, diossido di silicio colloidale in quantità compresa tra 0,1 e 3%, preferibilmente comprese tra 0,2 e 1%;

• amido di mais glicolato. in quantità necessaria al completamento della composizione percentuale.

Le quantità sopra indicate per la polvere aspersoria sono percentuali in peso rispetto al peso totale della composizione.

Di seguito vengono ora descritti, a puro titolo esemplificativo, alcuni esempi di preparazione delle composizioni farmaceutiche sopra definite.

Esempio 2: preparazione di un polvere aspersoria contenente collagenasi, acido ialuronico HA e amido di mais glicolato (Formulazione 1).

La collagenasi, in foma di liofilo, viene dosata in modo da corrispondere ad un’attività di 5nkat/g di prodotto finito.

Collagenasi equivalente a 5nkat/g

HA PM medio 200 kDa 0.2g

Amido di mais glicolato q.b. a lOOg

Si pesa la metà circa della quantità di polimero gelificante e la si introduce nel contenitore; si pesano la collagenasi e HA, precedentemente micronizzato e setacciato a 50Î1⁄4, e si introducono nel contenitore. Infine si pesa la restante quantità di polimero gelificante e la si introduce nel contenitore. La preparazione viene effettuate per miscelazione diretta delle polveri in un flacone a parallelepipedo di polietilene chiuso con un sottotappo in polietilene a tappo a vite in polipropilene, di capacità tale da lasciare almeno 40-50% di spazio vuoto in testa. Il flacone, fissato nel braccio di un mescolatore a V in posizione obliqua (45 gradi), ruota obliquamente intorno al suo asso minore alla velocità di 50rpm. La miscelazione procede sino ad omogeneità.

Esempio 3: preparazione di una polvere aspersoria contenente collagenasi, acido ialuronico (HA), amido di mais glicolato ed agente di scorrimento (Formulazione 2)

La collagenasi, in forma di liofilo, viene dosata in modo da corrispondere ad un’attività di 5nkat/g di prodotto finito.

Collagenasi equivalente a 5nkat/g

HA PM medio 200 kDa 0.2g

Diossido di silicio colloidale 0.2g

Amido di mais glicolato q.b. a lOOg

Si pesa la metà circa della quantità di polimero gelificante e la si introduce nel contenitore; si pesano la collagenasi e HA, precedentemente micronizzato e setacciato a 50Î1⁄4, e si introducono nel contenitore. Si pesano infine la restante quantità di polimero gelificante e l’agente di scorrimento e li si introducono nel contenitore. La preparazione viene effettuate per miscelazione diretta delle polveri in un flacone a parallelepipedo di polietilene chiuso con un sottotappo in polietilene a tappo a vite in polipropilene, di capacità tale da lasciare almeno 40-50% di spazio vuoto in testa. Il flacone, fissato nel braccio di un mescolatore a V in posizione obliqua (45 gradi), ruota obliquamente intorno al suo asse minore con velocità di rotazione di 50rpm. La miscelazione procede sino ad omogeneità.

Esempio 4: preparazione di una polvere aspersoria contenente collagenasi, acido ialuronico (HA), amido di mais glicolato ed agente di scorrimento (Formulazione 3)

La collagenasi, in forma di liofilo, viene dosata in modo da corrispondere ad un’attività di 5nkat/g di prodotto finito.

Collagenasi equivalente a 5nkat/g

HA PM medio 200 kDa 0.2g

Diossido di silicio colloidale lg

Amido di mais glicolato q.b. a lOOg

Per la preparazione, vedi Esempio 2.

Esempio 5: preparazione di una polvere aspersoria contenente collagenasi e amido di mais glicolato (Formulazione 4).

La collagenasi, in forma di liofilo, viene dosata in modo da corrispondere ad un’attività di 5nkat/g di prodotto finito.

Collagenasi equivalente a 5nkat/g

Amido di mais glicolato q.b. a lOOg

Si pesa la metà circa della quantità di polimero gelificante e la si introduce nel contenitore; si pesa la collagenasi e si introduce nel contenitore. Infine si pesa la restante quantità di polimero gelificante e la si introduce nel contenitore. La preparazione viene effettuate per miscelazione diretta delle polveri in un flacone a parallelepipedo di polietilene chiuso con un sottotappo in polietilene a tappo a vite in polipropilene, di capacità tale da lasciare almeno 40-50% di spazio vuoto in testa. Il flacone, fissato nel braccio di un mescolatore a V in posizione obliqua (45 gradi), ruota obliquamente intorno al suo asse minore con velocità di rotazione di 50rpm. La miscelazione procede sino ad omogeneità.

Esempio 6: preparazione di una polvere aspersoria contenente collagenasi, amido di mais glicolato ed agente di scorrimento (Formulazione 5)

La collagenasi, in forma di liofilo, viene dosata in modo da corrispondere ad un’attività di 5nkat/g di prodotto finito.

Collagenasi equivalente a 5nkat/g

Diossido di silicio colloidale 0.2g

Amido di mais glicolato q.b. a lOOg

Si pesa la metà circa della quantità di polimero gelificante e la si introduce nel contenitore; si pesa la collagenasi e si introduce nel contenitore. Infine si pesano la restante quantità di polimero gelificante e di agente di scorrimento e le si introducono nel contenitore. La preparazione viene effettuate per miscelazione diretta delle polveri in un flacone a parallelepipedo di polietilene chiuso con un sottotappo in polietilene a tappo a vite in polipropilene, di capacità tale da lasciare almeno 40-50% di spazio vuoto in testa. Il flacone, fissato nel braccio di un mescolatore a V in posizione obliqua (45 gradi), ruota obliquamente intorno al suo asse minore con velocità di rotazione di 50rpm. La miscelazione procede sino ad omogeneità.

Esempio 7: preparazione di una polvere aspersoria contenente collagenasi, amido di mais glicolato ed agente di scorrimento (Formulazione 6)

La collagenasi, in forma di liofilo, viene dosata in modo da corrispondere ad un’attività di 5nkat/g di prodotto finito.

Collagenasi equivalente a 5nkat/g

Diossido di silicio colloidale lg

Amido di mais glicolato q.b. a lOOg

Per la preparazione, vedi Esempio 5.

Come detto, di tali polveri aspersorie sono state valutate la reologia pre- e post-sterilizzazione dopo idratazione e la performance in termini di rilascio della collagenasi. Quest’ ultima prova à ̈ stata condotta verso un prodotto standard (Bionect Start®) che contiene collagenasi in un veicolo lipofilo.

Valutazione reologica pre- e post-sterilizzazione

I campioni presi in esame sono stati preparati rispettivamente secondo gli Esempi 1 e 3 che rappresentano le formulazioni più complesse tra quelle individuate.

I g della Formulazione 1 e della Formulazione 3 non sterili sono stati idratati con 7 mi di soluzione fisiologica ciascuno; la stessa procedura à ̈ stata eseguita su 1 g delle medesime formulazioni precedentemente sterilizzate a raggi γ (dose 25 kGray). I gel così ottenuti sono stati sottoposti all’analisi per la valutazione dei moduli viscosi G’ e G†mediante viscosimetro HAAKE mod. Mars II dotato di misura a piastra-cono con diametro 60mm ed angolo di 1°; la misura viene effettuata a 20±0.5 °C in controllo di rotazione con rampa di velocità con accelerazione costante da 0 a 5 sec Ί in 8 minuti; Γ interpolazione viene eseguita a 1.0 sec Ί. I risultati sono illustrati nel Grafico 1 : appare evidente che ciascuna formulazione mantiene praticamente inalterate le sue proprietà reologiche anche dopo sterilizzazione. La Formulazione 1, senza agente di scorrimento, ha moduli G’ e G†leggermente superiori, ma in modo non statisticamente significativo. Ciò significa che l’agente di scorrimento non ha alcun effetto sulla reologia e che dunque può essere usato o meno in relazione alle condizioni operative. E invece fondamentale sottolineare che il polimero prescelto conserva quelle caratteristiche di adesività e viscosità individuate nei test preliminari e necessarie all’ottimale rilascio dell’enzima contenuto nella formulazione.

Valutazione dell’ attività collagenolitica

In queste prove si à ̈ testato il comportamento delle formulazioni sia con che senza acido ialuronico verso un reference commerciale (Bionect Start®) contenente collagenasi in veicolo lipofilo (unguento) ed acido ialuronico.

Dato che l’agente di scorrimento non ha alcun effetto sull’attività enzimatica della collagenasi, si à ̈ scelto di testare le Formulazioni 1 (con HA) e 4 (senza HA). L’attività degradativa dell’enzima viene determinata mediante saggio quantitativo su un substrato commerciale standard (Collagenase Chromophore substrate kit -Fluka 27669). La metodica à ̈ stata opportunamente modificata per adeguare il saggio sia alla formulazione in polvere dei campioni in esame, sia per mimare le condizioni alle quali tali preparazioni saranno sottoposte dopo applicazione in vivo. Il saggio si basa sull’idrolisi del substrato specifico della collagenasi: 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH (componente A). Questo substrato in presenza dell’enzima collagenasi viene degradato a Pz-Pro-Leu-OH (frammento di colore giallo-arancio) e H-Gly-Pro-D-Arg-OH. Il peptide Pz-Pro-Leu-OH à ̈ solubile in solventi organici e viene estratto con etile acetato dalla miscela acidificata con acido citrico. L’eccesso di substrato non degradato rimane nella fase acquosa acidificata. Pz-Pro-Leu-OH in etile acetato viene determinato quantitativamente per via spettrofotometrica mediante lettura a 320 nm.

Materiali e metodi

Collagenase Chromophore substrate kit - Fluka 27669

Formulazione 1

Formulazione 4

Bionect Start®

Soluzione fisiologica

Buffer TRIS

Acido Citrico 25mM

Etile Acetato

Na2S04 anidro

Per ogni formulazione vengono eseguite 3 prove.

Stepl. In un tubo Corning Costar SpinX (Sigma, Fig. 9 A) da 1,5 mi vengono posti 1,1 mi di soluzione di substrato alla concentrazione di 2,6 mM, come riportato nella metodica del saggio commerciale Fluka. Nel contenitore portante la membrana con porosità 0,22 pm (Fig. 9B) vengono inseriti 100 mg di ciascuna formulazione di collagenasi in polvere (Formulazioni 1 e 4), la quale viene idratata con 4 volte il suo peso con una soluzione fisiologica. Il contenitore viene ermeticamente chiuso con un opportuno tappo per evitare il rigonfiamento della polvere per ulteriore assorbimento di liquido durante l’esperimento. Il contenitore viene alloggiato all’intemo del tubo con la soluzione del substrato (Fig. 9C). Il tubo viene sigillato ermeticamente e capovolto permettendo il contatto della soluzione di substrato con la membrana del contenitore. La collagenasi e il substrato possono attraversare liberamente la membrana mentre le polveri vengono trattenute nel contenitore. L’intera preparazione viene incubata a 32°C. I contenitori vengono sostituiti secondo quanto previsto dal protocollo, al fine di mimare l’applicazione giornaliera, ogni due giorni ed unica.

Per Bionect Start®, che à ̈ un unguento, lo Step 1 viene modificato come di seguito descritto:

in tubi tipo Eppendorf (Fig. 10) da 1,5 mi vengono posti 0,6 mi di soluzione di substrato alla concentrazione di 1,3 mM, come riportato nella metodica del saggio commerciale Fluka. I tappi dei tubi tipo Eppendorf vengono riempiti con circa 250 mg di Bionect Start®, il quale viene posto in contatto con la soluzione di substrato ed incubato a 32°C. I tappi vengono sostituiti secondo quanto previsto dal protocollo, al fine di mimare l’applicazione giornaliera, ogni due giorni ed unica.

Step 2: Terminato il periodo di contatto prestabilito, ad ogni timepoint fissato vengono prelevati 125 Î1⁄4Î della miscela di substrato trattato come descritto allo Stepl e posti in un tubo tipo Eppendorf da 1,5 mi. A questa soluzione vengono addizionati 250Î1⁄41 di acido citrico (25mM) e 1,25 mi di etile acetato. La soluzione viene agitata per 15 secondi e centrifugata. L’etile acetato, che contiene il substrato idrolizzato, viene trasferito in un tubo tipo Eppendorf contenente Na2S04anidro. Dopo agitazione e centrifugazione del tubo tipo Eppendorf, la fase organica viene trasferita in un tubo tipo Eppendorf nuovo. Il contenuto di substrato idrolizzato nella fase organica viene determinato spettrofotometricamente a 320 nm. L’analisi dei dati viene riportata nei Grafici 2, 3 e 4.

Appare immediatamente evidente che le formulazioni in polvere hanno una performance decisamente migliore rispetto al prodotto di riferimento, in ciascuna delle frequenze di applicazione testate e per ogni time-point considerato.

In particolare, i valori delle Formulazioni 1 e 4 sono sempre altamente significativi rispetto al prodotto di riferimento, a dimostrazione di una migliore efficacia che si traduce in un minor numero di applicazioni al paziente. In ogni caso à ̈ lampante che le formulazioni in polvere funzionano in modo nettamente superiore a quelle contenenti collagenasi in veicolo lipofilo. Ciò significa non solo che la collagenasi presente nelle formulazioni in polvere funziona nell’ambiente acquoso che si crea con l’assorbimento di essudato da parte dell’amido di mais glicolato, a riprova della stabilità in soluzione acquosa precedentemente rivendicata, ma anche che funziona in modo sorprendentemente migliore di quanto atteso.

Per quanto riguarda le formulazioni iniettabili, come precedentemente detto esse sfruttano sostanzialmente la purezza dell’enzima ottenuto secondo il processo sopra descritto e la sua sorprendente stabilità in veicolo acquoso, sia a T ambiente che a temperature comprese tra -20 e -80°C. Le composizioni iniettabili sono preferibilmente costituite da collagenasi in forma liofilizzata ricostituita in soluzione acquosa preferibilmente al momento dell’uso e comprendono, per dose unitaria:

• collagenasi ottenuta secondo il processo descritto, in quantità equivalente ad un’attività compresa tra 120 e 450 nkat;

• soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) sterile;

• opzionalmente, HA con PM medio ponderale compreso tra 750 e 1200kDa, in concentrazione variabile tra 1 e 30 mg/ml di soluzione salina, preferibilmente tra 8 e 20 mg/ml ed ancor più preferibilmente compresa tra 10 e 15 mg/ml.

Di seguito vengono ora descritti, a puro titolo esemplificativo, alcuni esempi di preparazione di soluzioni iniettabili di collagenasi.

Esempio 8: preparazione di una soluzione iniettabile di collagenasi in soluzione fisiologica sterile (NaCl 0,9%).

Collagenasi equivalente a 196 nkat Soluzione fisiologica sterile 1 mi

L’enzima in forma liofila contenuto in adeguata ampolla sterile viene ricostituito con 0,35 mi di soluzione fisiologica sterile, prelevati con una siringa graduata. Dopo blanda agitazione si ottiene una soluzione stabile.

Esempio 9: preparazione di una soluzione iniettabile di collagenasi in soluzione fisiologica sterile (NaCl 0,9%).

Collagenasi equivalente a 392 nkat Soluzione fisiologica sterile 1 mi

L’enzima in forma liofila contenuto in adeguata ampolla sterile viene ricostituito con 0,7 mi di soluzione fisiologica sterile, prelevati con una siringa graduata. Dopo blanda agitazione si ottiene una soluzione stabile.

Esempio 10: preparazione di una soluzione iniettabile di collagenasi formulata in HA PM 750kDa.

Collagenasi equivalente a 196 nkat

Soluzione di HA Imi

La soluzione di HA viene precostituita sciogliendo 10 mg di HA precedentemente micronizzato contenuto in adeguata ampolla sterile in 1 mi di soluzione fisiologica sterile. L’enzima in forma liofila viene ricostituito con 0,35 mi della soluzione di HA misurati con una siringa graduata. Dopo blanda agitazione fino a scioglimento della polvere di collagenasi si ottiene una soluzione stabile.

Esempio 11 : preparazione di una soluzione iniettabile di collagenasi formulata in HA PM 1200kDa.

Collagenasi equivalente a 392 nkat

Soluzione di HA Imi

La soluzione di HA viene precostituita sciogliendo 15 mg di HA precedentemente micronizzato contenuto in adeguata ampolla sterile in 1 mi di soluzione fisiologica sterile. L’enzima in forma liofila viene ricostituito con 0,7 mi di soluzione di HA misurati con una siringa graduata. Dopo blanda agitazione fino a scioglimento della polvere di collagenasi si ottiene una soluzione stabile.

Le soluzioni così ottenute possono essere conservate a 4°C, anche se à ̈ preferibile iniettarle subito dopo l’allestimento o entro 8 ore.

Oltre agli usi tipicamente terapeutici sopra descritti la collagenasi oggetto della presente invenzione può essere utilizzata per la dissociazione dei tessuti e l’isolamento di cluster o singole cellule, sia a scopo terapeutico che di ricerca sperimentale. Quest’applicazione à ̈ usata, per esempio, nella procedura di trapianto delle isole di Langerhans per isolare le cellule delle isole dal circostante tessuto pancreatico. La collagenasi può essere impiegata con successo anche per l’isolamento di cardiomiociti, di epatociti, di cellule tumorali ai fini dello sviluppo del relativo vaccino, ed in generale per tutte le cellule impiegabili nel settore dell’ingegneria dei tessuti (osso, cartilagine, tiroide, ecc).

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Processo di produzione e purificazione di collagenasi da Vibrio Alginolyticus chemovar. lophagus comprendente le seguenti fasi: Fase A: Inoculo del Vibrio Alginolyticus chemovar. lophagus in beuta e fermentazione con brodo di coltura di origine animale non bovina; Fase B: Chiarifica del brodo fermentato così ottenuto mediante ultrafiltrazione tangenziale con cassette da 100-500 kD Molecular Weight Cut-Off (MWCO), preferibilmente pari a 300kD; Fase C: Dialisi e concentrazione del medium chiarificato ottenuto nella fase B, mediante ultrafiltrazione tangenziale con cassette da 5-30 kD MWCO, preferibilmente 10 kD MWCO; Fase D: Purificazione della soluzione contenente collagenasi ottenuta nella fase C, mediante resina a scambio anionico portatrice di gruppi basici deboli, a pH compreso tra 6,9 e 7,4, preferibilmente pari a pH 7,1 ; Fase E: Dialisi e concentrazione delle frazioni raccolte e aventi attività collagenolitica, provenienti dalla fase D, mediante ultrafiltrazione tangenziale con cassette da 10-50kD MWCO, preferibilmente 30kD MWCO; Fase F: Purificazione della soluzione così ottenuta, mediante resina a scambio anionico portatrice di gruppi basici forti, a pH compreso tra 6,9 e 7,4, preferibilmente pari a pH 7,1; Fase G: Diafiltrazione e concentrazione delle frazioni ad attività collagenolitica > 95%, provenienti dalla fase F, mediante ultrafiltrazione tangenziale con cassette da 10-50kD MWCO, preferibilmente 30kD MWCO; Fase H: Filtrazione della soluzione contenente collagenasi così ottenuta, mediante filtro assoluto da 0,2 pm e conservazione a temperatura compresa tra -20° e -80°C.
2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui il brodo di coltura à ̈ di origine animale suina o à ̈ una miscela di origine suina e vegetale.
3. 3. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui la resina a scambio anionico portatrice di gruppi basici deboli à ̈ portatrice di gruppi dietilaminoalchil, preferibilmente dietilaminoetil, e la resina a scambio anionico portatrice di gruppi basici forti à ̈ portatrice di gruppi di ammonio quaternario.
4. 4. Collagenasi da Vibrio Alginolyticus chemovar. Iophagus prodotta e purificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 caratterizzata da: • Peso Molecolare 82 kDa • attività specifica compresa tra 1000 e 1800 nkat/mg • purezza compresa tra 98,0 e 100%; • assenza di contaminanti batterici e proteici; • stabilità a pH compreso tra 5,5 e 11 ; • stabilità in soluzione acquosa a T comprese tra 4° e 40°C, particolarmente stabile a 37°C; • stabilità in soluzione acquosa a 4°C per 30 giorni; • stabilità in soluzione acquosa a T compresa tra -20°C e -80°C per 24-48 mesi; • liofilizzabilità con ottenimento di una polvere liofila stabile.
5. 5. Collagenasi secondo la rivendicazione 4 stabile in soluzione acquosa comprendente TRIS-HC1 25mM e CaCl210 mM, a pH 7,1.
6. 6. Collagenasi secondo le precedenti rivendicazioni 4-5 in forma di polvere liofila stabile avente attività enzimatica compresa tra 7-20 nkat/mg di polvere, contenente: - Maltosio: 95-96 % preferibilmente 95,75% - Sali: 1,0- 1,5 % preferibilmente 1,3% - Collagenasi: 2, 5-3, 5 % preferibilmente 2,95%.
7. 7. Composizioni farmaceutiche ad uso topico, in forma di polvere aspersoria, comprendenti: • collagenasi secondo le rivendicazioni 4 o 6, in quantità equivalente ad un’attività compresa tra 2 e 8 nkat/g di prodotto finito, preferibilmente pari a 5nkat/g di prodotto finito; • amido di mais glicolato, in quantità necessaria al completamento della composizione percentuale; • opzionalmente acido ialuronico con PM medio ponderale compreso tra 130 e 230 kDa, preferibilmente tra 145 e 210 kDa ed ancor più preferibilmente tra 160 e 200 kDa, in una quantità compresa tra 0,1 e 5 %, preferibilmente compresa tra 0,2 e 2%; • opzionalmente diossido di silicio colloidale in una quantità compresa tra 0,1 e 3%, preferibilmente compresa tra 0,2 e 1%.
8. 8. Composizioni farmaceutiche iniettabili, comprendenti, per dose unitaria: • collagenasi secondo le rivendicazioni 4 o 6, in forma liofilizzata, in quantità equivalente ad un’attività compresa tra 120 e 450 nkat; • soluzione fisiologica sterile; • opzionalmente, acido ialuronico con PM medio ponderale compreso tra 750 e 1200kDa, in concentrazione variabile tra 1 e 30 mg/ml di soluzione salina, preferibilmente tra 8 e 20 mg/ml e ancor più preferibilmente compresa tra 10 e 15 mg/ml.
9. 9. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 7 per uso nel trattamento topico e/o locale di ustioni di vario grado, scottature, piaghe da decubito, ulcere vascolari e diabetiche, cellulite, adesioni post operatorie, cicatrici ipertrofiche, cheloidi.
10. 10. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 8 per uso nel trattamento della capsulite adesiva, della contrattura di Dupuytren, della malattia di Peyronie.