RU2781289C1 - Способ получения высокоочищенного концентрированного препарата с коллагеназной активностью - Google Patents
Способ получения высокоочищенного концентрированного препарата с коллагеназной активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781289C1 RU2781289C1 RU2021110077A RU2021110077A RU2781289C1 RU 2781289 C1 RU2781289 C1 RU 2781289C1 RU 2021110077 A RU2021110077 A RU 2021110077A RU 2021110077 A RU2021110077 A RU 2021110077A RU 2781289 C1 RU2781289 C1 RU 2781289C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagenases
- preparation
- collagenase
- concentrated
- obtaining
- Prior art date
Links
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 title claims abstract description 89
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 title claims description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000000813 microbial Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 240000008213 Brosimum alicastrum Species 0.000 claims abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000005828 ramon Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 13
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 9
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 9
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 2
- 108090001092 Clostripain Proteins 0.000 description 2
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 2
- 206010023330 Keloid scar Diseases 0.000 description 2
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 2
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004127 Vitreous Body Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 2
- NZIUUYVTBDHFPN-FCDQGJHFSA-N (3Z)-6-acetamido-4-oxo-3-[[4-(2-sulfooxyethylsulfonyl)phenyl]hydrazinylidene]naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC(NC(=O)C)=CC=C2C=C(S(O)(=O)=O)\C1=N/NC1=CC=C(S(=O)(=O)CCOS(O)(=O)=O)C=C1 NZIUUYVTBDHFPN-FCDQGJHFSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108060001710 COG2 Proteins 0.000 description 1
- 208000008516 Capsule Opacification Diseases 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 210000000795 Conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 208000006069 Corneal Opacity Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 210000000744 Eyelids Anatomy 0.000 description 1
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010074224 Hyaluronoglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010022941 Iridocyclitis Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 210000001525 Retina Anatomy 0.000 description 1
- 206010042736 Symblepharon Diseases 0.000 description 1
- 210000002435 Tendons Anatomy 0.000 description 1
- 206010053476 Traumatic haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000269 corneal opacity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 239000011363 dried mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organisms (GMOs) Nutrition 0.000 description 1
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000001187 sodium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к способу получения концентрированного препарата коллагеназ, включающему культивирование продуцента Clostridium histolyticum 468 или продуцента Clostridium histolyticum SK В-8362 в анаэробных условиях на питательной среде Рамона, последующее отделение микробной массы путем фильтрации с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм, ультрафильтрацию, концентрирование, микрофильтрацию, хроматографическую очистку и концентрирование очищенного концентрата коллагеназ, при этом способ отличается тем, что проводят объединение фракций, содержащих количество коллагеназ I и II типов более 70% мас. от общей массы фракции, проводят концентрирование очищенного концентрата коллагеназ на ультрафильтрационной установке, получая очищенные коллагеназы I и II типа, смешивание полученного препарата со стабилизаторами. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Область изобретения
Изобретение относится к препарату, содержащему фермент коллагеназу с различной степенью активности, т.е. препарату с коллагеназной активностью, который может применяться для деструкции коллагеновой ткани и образований из нее, при этом препарат является концентрированным и имеет активность более 1000 КЕ/мг, в частности, от 1000 до 10000 КЕ на ампулу.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время шрамы и келоидные рубцы представляют собой состояние, при котором в месте образования наблюдается утолщение коллагеновой ткани. Существуют различные методы лечения таких образований, например, лазерная шлифовка кожи, применение местных препаратов, чаще всего мазей с гиалуронидазой, гепарином или коллагенолитических протеаз, а также препараты для местного введения в виде инъекций. Активным веществом таких препаратов является коллагеназа - фермент, относящийся к протеолитическим средствам, расщепляющим пептидные связи в определенных участках спирализованных областей коллагена, избирательно действует на коллаген, полипептидную цепь, вызывая его деструкцию.
В настоящее время известны препараты, содержащие коллагеназы различных типов. Одним из таких препаратов является Коллализин®, включающий коллагеназу в количестве от 100 до 1000 коллагеназных единиц на препарат (ампулу). Однако, данный препарат представляет собой смесь коллагеназ различных типов, которая достаточно трудно подвергается стандартизации, а также может содержать примеси, которые могут снижать стабильность получаемого препарата или его терапевтическую активность. Важным с точки зрения очистки получаемых препаратов коллагеназ является низкое содержание клострипаина - фермента, в присутствии которого коллагеназа разрушается, и препарат при хранении теряет свою активность.
В настоящее время известны различные способы получения коллагеназ. Данные способы включают получение коллагеназ как при культивировании клостридиальных штаммов, например, Clostridium histolyticum, так и при использовании генно-модифицированных организмов (E.coli и других) (Конон А.Д., Петровский С.В., Шамбурова М.Ю., Уварова А.В., Козлова Ю.О., Григорьева М.В., Москвичев Б.В. Особенности биотехнологий клостридиальных коллагеназ - перспективных ферментов медицинского назначения // Медицина экстремальных ситуаций. 2016. №2 (56)).
Согласно патенту РФ № 2687973, известен способ получения Коллализина®- препарата, содержащего комплекс коллагеназ, включающий путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum в анаэробных условиях на питательной среде Рамона с последующим отделением микробной массы путем фильтрации, отличающийся тем, что для культивирования используют продуцент Clostridium histolyticum 468 или продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, а отделение микробной массы проводят с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм с исключением попадания культуры в нативный раствор, применяя номинальную и абсолютную стерилизующую фильтрацию нативного раствора с дальнейшей ультрафильтрацией, концентрированием и хроматографической очисткой на основе сорбента Sephacryl S-100. Дальнейшую очистку и концентрирование коллагеназы проводили при помощи тангенциальной ультрафильтрации с кассетами с порогом отсечения 50 кДа, подвергали микрофильтрации (0,45 мкм) концентрата коллагеназ перед подачей на хроматографическую колонку, содержащую сорбент Sephacryl S-100, и концентрировали на ультрафильтрационной установке с применением кассет 5 кДа. Однако, получаемый препарат коллагеназ имеет достаточное высокое количество низкомолекулярных примесей, что может приводить к повышенным аллергическим реакциям и нестабильности препарата, что может проявляться во время хранения продукта в виде тенденции к снижению показателей активности. Кроме того, сам способ получения не является рациональным в виду использования сложного многостадийного оборудования и потерь при передаче продукта со стадии на стадию.
Таким образом, представляется актуальным и необходимым разработка высокоочищенного концентрированного препарата с коллагеназной активностью, который бы имел стабильность и малую потерю терапевтической активности при длительном хранении.
Описание чертежей
На Фиг. 1 показана электрофореграмма коллагеназ I и II типа:
1 - маркер молекулярного веса; 2 - фракция с коллагеназами I и II типа.
На Фиг. 2. показана электрофореграмма коллагеназ I и II типа после гель-фильтрации: 1 - маркер молекулярного веса; 2 - фракция с коллагеназами I и II типа.
На Фиг. 3 приведена электрофореграмма препарата коллагеназ, получаемых способом согласно изобретению, после очистки на сорбенте CHT™ Type II:
1 - маркер молекулярного веса;
2 - собранные/объединенные фракции (10 мкг).
На Фиг. 4 показана электрофореграмма препарата коллагеназ, получаемых способом согласно изобретению, после очистки на ионообменном сорбенте SP Sepharose HP: 1 - маркер молекулярного веса; 2 - собранная фракция № 1 с SP Sepharose HP (10 мкг); 3 - собранная фракция №2 с SP Sepharose HP (10 мкг).
Описание изобретения
Предложен способ получения готового концентрированного препарата коллагеназ, включающий
- культивирование продуцента Clostridium histolyticum 468 или оригинального продуцента Clostridium histolyticum SK В-8362 в анаэробных условиях на питательной среде Рамона;
- последующее отделение микробной массы путем фильтрации с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0 - 0,8 до 0,3 - 0,1 мкм;
- ультрафильтрацию;
- концентрирование;
- микрофильтрацию;
- хроматографическую очистку;
- концентрирование очищенного концентрата коллагеназ,
при этом способ отличается тем, что проводят объединение фракций, содержащих максимальное количество коллагеназ I и II типов, проводят концентрирование очищенного концентрата коллагеназ на ультрафильтрационной установке, получая очищенные коллагеназы I и II типа, смешивания компонентов и стабилизаторов при получении препарата.
Максимальное количество коллагеназ I и II типов означает, что количество коллагеназы по данным хроматографии, превышает 70% мас. от общей массы фракции.
В качестве стабилизаторов могут быть добавлены фармацевтически приемлемые стабилизаторы, такие как сахара, например, сахароза, маннит, сорбит, или стабилизаторы иной природы, например, трометамол. Данные стабилизаторы могут добавляться в количествах, традиционно используемых в данной области, например, в количестве от 0,5% до 20% от массы конечного состава.
Предлагаемый согласно изобретению, способ дополнительно включает стадию лиофилизации после получения концентрированного препарата коллагеназ и стабилизаторов.
Концентрированный препарат коллагеназ обозначает препарат коллагеназ, имеющий коллагеназную активность от 1000 КЕ (коллагеназных единиц) на препарат (ампулу или мг) и более, например, от 1000 КЕ до 10000 КЕ.
Таким образом, согласно данному способу можно получить концентрированный препарат коллагеназ, включающий коллагеназы I и II типа, и имеющий повышенную степень чистоты и активности.
Следует отметить, что по сравнению с ранее разработанными способами получения препаратов коллагеназ, например, препарата Коллализин®, получение которого описано в патенте РФ № 2687973, способ получения концентрированного препарата коллагеназ согласно настоящему изобретению имеет следующие отличия:
- двустадийная ионообменная хроматографическая очистка позволяет рационализировать процесс очистки и сделать его более технологичным и экономически выгодным.
- использование сорбента для очистки, например, мультимодального сорбента CHT™ Type II (Bio-Rad), способствует значительному снижению высокомолекулярных и низкомолекулярных примесей в растворе элюата, а также повышает разрешающую способность хроматографического разделения примесей и целевого промежуточного продукта.
- Введение последующей стадии очистки с использованием катионообменной хроматографии, например, на сорбенте SP Sepharose HP, способствует значительному уменьшению количества примесей, оставшихся после предыдущей стадии очистки (где это видно, на каком рисунке??) (фиг. 4),
- на стадии ультрафильтрации на мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кДа дополнительно введен этап диафильтрации буфером, использована двустадийная хроматографическая очистка (на мультимодальном сорбенте CHT™ Type II и на катионообменном сорбенте SP Sepharose HP) с отбором фракций, контролируемым по методу электрофореза, содержащих коллагеназы I и II типа. Последующее концентрирование и диафильтрация на ультрафильтрационной кассете с порогом отсечения 50 кДа позволяет добиться не только концентрирования, но получить более очищенный препарат за счет дополнительного удаления низкомолекулярных примесей, образующихся в ходе технологического процесса, по сравнению с препаратом, полученным при использовании ультрафильтрационной кассеты с порогом отсечения 5 кДа. Необходимо также отметить, что повышение чистоты активных компонентов (коллагеназ I и II типа) целенаправленного действия значительно снижает появление побочных реакций на препарат коллагеназ. Таким образом, способ получения препарата коллагеназ позволяет получить концентрированный препарат коллагеназ I и II типа в виде препарата с меньшим количеством примесей, с более низкими показателями аллергенности, и более длительным сроком хранения.
Важным этапом рационализации процесса стала стадия добавления стабилизаторов при лиофильном высушивании концентрированного препарата для сохранения терапевтических свойств при сопутствующем увеличении срока годности. Внесение сахарозы и трометамола в состав готового препарата потенциально позволит увеличить срок хранения.
Получение нового высокоочищенного концентрированного препарата, содержащего коллагеназы I и II типа, позволило расширить область применения. Ранее препарат Коллализин® был рекомендован в качестве средства профилактики и лечения симблефарона, рубцовых изменений кожи век (келоидные рубцы), конъюнктивы глазного яблока после ожога, при стриктурах слезоотводящих путей (слезные канальцы и слезноносовой канал), помутнениях роговицы, пластическом иридоциклите (в стадии стихания воспалительных явлений), вторичной катаракте, помутнении стекловидного тела, рубцах сетчатки, при травматическом кровоизлиянии в стекловидное тело, занимающем более 1/2 его объема и в срок от 3 суток после образования гемофтальма.
Далее изобретение будет рассмотрено на примерах, которые не являются ограничивающими объем изобретения.
Пример 1
Получение препарат коллагеназ
Для получения данного препарата культивировали штамм Clostridium histolyticum 468 или оригинальный продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, отделяли микробную массу через каскад глубинных фильтров, полученный фильтрат подвергали тангенциальной фильтрации с кассетами 50 кДа с последующей микрофильтрации на мембранах с размером пор 0,45 мкм и очищением методом гель-фильтрации на хроматографической колонке, заполненной сорбентом на основе Sephacryl S-100, как описано в патенте № 2687973.
Сбор фракций осуществляли равными аликвотами. Начало сбора фракций определяли по результатам измерений оптической плотности элюата при длине волны 280 нм. Во фракциях контролировали содержание белка по методу Бредфорда и/или Лоури, коллагеназную активность, а также чистоту и соотношение коллагеназ I и II типа посредством денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле в невосстановленных условиях с концентрацией геля 10 %. Далее, на основе полученных данных, после визуализации по SDS-PAGE, объединяли фракции, содержащие количество коллагеназ I и II типа более 70% мас. от общей массы фракции. Для этого отбирали фракции, при анализе которых выявляли наиболее яркие бэнды на уровне белка с молекулярной массой 112-114 кДа, что свидетельствовало о нахождении коллагеназ в соответствующих фракциях (Фиг. 2).
Полученный промежуточный продукт, содержащий смесь высокоактивных коллагеназ, подвергали концентрированию на ультрафильтрационной установке при помощи мембран с размером пор 50 кДа в 10 раз от исходного объема. Продукт подавали со скоростью от 4,0 до 6,0 л/ч, при температуре (5 ± 3) °С, затем передавали на стадию объединения препарата со стабилизаторами. В качестве стабилизаторов использовали сахарозу в виде 0,5 М раствора (до концентрации 37 мг/мл в сведенном препарате) и трометамол в виде 0,1 М раствора (до концентрации 2,4 мг/мл в сведенном препарате). Полученный препарат стерилизовали с использованием мембранных фильтров с размером пор 0,2 мкм, разливали в ампулы или флаконы и лиофильно высушивали.
Способ позволял получить препарат, содержащий смесь коллагеназ I и II типа, со стабильность всех показателей качества в течение установленного срока годности.
Пример 2
Получение препарата коллагеназ
Для получения данного препарата культивировали штамм Clostridium histolyticum 468 или оригинальный продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, отделяли микробную массу через каскад глубинных фильтров, полученный фильтрат подвергали тангенциальной фильтрации с кассетами 50 кДа.
После концентрирования перед первой стадией хроматографической очистки проводили диафильтрацию с применением буфера 20 мМ NaPB pH 6,8. Первую стадию хроматографической очистки на мультимодальном сорбенте CHT™ Type II проводили с применением фосфатных буферов для градиентного элюирования: Буфер нанесения - 20 мМ NaPB pH 6,8 и Буфер элюции - 500 мМ NaPB pH 6,8. Сбор фракций осуществляли аликвотами равного объема. Во фракциях контролировали содержание белка и коллагеназную активность спектрофотометрическим методом, а также чистоту и соотношение коллагеназ I и II типа посредством денатурирующего электрофореза в 8 % - ом полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях (Фиг. 3).
Собранные/объединенные фракции дополнительно очищали на катионообменном сорбенте SP Sepharose HP, предварительно переведя фракции с белком в буфер нанесения. В ходе хроматографии применяли следующие буферы для градиентного элюирования: Буфер нанесения - 20 mM NaAcO pH 4,0 и Буфер элюции - 20 mM NaAcO, 1 M NaCl pH 4,0.
Во фракциях контролировали содержание белка и коллагеназную активность спектрофотометрическим методом, а также чистоту и соотношение коллагеназ I и II типа посредством денатурирующего электрофореза в 8 % - ом полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях с концентрацией полиакриламидного геля (Фиг. 4). Как видно из данных, представленных на Фиг. 4, удалось значительно снизить концентрацию остаточных примесей, в том числе и клострипаина.
Полученный промежуточный продукт концентрировали на ультрафильтрационной кассете с порогом отсечения 50 кДа и получали препарат коллагеназ согласно примеру 1.
Предложенный способ позволял получить концентрированный препарат, содержащий коллагеназы I и II типа, со стабильностью всех показателей качества в течение установленного срока годности.
Пример 3
Определение коллагеназной активности
Определение полученной коллагеназной активности проводили по методу, описанному в патенте RU 2709513.
Полученный препарат коллагеназы анализировали на образце окрашенного коллагена, полученного как описано в патенте выше. Коллаген из бычьих сухожилий измельчали на мельнице ДМ-6, отбирали 5 г продукта и помещали в колбу объемом 500 мл, добавляли 80 мл воды очищенной. В эту же колбу вносили 50 мл раствора, содержащего 0,1 г красителя RO16. Смесь перемешивали на шейкере при 40°С при 130 об/мин, через 15 мин добавляли дважды 50 мл 6% раствора натрия хлорида, через 25 мин добавляли еще 37,5 мл 2% раствора карбоната натрия и выдерживали 2 часа. Затем полученную реакционную смесь помещали на сито и промывают 3 л воды. После удаления избытка воды полученный субстрат помещали на чашку Петри, замораживали при температуре - 40°С и лиофилизировали. Высушенную смесь измельчали на мельнице 20 мин при 1100 об/мин. Конечный субстрат представлял собой волокна в виде ваты оранжевого цвета; рН суспензии окрашенного коллагена при измерении в воде был равен 7,9; размер частиц не более 2 мм. Спектр поглощения кислотного гидролизата образца окрашенного коллагена проявлял максимум при 212 нм, 288 нм, 361 нм и 480 нм.
Далее измеряли коллагеназную активность полученного препарата путем измерения количества продуктов ферментативного гидролиза в растворе. На основании полученных экспериментальных данных вычисляли специфическую активность коллагеназы, которая выражается в единицах коллагеназной активности. За единицу коллагеназной активности (ЕД) принято количество коллагеназы, приводящее к увеличению оптической плотности при длине волны 490 нм, вызванному ферментативным расщеплением 1 мг коллагена, окрашенного красителем реактивным оранжевым RO16 в стандартных условиях реакции.
При анализе полученного препарата коллагеназы была определена активность как 1020 ЕД на 1 мг. (минимально). После получения серии активность из 5 образцов была определена как средняя и составила не менее 1200 Ед на 1 мг.
Пример 4
Определение стабильности готового концентрированного препарата
Стабильность коллагеназной активности определяли, как описано в Примере 3, в течение времени хранения. Использовали тест при ускоренном старении: флаконы с лиофилизатом готового препарата коллагеназ хранили в течение 3 мес., при температуре 55°С, с отбором флакона каждый мес. на анализ коллагеназной активности. Дополнительно, в качестве объекта сравнения использовали образец препарата коллагеназы, полученный по способу согласно RU 2687973. По истечение 3 мес. определяли коллагеназную активность образцов, хранимых в условиях повышенной температуры, а также при комнатной температуре.
Результаты определения коллагеназной активности приведены в таблице ниже.
| № | Время с начала хранения | Активность, КЕ/ампулу. | |
| Образец согласно изобретению | Образец согласно RU 2687973 |
||
| 1 | 0 | 10200 | 1200 |
| 2 | 30 дней | 10180 | 1100 |
| 3 | 60 дней | 10190 | 1100 |
| 4 | 90 дней | 10180 | 980 |
| 5 | Хранение при комнатной температуре, 3 мес. | 10200 | 990 |
Таким образом, на основании полученных результатов видно, что концентрированный препарат коллагеназ, полученный согласно изобретению, имеет более высокую коллагеназную активность, а также более продолжительный срок хранения, в связи с чем срок годности может быть увеличен.
Claims (11)
1. Способ получения концентрированного препарата коллагеназ, включающий
- культивирование продуцента Clostridium histolyticum 468 или продуцента Clostridium histolyticum SK В-8362 в анаэробных условиях на питательной среде Рамона;
- последующее отделение микробной массы путем фильтрации с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0–0,8 до 0,3–0,1 мкм;
- ультрафильтрацию;
- концентрирование;
- микрофильтрацию;
- хроматографическую очистку; и
- концентрирование очищенного концентрата коллагеназ,
при этом способ отличается тем, что проводят объединение фракций, содержащих количество коллагеназ I и II типов более 70% мас. от общей массы фракции, проводят концентрирование очищенного концентрата коллагеназ на ультрафильтрационной установке, получая очищенные коллагеназы I и II типа, и смешивают полученный препарат со стабилизаторами.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стабилизаторов используют сахарозу и трометамол в фармацевтически приемлемых количествах.
3. Способ по пп. 1, 2, дополнительно включающий стадию лиофилизации после получения концентрированного препарата, включающего смесь коллагеназ и стабилизаторы.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2781289C1 true RU2781289C1 (ru) | 2022-10-11 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2180002C2 (ru) * | 1999-08-16 | 2002-02-27 | Пермское научно-производственное объединение "Биомед" | Способ получения коллагеназы |
| EA031435B1 (ru) * | 2012-04-18 | 2019-01-31 | Фидиа Фармачеутичи С.П.А. | Способ получения и очистки коллагеназы из vibrio alginolyticus и применение коллагеназы |
| RU2687973C9 (ru) * | 2018-04-03 | 2020-01-23 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2180002C2 (ru) * | 1999-08-16 | 2002-02-27 | Пермское научно-производственное объединение "Биомед" | Способ получения коллагеназы |
| EA031435B1 (ru) * | 2012-04-18 | 2019-01-31 | Фидиа Фармачеутичи С.П.А. | Способ получения и очистки коллагеназы из vibrio alginolyticus и применение коллагеназы |
| RU2687973C9 (ru) * | 2018-04-03 | 2020-01-23 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GRANT N.H. et al., Studies on the collagenases of Clostridium histolyticum, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, Vol.82, N2, pp.245-255. BOND M.D. et al., Relationship between the individual collagenases of Clostridium histolyticum: evidence for evolution by gene duplication, Biochemistry, 1984, Vol.23, N13, pp.3092-3099. MANDL I. et al., Isolation and characterization of proteinase and collagenase from Cl. Histolyticum, J Clin Invest, 1953, Vol.32, N12, pp.1323-1329. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210222142A1 (en) | Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin | |
| DE69735308T2 (de) | Enzymzusammensetzung für die freisetzung von zellen aus geweben. | |
| DE60125986T3 (de) | Pharmazeutische Zusammensetzungen mit Botulinum Toxin | |
| US20190071659A1 (en) | Compositions and methods for producing clostridial collagenases | |
| EP0326014A1 (en) | Composition of anticoagulants | |
| US5202117A (en) | Method of treating thrombi with g-csf | |
| EP2865748A1 (en) | Culture medium for bacteria of the genus clostridium without components of animal origin, and method for producing a supernatant containing one or more proteases with colagenolytic and gelatinolytic activity | |
| US20200354707A1 (en) | Process for the production and purification of the collagenase enzyme from vibrio alginolyticus | |
| RU2781289C1 (ru) | Способ получения высокоочищенного концентрированного препарата с коллагеназной активностью | |
| US9943575B2 (en) | Pharmaceutical compositions of tenecteplase | |
| WO2000039290A2 (de) | Pharmazeutische formulierung enthaltend ein hyaluronsäure-spaltendes enzym mikrobieller herkunft | |
| RU2236460C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
| WO2010070746A1 (ja) | イヌアンジオスタチン様ポリペプチド | |
| DE19860541A1 (de) | Pharazeutische Formulierung enthaltend glycosaminoglycanspaltendes Enzym |