RU2687973C9 - Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний - Google Patents
Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2687973C9 RU2687973C9 RU2018112126A RU2018112126A RU2687973C9 RU 2687973 C9 RU2687973 C9 RU 2687973C9 RU 2018112126 A RU2018112126 A RU 2018112126A RU 2018112126 A RU2018112126 A RU 2018112126A RU 2687973 C9 RU2687973 C9 RU 2687973C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- producer
- clostridium histolyticum
- filtration
- preparation
- collagenase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract 3
- 230000000893 fibroproliferative effect Effects 0.000 title claims abstract 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 240000008213 Brosimum alicastrum Species 0.000 abstract description 5
- 235000005828 ramon Nutrition 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 abstract 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URCYCZPVXXIFSR-UHFFFAOYSA-M 2-[3-[(4-amino-2-methylpyrimidin-5-yl)methyl]-4-methyl-1,3-thiazol-3-ium-5-yl]ethanol;bromide Chemical compound [Br-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N URCYCZPVXXIFSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 238000011101 absolute filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к промышленной технологии получения ферментного препарата Коллализин® для использования в медицинских целях. Способ получения Коллализина® путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum в анаэробных условиях на питательной среде Рамона с последующим отделением микробной массы путем фильтрации, при этом для культивирования используют продуцент Clostridium histolyticum 468 или продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, а отделение микробной массы проводят с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм с исключением попадания культуры в нативный раствор, применяя номинальную и абсолютную стерилизующую фильтрацию нативного раствора с дальнейшей ультрафильтрацией, концентрированием и хроматографической очисткой на основе сорбента Sephacryl S-100. Применение Коллализина® для лечения фибропролиферативных заболеваний. Вышеописанный способ получения позволяет получить препарат, обладающий высокой коллагеназной активностью и сохраняющий стабильность всех показателей качества в течение установленного срока годности 2 года. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.
Description
Известен способ получения коллагеназы путем культивирования штамма Clostridium histolyticum 468 в казеиново-соево-пепсиновой среде. Культивирование проводили в ферментере объемом 160 л в течение 72 ч при 37°С в среде следующего состава (г/л): гидролизат казеина и соевого шрота - 969, NaH2PO4 - 1,5, K2НРO4 - 1,5, пиридоксин - 0,0020, рибофлавин - 0,0020, тиамина бромид - 0,0020, фолиевая кислота - 0,0020, пантотенат кальция - 0,0020, никотиновая кислота - 0,0020, липоевая кислота - 0,0020, биотин - 0,0010. Фермент очищали и концентрировали на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кДа, полученный концентрат лиофильно высушивали. Активность 1 мг готового препарата составляла 0,20-0,25 ед. лейцина за 20 мин инкубации в реакционной смеси (патент RU 2180002 опубликован в 2002 г., с 17.05.2011 патент прекратил действие). Недостатком данного способа является сложность использования данной питательной среды в промышленных масштабах, а именно в необходимости предварительной подготовки соевого шрота, а также в использовании дорогостоящих витаминов и необходимости многократной отмывки коллагеназы.
Описан еще один способ получения коллагеназы путем культивирования С. histolyticum (патент WO 2007/089851 А2). В отличие от нашей технологии очистка препарата ведется с использованием ультрафильтрации с размером пор 10 кДа, что позволяет отделить только олигопептиды и небольшие белки. Другим отличием является применение ионообменной хроматографии на колонке с Q-Sepharose HP. Это более дорогой способ, по сравнению с предложенной нами гельфильтрацией, которая более эффективно разделяет белки по молекулярной массе, что особенно важно при получении высокомолекулярных белков, таких как коллагеназа.
В 2017 году ФГУП СПбНИИВС ФМБА России разработан способ получения Коллализина® в виде высокоочищенного препарата с высокой активностью комплекса коллагеназ, основанный на культивировании Clostridium histolyticum 468 или оригинального продуцента Clostridium histolyticum SK В-8362 на среде Рамона с последующим усовершенствованием технологии выделения, концентрирования и очистки фракций, содержащих коллагеназы. По сравнению с ранее использованными способами получения препарата коллагеназы путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum штамм 468 на бульоне Рамона с добавлением 1% (по объему) глюкозы с последующим осаждением 60% сульфатом аммония и очисткой методом гельфильтрации на колонке, заполненной сефадексом G-100 (Авторское свидетельство 694534, кл. С12D 13/10, 1979) культуральная жидкость подвергается очистке через каскад глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм. С целью исключения попадания клеток культуры в нативный раствор введена дополнительная номинальная и абсолютная фильтрация через стерилизующие фильтры 0,2 мкм. Все это в комплексе позволяет получать нативный раствор, освобожденный от бактериальной массы с минимальными потерями по коллагеназной активности, и исключает риск попадания культуры в нативный раствор. Выделение и концентрирование фермента методом тангенциальной ультрафильтрации нативного раствора исключает стадию высаливания белков сульфатом аммония. Концентрирование проводят в 15 раз от исходного объема с одновременным разделением продукта на мембранах 50 кДа на необходимые фракции белков. Замена стадии высаливания белков на ультрафильтрацию значительно сокращает время основных технологических и вспомогательных операций с 26 часов до 2-3 часов, а также исключает использование в производственном процессе аммонийной соли серной кислоты, с необходимостью последующего отделения ее от целевого белка центрифугированием. Использование мембран в 50 кДа позволяет получать продукт с отсечением балластных веществ (липидов, нуклеиновых кислот, низкомолекулярных комплексов), а также значительно осветлять раствор концентрата коллагеназ.
Дополнительная микрофильтрация концентрата через фильтр 0,45 мкм и очистка гельхроматографией с применением современного сорбента Sephacryl S-100, позволяет получать высокоочищенный препарат, содержащий комплекс коллагеназ с высокой активностью. Включение стадии фильтрации через мембранные фильтры 0,45 мкм значительно снижает биологическую нагрузку на сорбент при хроматографической очистке, а замена геля Sephadex G-100 на современный Sephacryl S-100 позволило увеличить скорость фильтрации в 10 раз. Очищенный концентрат коллагеназ подвергают концентрированию в 10 раз на кассете с отсечением 5 кДа. На рисунке представлены результаты электрофореза белков коллагеназ в промежуточных продуктах на различных стадиях очистки и в лиофилизированном препарате. Как видно из данных, представленных на рисунке 1, все проведенные мероприятия при постадийном подходе к усовершенствованию технологии позволили получить высокоочищенный препарат при сохранении высокой коллагеназной активности.
Пример получения Коллализина®.
Для получения данного препарата культивируют штамм Clostridium histolyticum 468 или оригинальный продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362. Запаянную пробирку со штаммом культуры на полужидком агаре вскрывают и ее содержимое пипеткой переносят в 10 пробирок (по 1,0 мл в каждую), содержащих среду Рамона, предварительно прогретой до 60-70°С. Пробирки с культурой выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч. По истечении времени путем визуального контроля и микроскопии отбирают пробирки с наиболее хорошим ростом чистой культуры. Отобранные образцы культуры пересевают на пробирки с 20 мл среды Рамона, предварительно прогретые до 60-70°С из расчета 5 мл культуры на 1 пробирку. Пробирки с внесенной культурой выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч. Полученный посевной материал используют для получения культуральной жидкости. В качестве питательной среды используют бульон Рамона, содержащий пептон Рамона, мясной экстракт 1:1, натрий хлористый, кровь говяжью сухую, воду очищенную.
Стерильный бульон Рамона, содержащей глюкозу в оптимальной для выращивания культуры концентрации, перед посевом подогревают до температуры 60-70°С и засевают посевной материал. Питательную среду с культурой выдерживают при температуре (37±1)°С при оптимальной длительности культивирования, обеспечивающем синтез фермента с максимальной коллагеназной активностью. По окончании процесса биосинтеза фермента производят отбор проб для микроскопии и определения коллагеназной активности качественной реакцией (измеряют оптическую плотность фильтрата лизированного коллагена при длине волны 510 нм).
Нативный раствор получают отделением микробной массы из культуральной жидкости с помощью фильтрации через каскад глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм. Попадание клеток культуры в продукт исключает использование капсул для номинальной и абсолютной стерилизации (0,2 мкм).
Полученный фильтрат подают на установку тангенциальной фильтрации с кассетами 50 кДа. К раствору добавляют двукратный объем воды для инъекций, доводят значение рН до 7,18 при помощи 1 М NaOH и концентрируют на ультрафильтрационной установке при помощи мембран с размером пор 50 к Да в 15 раз от исходного объема. В полученном концентрате контролируют содержание белка по методу Лоури и по методу Бредфорда, коллагеназную активность, чистоту целевого белка.
Предварительную очистку проводят методом микрофильтрации на мембранах с размером пор 0,45 мкм.
Полученный концентрат, содержащий смесь коллагеназ, очищают методом гельфильтрации на хроматографической колонке, размером 108*950 мм заполненной сорбентом на основе Sephacryl S-100. Элюцию проводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,2±0,2). Концентрат подают со скоростью 4,0-6,0 л/ч, при температуре (5±3)°С. Начало сбора фракций определяют по результатам измерений оптической плотности элюата при длине волны 280 нм. Сбор осуществляют до начала выхода пигмента. Очищенный препарат, содержащий смесь высокоактивных коллагеназ, подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке при помощи мембран с размером пор 5 кДа в 10 раз от исходного объема, затем стерилизуют с использованием мембранных фильтров с размером пор 0,2 мкм. Разливают в ампулы или флаконы и лиофильно высушивают.
Способ позволяет получить препарат, обладающий коллагеназной активностью равной не менее 10000 КЕ в ампуле или флаконе и сохраняющий стабильность всех показателей качества в течение установленного срока годности (2 года).
Claims (6)
1. Способ получения Коллализина® путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum в анаэробных условиях на питательной среде Рамона с последующим отделением микробной массы путем фильтрации, отличающийся тем, что для культивирования используют продуцент Clostridium histolyticum 468 или продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, а отделение микробной массы проводят с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм с исключением попадания культуры в нативный раствор, применяя номинальную и абсолютную стерилизующую фильтрацию нативного раствора с дальнейшей ультрафильтрацией, концентрированием и хроматографической очисткой на основе сорбента Sephacryl S-100.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коллагеназу очищают и концентрируют в 15 раз, применяя тангенциальную ультрафильтрацию с кассетами 50 кДа.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что вводят стадию микрофильтрации с размером пор 0,45 мкм концентрата коллагеназ перед подачей на хроматографическую колонку.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что использование сорбента Sephacryl S-100 увеличивает скорость фильтрации в 10 раз.
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что добавляют стадию концентрирования очищенного концентрата коллагеназ в 10 раз на ультрафильтрационной установке с применением кассет 5 кДа.
6. Применение Коллализина®, полученного способом по п.1, для лечения фибропролиферативных заболеваний.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018112126A RU2687973C9 (ru) | 2018-04-03 | 2018-04-03 | Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018112126A RU2687973C9 (ru) | 2018-04-03 | 2018-04-03 | Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2687973C1 RU2687973C1 (ru) | 2019-05-17 |
| RU2687973C9 true RU2687973C9 (ru) | 2020-01-23 |
Family
ID=66579099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018112126A RU2687973C9 (ru) | 2018-04-03 | 2018-04-03 | Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2687973C9 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2781289C1 (ru) * | 2021-04-12 | 2022-10-11 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Способ получения высокоочищенного концентрированного препарата с коллагеназной активностью |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU694534A1 (ru) * | 1978-03-20 | 1979-10-30 | Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток | Способ получени коллагеназы |
| RU2180002C2 (ru) * | 1999-08-16 | 2002-02-27 | Пермское научно-производственное объединение "Биомед" | Способ получения коллагеназы |
| WO2013165304A1 (en) * | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Yo Proteins Ab | Methods for modification of tissues |
-
2018
- 2018-04-03 RU RU2018112126A patent/RU2687973C9/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU694534A1 (ru) * | 1978-03-20 | 1979-10-30 | Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток | Способ получени коллагеназы |
| RU2180002C2 (ru) * | 1999-08-16 | 2002-02-27 | Пермское научно-производственное объединение "Биомед" | Способ получения коллагеназы |
| WO2013165304A1 (en) * | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Yo Proteins Ab | Methods for modification of tissues |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2781289C1 (ru) * | 2021-04-12 | 2022-10-11 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Способ получения высокоочищенного концентрированного препарата с коллагеназной активностью |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2687973C1 (ru) | 2019-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173681B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ud fra en hyaluronsyreproducerende streptococbakterie | |
| DK202100114Y4 (da) | Separation af 2’-FL fra en fermentationskulturopløsning | |
| KR101317256B1 (ko) | ｐＨ 조작에 의한 스트렙토코커스 뉴모니애폴리사카라이드로부터 오염물질의 분리 | |
| CA1270219A (en) | Ultrapure hyaluronic acid and method of making it | |
| Avery et al. | Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Inductions of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. | |
| CA1224435A (en) | Protein having cell growth stimulating action composition thereof and method for producing the same | |
| JP2017141263A (ja) | 莢膜Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖の生産のための短縮された精製プロセス | |
| KR20170140762A (ko) | 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법 | |
| SU1423002A3 (ru) | Способ получени белка,понижающего содержание холестерина в крови млекопитающих животных | |
| RU2180002C2 (ru) | Способ получения коллагеназы | |
| RU2687973C9 (ru) | Способ получения лекарственного средства коллализин®, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний | |
| RU2174557C1 (ru) | Способ получения гиалуронидазы стрептококковой | |
| RU2322504C1 (ru) | Способ получения генно-инженерного инсулина человека | |
| RU2208637C1 (ru) | Способ получения генно-инженерного инсулина человека | |
| Butler et al. | The action of trypsin on insulin | |
| EA202190638A1 (ru) | Способ получения вакцины гемофильной тип в конъюгированной | |
| WO2020117949A1 (en) | Bacterial growth on non-animal derived media | |
| RU2035914C1 (ru) | Способ получения туберкулина | |
| RU2634408C1 (ru) | Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 | |
| RU2492231C2 (ru) | Способ выделения бактериоцинов | |
| SU727657A1 (ru) | Способ получени -рибулозо5-фосфата | |
| KERR | Inhibition by streptomycin of flagella formation in a true slime mold | |
| RU2230119C1 (ru) | Способ получения дисахарида | |
| EP0295605B1 (en) | Antibody production-stimulating factor derived from human B lymphoblastoid cell and process for producing antibody by using said stimulating factor | |
| RU2224018C2 (ru) | Способ получения биологического стимулятора |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL 14-2019 FOR INID CODE(S) (54) |
|
| TH4A | Reissue of patent specification | ||
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL 14-2019 |