DK173681B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ud fra en hyaluronsyreproducerende streptococbakterie - Google Patents

Description

i DK 173681 B1

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ved dyrkning af en hyaluronsyrepro-ducerende streptococbakterie i et dyrkningsmedium.

5 Hyaluronsyre er et mucopolysaccharid af biologisk.pprin-_ delse. Dets natriumsalt/ natriumhyaluronat/ har i form af en pufret fysiologisk saltvandsopløsning fundet væsentlig anvendelse som vitrøs erstatning ved øjenkirurgi og til andre medicinske anvendelser. Nogle af disse anvendelser 10 er beskrevet i US patenskrifterne nr. 4.141.97,3 og nr. 4.328.803. Til disse medicinske formål er der hidtil blevet benyttet et pyrogenfrit, højtrenset natriumhyaluronat med en molekylvægt på mere end 750.000. Et kommercielt produkt, der kendes under betegnelsen HEALON og fremstil-15 les af Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J., USA, er en 1% opløsning af natriumhyaluronat, som sælges til disse anvendelsesformål. Eksempelvis er fortyndet HEALON-opløs-ning (0,1 - 0,2% natriumhyaluronat) blevet rapporteret at være anvendelig som øjendrypningsmiddel til behandling af 20 patienter med keratitis siccasyndromet.

Hyaluronsyre er også blevet anvendt som ingrediens ved in vitro dyrkning af spedalskhedsbaciller og som bestanddel i kosmetiske formulationer. De kosmetiske formulationer, 25 der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.303.676, omfatter både en lavmolekylvægtig fraktion (ca. 10 - 50.000) og en højmolekylvægtig fraktion (over lxlO15) .

- Hyaluronsyrekilder til alle ovenstående øvende1ser har 30 været hanekamme, humane navlestrenge eller andre hvirveldyrvæv. Ekstraktion og rensning af hyaluronsyre fra så 2 DK 173681 B1 danne væv er en forholdsvis kompliceret proces, som resulterer i et meget dyrt produkt.

Hyaluronsyre kan produceres af gruppe A og C stammer af 5 Streptococcus bakterier. Kjems og Lebech rapporterer i Acta Path. Microbiol. Scand., Section B, 84:162-164 (1976) en anvendelse af det bakterielle produkt som reagens til bestemmelse af anti-streptococ-hyaluronidase i humane seroprøver. I denne artikel beskriver forfatterne 10 et bestemt medium til dyrkning af gruppe A streptococcer og isolering af hyaluronsyre, idet de rapporterer et udbytte på 0,3 g pr. liter dyrkningsvæske. Den af bakterier producerede hyaluronsyre har imidlertid ikke fundet væsentlig anvendelse på grund af, at den er af lav molekyl-15 vægt.

Fra J. of Bacteriology, (feb. 1974), side 652-659 og samme tidsskrift (dec. 1979), side 1090-1097 er det kendt, at anaerobe og CO;-berigede dyrkningsmedier fremmer væk-20 sten og celleproduktionen hos visse streptococstammer.

Fra US patentskrift nr. 2.975.104 kendes der endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ved dyrkning af Streptococcus pyogenes gruppe A og C stammer og 25 oprensning og isolering af den herved af disse bakterier producerede hyaluronsyre. Ved denne fremgangsmåde sker oprensningen og isoleringen af hyaluronsyren efter varme-drab af bakterierne, tilsætning af formalin til dyrkningsvæsken og filtrering af denne ved behandling af fil-30 tratet med kold acetone, adskillelse af de herved opståede to væskefaser ved dekantering af den øverste fase, fortynding af den nederste fase med destilleret vand, DK 173681 B1 3 tilsætning af eddikesyre og kaliumacetat og udhældning i kold 95% ethylalkohol under omrøring, hvorved der udfældes et hvidt præcipitat, som vaskes med absolut ethylalkohol, opløses i destilleret vand og dialyseres mod de-5 stilleret vand. Herved opnås et udbytte af kaliumhyaluro-nat på fra 230 til 400 mg pr. liter dyrkningsvæske.

Opfindelsen tilvejebringer en væsentlig simplere fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ud fra bakte-10 rielle kilder, hvormed der opnås et meget højere udbytte, end det hidtil har været rapporteret. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås der endvidere en lettere adskillelse af bakteriecellerne fra dyrkningsvæsken uden alvorlig sønderdeling af celler og hyaluronsyre, hvilket frem-15 mer opnåelse af hyaluronsyre i et højt udbytte og med en renhed, der er sammenlignelig med eller bedre end en hvilken som helst til medicinske formålsanvendelser hidtil til rådighed værende hyaluronsyre.

20 Dette opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved dyrkning af en hyaluronsyreproducerende streptococbakte-rie, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, a) at dyrkningen sker under anaerobe, CO^-berigede for- 25 hold, at der sættes trichloreddikesyre til dyrk- ningsmediumet, hvorved hyaluronsyreproduktionen standses, hvis dette ikke er sket forinden ved andre foranstaltninger, og at bakteriecellerne adskilles „ fra den resulterende blanding, 30 b) at hyaluronsyren og de dyrkningsmediumbestanddele, der har tilsvarende eller højere molekylvægt, adskil- 4 DK 173681 B1 les fra de øvrige bestanddele i blandingen ved diafiltrering, c) at hyaluronsyren udfældes ved, at blandingen af hya- 5 luronsyren og de øvrige hermed fraskilte dyrkningsme- diumbestanddele sættes til et organisk opløsningsmiddel, hvor tilsætningen sker uden væsentlig omblanding, eller ved at der til blandingen af hyaluronsyre og de øvrige hermed fraskilte dyrkningsmediumbestand- 10 dele sættes et organisk salt, hvor tilsætningen sker, uden væsentlig omblanding og d) at den udfældede hyaluronsyre fraskilles de øvrige dyrkningsmediumbestanddele af tilsvarende eller høje- 15 re molekylvægt, samt eventuelt e) at den isolerede hyaluronsyre yderligere renses ved opløsning af syren i en mildt basisk, pufret opløsning, udfældning af natriumhyaluronat med et blandet 20 alkyltrimethylammoniumbromid, resuspension af præci- pitatet i fortyndet natriumchloridopløsning og genudfældning af dette som syre ved tilsætning af suspensionen til ethanol uden omrøring.

25 Endskønt ved den foreliggende fremgangsmåde fremstillede hyaluronsyre typisk har en middelmolekylvægt på ca.

55.000, har den en potentiel væsentlig anvendelse som øjendrypningsingrediens og som ingrediens i kosmetiske formulationer. Det høje udbytte, den store renhed og den 30 lave pris for den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede hyaluronsyre tillader også, at den anvendes på måder, som ikke hidtil har været beskrevet eller på- 5 DK 173681 B1 tænkt for hyaluronsyre hidrørende fra pattedyr- eller bakteriekilder med lav udbytteevne. Hyaluronsyren kan for eksempel anvendes som befugtningsmiddel i levnedsmiddelprodukter, til andre anvendelser, såsom smøremiddel, og 5 til postkirurgiske anvendelser til nedsættelse af komplikationer på grund af fibroserespons og/eller adhæsionsdannelse. Materialet kan også anvendes ved tertiær olieindvinding som erstatning for polyacrylamid, tilsvarende syntetiske polymerer eller biologisk fremstillede polyme-10 rer.

Dyrkningen af en hyaluronsyreproducerende streptococstam-me under anaerobe forhold i et COc-beriget vækstmedium, som indeholder de råstoffer, der er nødvendige for bakte-15 riernes produktion af hyaluronsyre, udføres fortrinsvis ved fermentering i en væskekultur (eller suppekultur; eng.: broth culture). Andre dyrkningsmetoder og -medier kan anvendes. For eksempel kan der anvendes en agarkultur. Betegnelsen "dyrkningsmedium", som den anvendes 20 heri, skal følgelig forstås bredt som betydende væskeeller faststofmedium eller kombinationer heraf og andre dyrkningstyper ud over fermentering, således som det er velkendt inden for området.

25 Endskønt den foretrukne udførelsesform for opfindelsen går ud på at dyrke bakterierne direkte i det dyrkningsmedium, hvori hyaluronsyren skal frembringes, er det også muligt at dyrke bakterierne i et andet vækstmedium, adskille bakterierne fra dette medium, resuspendere bakte-30 rierne i et pufret suspensionsmedium eller destilleret vand og tilsætte de behørige råstoffer til suspensionen til fremstilling af hyaluronsyren med de allerede dyrkede 6 DK 173681 B1 bakterier. Dette betragtes som en ækvivalent teknik til den foretrukne fremgangsmåde og omfatter blot anvendelsen af en hvilende cellesuspension. Betegnelsen "dyrkning af en kultur", som den anvendes heri, skal følgelig forstås 5 som indbefattende begge udførelsesformer for fremgangsmåden i sit definitionsområde.

I modsætning til ved hidtil kendte fremgangsmåder til fremstilling af hyaluronsyre kan endotoksiner udelukkes 10 fra systemet fra begyndelsen af ved filtrering af alle ingredienser gennem et spærrefilter med en 10.000 (10 K) nominel molekylvægtsgrænse (NMWL), såsom et Millipore® Pellicon® tangentielt kassettestrømningsfiltreringssystem, inden podning og derefter under opretholdelse af 15 pyrogenfrie anaerobe dyrkningsbetingelser.

Ved den foretrukne udførelsesform for den foreliggende opfindelse kan følgende vækstmedium anvendes: 1. Caseinhydrolysat, enzymatisk 20,0 g 2. Kaliumchlorid 3,0 g 3. Natriumphosphat, dibasisk 2,8 g 4. Magnesiumsulfat (7h:0) 0,5 g 5. Calciumchlorid (2H:0) 10,0 g 6. Glucose 20,0 g 7. Vitaminopløsninger: a) d-Biotin 1,0 mg b) D-Calciumpantothenat 1,0 mg c) Cholinchlorid 1,0 mg d) Folinsyre 1,0 mg e) i-Inositol 2,0 mg 7 DK 173681 B1 f) Nikotinamid 1,0 mg g) Pyridoxal, HC1 1,0 mg h) Riboflavin 0,1 mg i) Thiamin, HC1 1,0 mg

Mediet suppleres op til 1 liter med pyrogenfrit vand frembragt ved omvendt osmose. Andre egnede dyrkningsmedier kan naturligvis også anvendes til dette formål.

5 100 ml Af en kultur af Streptococcus pyogenes type 18 dyrkes anaerobt i 6 timer i mediet ved 37 ± 1 °c. De andre hyaluronsyreproducerende bakterier omtalt ovenfor kan benyttes, men type 18 foretrækkes. 5 1 Af samme medium 10 podes med denne 6 timers kultur og dyrkes til en stærkt synlig tæthed, fortrinsvis til mindst 2 x 10* celler pr. ml og typisk til 5 x 108 celler pr. ml. De 5 liter podekultur anvendes derpå til podning af 160 1 medium i en 200 1 fermentor til opstart af et produktionsforløb.

15

Under produktionsforløbet dyrkes kulturen under kontinuerlig omrystning, idet der samtidig indledes COc-gas med en strømningshastighed, der er tilstrækkelig til at opretholde et vist omfang opløst CO;, som bestemt med en 20 CO;-overvågningsføler. Der foretrækkes et omfang opløst CO; på 5-10%. Gassen indledes fortrinsvis som en N;/CO;-blanding. Et forhold på 85/15 foretrækkes, men er ikke kritisk. Gassen sterilfiltreres, efterhånden som den indføres i dyrkningskammeret. Temperaturen reguleres for-25 trinsvis til ca. 37 ± 1 °c. pH Reguleres fortrinsvis til en i alt væsentligt konstant værdi ± 0,1 inden for området fra ca. 6,5 til 7,5 ved overvågning med en pH- 8 DK 173681 B1 føler/regulator og ved tilsætning af KOH, som det kræves ifølge regulatoren. Fermentationen anses for tilendebragt, når kulturens pH holder op med at falde (der kræves ikke mere KOH til at holde pH inden for de fastsatte 5 grænser), eller når celletætheden når en stærkt synlig tæthed, typisk 1-5 x 109 celler pr. ml. På dette punkt afsluttes fermentationen ved tilsætning af en 100% mættet opløsning af vandig trichloreddikesyre til frembringelse af en endelig trichloreddikesyrekoncentration på ca. 5% i 10 fermentationsblandingen. Dette kan variere.

Tilsætningen af trichloreddikesyre til fermentationsvæsken standser ikke blot dyrkningen ved at dræbe bakterierne, men gør også adskillelsen af cellerne fra væsken 15 væsentligt lettere ved at fremme flokkulation af cellerne. Uden trichloreddikesyre er blandingen meget vanskelig at adskille uden at forårsage alvorlig sønderdeling af begge komponenters integritet. Mikroorganismer og poly-saccharid, dvs. hyaluronsyren, adskilles ikke let ved 20 centrifugering eller filtrering uden tilsætning af trich-loreddikesyren. Medens det således er muligt at afslutte kulturens vækst med andre midler, for eksempel ved varmebehandling, har trichloreddikesyrebehandlingen den fordel, at den efterfølgende adskillelse af hyaluronsyren 25 lettes.

Fermentationsblandingen pumpes fra fermentoren gennem en Durapore® filtreringskassette med en 0,22 μιη porestørrelse under anvendelse af ovennævnte Millipore® tangen-30 tielle strømningsfiltreringssystem. Dette trin koncentrerer cellerne fra 160 1 til ca. 51. Filtratet tilbageholdes og diafiltreres mod omvendt osmosevand med en led- 9 DK 173681 B1 ningsevne større end 10 megaohm under anvendelse'-aT'~et"~ nominelt 30.000 molekylvægtsudelukkende Millipore® Pel-licon® kassettesystem, indtil filtratet, der kasseres løbende, når en ledningsevne på ca. 0,5 megaohm. Dia-5 filtrering er en forstærket dialyseteknik, som det er beskrevet i katalog nr. OM029, marts 1981, med titlen Pel-licon® kassettesystem fra Hillipore Corporation, Bedford, Massachusetts 01730, USA, i modsætning til sædvanlig dialyseteknik. Hyaluronsyren koncentreres derpå ved 10 at fortsætte filtreringsprocessen uden yderligere tilførsel af vand.

Koncentratet behandles derpå med ethanol af reagenskvalitet, fortrinsvis i et forhold på 3:1. Andre alkoholer, 15 acetone, chloroform eller andre organiske opløsningsmidler såvel som visse organiske salte, såsom CETAB, et blandet trimethylammoniumbromid, kan anvendes til udfældning af hyaluronsyren eller natriumhyaluronatet fra den vandige opløsning. Dette bør gøres uden anden blanding 20 end den, der indtræder som virkningen af pumpning af hyaluronsyren ind i opløsningsmidlet. Omrøring under alkoholbehandlingen har vist sig at nedsætte fremgangsmådens udbytte af hyaluronsyren. Det udfældede kan på dette trin opbevares ubegrænset i mørke ved 4 °C.

25

Som det ses af den beskrevne procedure, er der opfundet en unik fremgangsmåde til isolering af hyaluronsyre fra dyrkningsvæsken ved en to-trinsproces, ved hvilken der udføres et molekylvægtsseparationstrin ved diafiltrering 30 til adskillelse af syren fra stort set alle komponenter i dyrkningsvæsken med lavere molekylvægt, og derpå adskil- 10 DK 173681 B1 les syren fra den resterende dyrkningsvæskes bestanddele ved udfældning.

Den udfældede hyaluronsyre kan afvandes (fjernelse af ho-5 vedmængden af vand/alkohol-opløsningen) ved et antal sædvanlige metoder og kan derpå resuspenderes i omvendt osmosevand eller en 0,15 M NaCl-opløsning. Det resuspende-rede materiale lyofiliseres (frysetørres) dernæst, sprøjtetørres, vakuumtørres eller diafiltreres til fjernelse 10 af de sidste spor af alkohol. Yderligere rensning udføres ved fremstilling af en 0,05 M boratpufferopløsning, pH

8,0, med en natriumhyaluronatkoncentration på ca. 10 mg/ml. Der sættes derpå 0,32% CETAB til opløsningen, og blandingen omrøres ved 4 °C natten over til frembringelse 15 af et præcipiteret hyaluronat. Andre udfældningsmidler kan anvendes, såsom cetylpyridiumchlorid eller beslægtede salte. Præcipitatet fjernes ved grovfiltrering og resuspenderes i en 1 M NaCl-opløsning fremstillet med omvendt osmosevand. Den resuspenderede hyaluronsyre dia-20 filtreres derefter og koncentreres som ovenfor. Den resulterende hyaluronsyre kan derpå sterilfiltreres og anvendes eller omdannes til natriumhyaluronat og derpå sterilfiltreres og anvendes.

25 Sædvanlig afvandingsteknik indbefatter presning, centrifugering, tilsætning af kemikalier og lignende. Den specielt valgte teknik vil afhænge af den tilsigtede efterfølgende anvendelse af præcipitatet.

30 Hvis der ønskes et pyrogenfrit produkt af medicinsk kvalitetsgrad, anvendes der et pyrogenfrit, filtreret dyrkningsmedium, og alle fremgangsmådens operationer, inklu 11 DK 173681 B1 sive isolering og behandling af hyaluronsyren/natrium-hyaluronatet, udføres under forhold svarende til klasse 100 rent rum under anvendelse af pyrogenfrie beholdere.

Hvis materialet kun skal anvendes til formål af kemisk 5 kvalitetsgrad, er rummets og opsamlingsbeholdernes renhed med hensyn til pyrogener ikke kritisk.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved hvilken der lægges vægt på dyrkning af cellerne under ikke-beluftede for-10 hold, forhindrer streptococcerne i at producere deres normale komplement af slutprodukter, primært de pyrogene exotoksiner, for hvilke mikroben er så velkendt. De beskrevne dyrkningsbetingelser giver også et meget højere udbytte af hyaluronsyre, end det hidtil har været rappor-15 teret. Et minimum på 2 g hyaluronsyre pr. liter dyrk ningsvæske er blevet opnået under anvendelse af de foretrukne celledyrknings- og isoleringsbetingelser, der er beskrevet ovenfor. Det høje udbytte under ikke-beluftede forhold er uventet, eftersom en af de foreslåede funktio-20 ner af hyaluronsyren antages at være den at tilvejebringe en oxygenbarriere for cellen. Dens produktion ville følgelig kun forventes at blive størst mulig under forhold, hvor den udsættes for oxygen.

25 Den/det som beskrevet fremstillede hyaluronsy- re/natriumhyaluronat har en middelmolekylvægt på ca.

55.000 ± 20% inden for et molekylvægtsområde på fra ca.

10.000 - 2.000.000 som bestemt ved gelfiltrering eller ved kvasielastiske lysspredningsmetoder. Disse metoder er 30 velkendte, og det samme gælder variationerne ved bestemmelsen og i de med dem opnåede resultater på grund af biologisk variation. Produktet har også et proteinindhold 12 DK 173681 B1 på mellem 0,3% og 0,03% i afhængighed af analysemetoden. UV-Absorptionerne af en 0,1% opløsning er 0,314 ved 260 nm og 0,169 ved 280 nm. Viskositeten af en 1% opløsning er ca. 300 centistoke.

5

En 0,5 - 1,5% opløsning af pyrogenfrit NaHy fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes som øjendrypningskomposition i stedet for de meget tynde opløsninger af højmolekylvægtig hyaluronsyre hidrørende fra 10 hanekamme, der for tiden anvendes til behandling af keratitis sicca.

Andre hyaluronsyreproducerende streptococcer af gruppe A og gruppe C stammerne kan anvendes ifølge opfindelsen.

15 Yderligere variationer af dyrkningsmediet og dyrkningsbetingelserne såvel som variationer i isoleringsprocedurerne kan foretages.

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ved 5 dyrkning af en hyaluronsyreproducerende streptococbakte- rie i et dyrkningsmedium, kendetegnet ved, a) at dyrkningen sker under anaerobe, CO^-berigede forhold, at der sættes trichloreddikesyre til dyrk-10 ningsmediumet, hvorved hyaluronsyreproduktionen standses, hvis dette ikke er sket forinden ved andre foranstaltninger, og at bakteriecellerne adskilles fra den resulterende blanding, 15 b) at hyaluronsyren og de dyrkningsmediumbestanddele, der har tilsvarende eller højere molekylvægt, adskilles fra de øvrige bestanddele i blandingen ved diafiltrering, 20 c) at hyaluronsyren udfældes ved, at blandingen af hyaluronsyren og de øvrige hermed fraskilte dyrkningsme-diumbestanddele sættes til et organisk opløsningsmiddel, hvor tilsætningen sker uden væsentlig omblan-ding, eller ved at der til blandingen af hyaluronsyre 25 og de øvrige hermed fraskilte dyrkningsmediumbestand dele sættes et organisk salt, hvor tilsætningen sker, uden væsentlig omblanding og d) at den udfældede hyaluronsyre fraskilles de øvrige 30 dyrkningsmediumbestanddele af tilsvarende eller høje re molekylvægt, samt eventuelt DK 173681 B1 e) at den isolerede hyaluronsyre yderligere renses ved opløsning af syren i en mildt basisk, pufret opløsning, udfældning af natriumhyaluronat med et blandet alkyltrimethylammoniumbromid, resuspension af præci-5 pitatet i fortyndet natriumchloridopløsning og genud fældning af dette som syre ved tilsætning af suspensionen til ethanol uden omrøring.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at den hyaluronsyreproducerende streptococbakterie dyrkes i et væskeformigt dyrkningsmedium.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at bakterierne dyrkes til en celletæthed på mere end 15. x 10* celler pr. ml dyrkningsvæske.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, 20 a) at hyaluronsyreproduktionen standses ved tilsætning af trichloreddikesyren, og at bakteriecellerne adskilles fra den resulterende fermentationsvæske ved at pumpe væsken gennem et filtreringssystem, 25 b) at hyaluronsyren og de dyrkningsmediumbestanddele, der har tilsvarende eller højere molekylvægt, adskilles fra de øvrige bestanddele i det i trin (a) opnåede filtrat ved diafiltrering af filtratet, indtil det herved fremkomne filtrat (der kasseres) opnår en 30 forudfastlagt ledningsevne, hvorefter den tilbage holdte hyaluronsyre og dyrkningsmediumbestanddelene med tilsvarende eller højere molekylvægt koncentreres DK 173681 B1 ved fortsættelse af filtreringsprocessen uden yderligere tilførsel af vand, c) at hyaluronsyren udfældes som angivet under trin (c) 5. krav 1, d) at den udfældede hyaluronsyre fraskilles de tilbageværende øvrige dyrkningsmediumbestanddele, afvandes og tørres, og 10 e) at hyaluronsyren yderligere renses ved resuspension, udfældning som natriumhyaluronat og indvinding heraf ved grovfiltrering efterfulgt af resuspension, diafiltrering og genudfældning ved tilsætning af suspen- 15 sionen til ethanol uden omrøring.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den hyaluronsyreproducerende streptococbakterie dyrkes under CO^-berigede, anaerobe forhold på et fast 20 dyrkningsmedium, at der dannes en væskeformig suspension af bakterierne, hyaluronsyre og de medfølgende produkter ved tilsætning af en vandig opløsning af trichloreddike-syre til dyrkningsmediumet eller omvendt, og at hyaluronsyren derefter isoleres og eventuelt renses som angivet 25 under trin (a)-(e) i krav 1 eller 4. 1 Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at der i trin (a) frembringes en slutkoncentration af trichloreddikesyre på 30 5-6%, fortrinsvis ca. 5%. DK 173681 B1

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det organiske opløsningsmiddel eller det organiske salt, der anvendes til udfældning af hyaluronsyren i trin (c), er en alkohol, 5 acetone, chloroform eller CETAB, som er et blandet tri-methyl auction iumbromid.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det organiske opløsningsmiddel er ethanol, og at 10 hyaluronsyreopløsningen tilsættes ethanolen i et blandingsforhold på fortrinsvis 3:1.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at at den hyaluronsy- 15 reproducerende bakterie er Streptococcus pyogenes type 18.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at koncentrationen af 20 opløst CO; holdes på ca. 5-10% under dyrkningen af bakterien .

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, kendetegnet ved, at fermentations- 25 trinnet omfatter, at pH styres til en i alt væsentligt konstant værdi +0,1 inden for området 6,5-7,5 og temperaturen til 37 + 1 °C under hele fermentationen.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 30 1-11, kendetegnet ved, at dyrkningsmediet filtreres gennem et 10.000 molekylvægtsafspærringsfilter inden podning med bakteriekulturen, og at de øvrige trin DK 173681 B1 udføres under forhold svarende til et klasse 100 rent rum under anvendelse af pyrogenfrie beholdere. 5