ITMI20131654A1 - Downstream di purificazione di acido ialuronico da brodi di coltura microbici - Google Patents
Downstream di purificazione di acido ialuronico da brodi di coltura microbiciInfo
- Publication number
- ITMI20131654A1 ITMI20131654A1 IT001654A ITMI20131654A ITMI20131654A1 IT MI20131654 A1 ITMI20131654 A1 IT MI20131654A1 IT 001654 A IT001654 A IT 001654A IT MI20131654 A ITMI20131654 A IT MI20131654A IT MI20131654 A1 ITMI20131654 A1 IT MI20131654A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- solution
- filtration
- precipitation
- precipitate
- filter
- Prior art date
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title description 127
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title description 126
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title description 125
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 18
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 49
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 44
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 39
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 claims description 37
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 29
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 15
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 6
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 6
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 claims description 5
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 claims description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 16
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 13
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 13
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 8
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 7
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 7
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 description 6
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 241000561734 Celosia cristata Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000264435 Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N magnesium orthosilicate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052919 magnesium silicate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000391 magnesium silicate Substances 0.000 description 2
- 235000019792 magnesium silicate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 2
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 229920002943 EPDM rubber Polymers 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010051873 alkaline protease Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000004035 construction material Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- HOOWDPSAHIOHCC-UHFFFAOYSA-N dialuminum tricalcium oxygen(2-) Chemical compound [O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[Al+3].[Al+3].[Ca++].[Ca++].[Ca++] HOOWDPSAHIOHCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000013214 routine measurement Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AISMNBXOJRHCIA-UHFFFAOYSA-N trimethylazanium;bromide Chemical compound Br.CN(C)C AISMNBXOJRHCIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
- C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
Description
Descrizione
“DOWNSTREAM DI PURIFICAZIONE DI ACIDO IALURONICO DA BRODI DI COLTURA MICROBICI”
La presente invenzione ha per oggetto un downstream industriale di purificazione dell’acido ialuronico da brodi di coltura microbici, che consente: elevate rese di recupero dell’acido ialuronico dai brodi; un abbassamento del suo peso molecolare durante il downstream di purificazione inferiore al 10% rispetto al valore iniziale; un grado di purezza e un abbattimento dei pirogeni nel prodotto finito compatibili con l’uso iniettivo.
Definizioni
Con il termine acido ialuronico, in acronimo HA, si intendono complessivamente sia la forma acida del polisaccaride che i suoi sali, detti comunemente anche ialuronani.
Stato della tecnica
L’acido ialuronico (HA) è un polisaccaride a catena lineare, carico negativamente, composto dalla ripetizione di n unità disaccaridiche (-4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-), in cui l’acido D-glucuronico (GlcUA) e la N-acetil-D-glucosammina (GlcNAc), sono legati con legami glicosidici alternati β-1,3 e β-1,4.
L’HA è un polisaccaride altamente solubile in acqua e soluzioni di HA mostrano un comportamento visco-elastico di tipo non-newtoniano. Queste proprietà sono funzioni del peso molecolare (e, quindi, essendo l’HA un polimero lineare, della lunghezza della catena), della concentrazione, della natura del controione e di parametri, come temperatura, pH e forza ionica.
L’HA possiede una serie di proprietà uniche, di seguito riportate, che lo rendono uno dei biomateriali più versatili e interessanti.
Idrofilicità e proprietà reologiche - In soluzione acquosa le molecole di HA intrappolano grandi quantità d’acqua (circa 1000 volte il peso del HA) assumendo la forma di spirali estese stabilizzate dai legami idrogeno tra i gruppi idrossilici lungo la catena. Queste catene si inviluppano tra loro anche a concentrazioni molto basse, per questo, anche soluzioni molto diluite di HA hanno viscosità elevate, ma dipendenti dalla velocità di scorrimento.
Proprietà lubrificanti - Le straordinarie proprietà reologiche delle soluzioni di HA rendono questo composto un candidato ideale come lubrificante in ambito biologico. Questa è, infatti, una delle azioni a cui l’HA assolve negli organismi, dove separa le superfici di differenti tessuti che, grazie alla sua presenza, scivolano le une sulle altre. Le articolazioni del nostro corpo sono un esempio a tutti noto di questo tipo di comportamento.
L’HA è ampiamente diffuso in natura: esso è stato identificato in diversi tessuti molli (liquido sinoviale, pelle, cordone ombelicale, cresta di gallo, umor vitreo dell’occhio) e in cellule procariotiche, dove è strutturato in una capsula mucoide che circonda la cellula.
Nei vertebrati, l’HA ha un’ampia varietà di funzioni: nella pelle garantisce l’idratazione del tessuto; nella cartilagine l’HA si lega a proteoglicani per regolare il contenuto di acqua e ioni, per stabilizzare le proprietà fisiche (viscoelastiche) del tessuto e le interazioni cellula-substrato. Il peso molecolare medio del HA del fluido sinoviale e del cordone ombelicale è 3.000−4.000 KDa.
Le risposte biologiche elicitate dall’HA dipendono fortemente dal peso molecolare delle catene polisaccaridiche, in particolare l’accumulo di HA di basso peso molecolare rappresenta un segnale precoce di alterazione della matrice extracellulare, che attiva risposte di riparo a livello tissutale, mentre la preponderanza di HA ad alto peso molecolare è rappresentativa di una situazione di buona omeostasi.
Per le sue proprietà e funzioni biologiche l’HA ha un elevato valore aggiunto (il suo valore commerciale supera di gran lunga quello degli altri polisaccaridi naturali), con applicazioni che spaziano dal settore medico a quello cosmetico.
In molte di tali applicazioni le prestazioni dipendono dal peso molecolare del HA. Per questo, peso molecolare medio del HA e indice di polidispersione Mw/Mn (misura la larghezza della curva di distribuzione del peso molecolare, dove Mn è il peso molecolare medio numerico, definito come il peso totale di tutte le molecole polimeriche di un campione diviso per il numero totale di molecole, e Mw è il peso molecolare medio ponderale, che tiene conto della diversa massa delle molecole presenti) devono essere i gold standard da considerare nella messa a punto di processi produttivi (Camenisch T.D. et al., American J. Respiratory Cell and Molecular Biology 23, 431-433, 2000).
La produzione industriale di HA è basata su due processi: l’estrazione da materiali biologici di derivazione animale, come umor vitreo bovino e creste di gallo; la produzione per via fermentativa, che impiega differenti tipi di microrganismi (Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis, Streptococcus equisimilis, Pasteurella multocida, etc.) di tipo wild type o ingegnerizzato. L’HA prodotto per via fermentativa ha un peso molecolare in genere minore (1.000-3.000KDa) rispetto a quello estrattivo da fonte animale (fino a 10.000KDa).
Attualmente la strategia fermentativa sta avendo una rapida espansione, perché consente di rispondere a livello industriale in maniera più efficace alla crescente domanda di HA che viene dal mercato. La produzione basata sull’estrazione da fonte animale, invece, tende a scomparire, sia perché molto più costosa, sia perché l’utilizzo a scopi terapeutici di prodotti derivati da una fonte animale incontra una grande opposizione a livello regolatorio per il rischio di infezioni da virus o altri agenti biologici e chimici.
I downstream di purificazione del HA riportati dalla letteratura scientifica e brevettuale prevedono differenti combinazioni di una serie di processi unitari tra i quali i più ricorrenti sono: il trattamento della brodocoltura con tensioattivi anionici per staccare l’HA dalla parete cellulare; la rimozione della biomassa, previa diluizione del brodo di coltura, per centrifugazione o filtrazione su terra filtrante; la digestione con proteasi per degradare idroliticamente la componente proteica contaminante, la precipitazione del HA con solventi organici; la purificazione su carbone attivo, alluminato di magnesio, silicato di magnesio o silice; la precipitazione con sali ammonici quaternari idrofobici, quali bromuro di esadeciltrimetilammonio, CETAB (trimetilammonio bromuro) o CPC (cloruro di cetilpiridinio); processi di membrana, quali la microfiltrazione per sterilizzare e rimuovere microparticolati presenti e la diafiltrazione/ultrafiltrazione per rimuovere contaminanti di basso peso molecolare e solvente; l’essiccamento.
Di seguito si riporta una sintesi non esaustiva dei principali metodi estrattivi del HA da tessuti e da brodi di coltura di microrganismo produttori riportati nella letteratura brevettuale e scientifica, in parte attualmente utilizzati per produrre HA.
La US 4.141.973 descrive un procedimento per purificare HA da tessuti animali come creste di gallo, cordone ombelicale, ecc. che non è appropriato per una produzione di massa, a causa dei costi elevati, dovuti a complicate fasi di purificazione per eliminare contaminanti macromolecolari, come condroitina solfato e altri glicosaminoglicani. Questo procedimento, inoltre, non da garanzie sulla completa eliminazione di contaminanti patogeni, in particolare virus potenzialmente presenti nel materiale biologico utilizzato.
La produzione di HA per via fermentativa, invece, comporta costi di produzione minori, in cui il downstream di purificazione dai brodi di fermentazione rappresenta la componente più importante, in particolare quando è necessario produrre HA altamente purificato per uso medico.
US 4.517.295 descrive un procedimento per purificare l'acido ialuronico che prevede: l’aggiunta di acido tricloroacetico al brodo di coltura di Streptococcus pyogenes per flocculare le cellule; la filtrazione del brodo su un filtro di 0,2 micron, per rimuovere le cellule; la filtrazione su membrana con cut off 30KDa, per rimuovere i contaminanti a basso peso molecolare; la precipitazione del HA con etanolo. Per ottenere un HA con un elevato grado di purezza sono previste le seguenti ulteriori fasi: la solubilizzazione del precipitato in acqua; la precipitazione del HA con CETAB o CPC; la solubilizzazione del precipitato; la sterilizzazione della soluzione per filtrazione. Nonostante la complessità di questo downstream di purificazione l'HA risultante ha un contenuto proteico e un contenuto di acidi nucleici con valori che non sono in linea con gli standard previsti dalla Farmacopea Europea per l’uso farmaceutico.
US 4.782.046 descrive un procedimento che prevede: l’aggiunta alla brodocoltura di Streptococcus equi di 0,01% lauril solfato per rimuovere l'HA legato alla parete cellulare; la precipitazione del HA per aggiunta di bromuro di esadeciltrimetilammonio; la solubilizzazione del precipitato in 2M CaCl2; la rimozione delle cellule per centrifugazione o filtrazione; la precipitazione del HA con etanolo e la sua risolubilizzazione in acqua, questo passaggio è ripetuto tre volte. Anche in questo caso il processo è molto laborioso, prevedendo 27 fasi lavorative, con una resa fermentativa di soli 100-250mg/L e una resa di processo che varia tra il 14 e il 50%.
US 4.784.990 descrive un procedimento di purificazione del HA da brodi di coltura di Streptococcus zooepidemicus caratterizzato dalle seguenti fasi: il brodo di coltura è diluito 3-4 volte con una soluzione di sodio acetato al 3%; il mezzo è filtrato utilizzando 0,5g/L di terra di diatomee per rimuovere le cellule; si precipita l’HA addizionando isopropanolo 1:1 v/v; il precipitato risultante è sciolto e la soluzione è nuovamente precipitata con isopropanolo; il precipitato risultante è nuovamente disciolto e si aggiunge lg/L di carbone; la miscela è filtrata per rimuovere il carbone; si precipita nuovamente con isopropanolo e il precipitato è lavato con isopropanolo ed essiccato. Con questo complesso e dispendioso processo si ottiene un prodotto di grado cosmetico con un contenuto di HA tra 87% e 91% . Per ottenere un HA di grado farmaceutico sono necessari ulteriori passi di purificazione che comprendono: la dissoluzione del HA di grado cosmetico e la sua precipitazione con CPC; la solubilizzazione del precipitato risultante; la precipitazione con isopropanolo del HA; la solubilizzazione del precipitato risultante; la riprecipitazione con CPC; la solubilizzazione del precipitato e il suo passaggio attraverso una colonna di silicato di magnesio; la filtrazione dell’eluato su un filtro da 0,2 micron; una ulteriore precipitazione con isopropanolo; il lavaggio del precipitato con etanolo. Questa metodica estremamente laboriosa impiega ripetutamente come agente precipitante CPC, che comporta lunghi tempi per la risolubilizzazione del precipitato e complesse procedure per la quantitativa rimozione del CPC.
US 5.316.926 descrive un procedimento di purificazione del HA da brodi di coltura di Streptococcus equi (ATCC 39506) caratterizzato dalle seguenti fasi: la coltivazione del microorganismo in un mezzo chimicamente definito, privo di proteine se non quelle rilasciate dal microrganismo; la inattivazione della ialuronidasi extracellulare prodotta dal microrganismo; il mantenimento della coltura nella fase di crescita logaritmica a pH 7-7,2 a 37°C per almeno 24 ore; l’aggiunta di glucosio durante la crescita; la separazione del HA capsulare dalle pareti cellulari incubando la coltura con 0,01% p/p di un tensioattivo anionico solfonato; la precipitazione del HA rilasciato per aggiunta di un sale di ammonio quaternario alifatico; la separazione del HA precipitato e la sua solubilizzazione in una soluzione acquosa di un sale di calcio ad alta molarità; la precipitazione del HA per aggiunta di etanolo o isopropanolo; la ripetizione più volte del ciclo dissoluzione-precipitazione con alcool in presenza di almeno 10g/L di NaCl, facendo passare la soluzione su un filtro di nitrocellulosa; il trattamento ripetuto della soluzione con carbone attivo per rimuovere i pirogeni. Il procedimento descritto è molto complesso e costoso e di difficile industrializzazione.
US 2006127587A1 descrive un procedimento di purificazione del HA caratterizzato dalle seguenti fasi: la diluizione della brodocoltura di un microrganismo che produce HA, fino ad avere una concentrazione di HA tra 0,1 e 0,2% p/v; l’aggiunta di sodio laurilsolfato e formalina per staccare l’HA dalla capsula e disattivare i batteri; la centrifugazione o la filtrazione della sospensione per rimuovere il particolato; l’aggiunta alla soluzione di HA, portata a pH 7,5-8,5, della resina di adsorbimento aromatica SP 207 in quantità da 0,1 a 10% in peso; l’agitazione della sospensione per 3 ore tra 4 e 10° C per adsorbire le endotossine; la rimozione della resina per filtrazione; l’ultrafiltrazione della soluzione di HA; l’aggiunta di NaCl e carbone attivo alla soluzione ultrafiltrata per adsorbire i contaminanti; la rimozione per filtrazione del carbone attivo; l’addizione di NaCl fino a 1M e la filtrazione su filtri da 0,2 micron; la precipitazione con 2-3 volumi di etanolo; ripetuti lavaggi con etanolo al 70%; essiccamento del HA in condizioni sterili. La numerosità e complessità delle fasi e il loro elevato costo rendono questo processo di scarso valore sul piano industriale.
JP-A-63-012.293 descrive un procedimento per rimuovere pirogeni e proteine da soluzioni di HA che impiega resine a scambio anionico di tipo macroreticolare (HPA-25, HPA-75, IRA-900, IRA-904). La metodica prevede le seguenti fasi: la diluizione del brodo di coltura di Streptococcus zooepidemicus con acqua; l’aggiunta di carbone per adsorbire le impurità; la rimozione del carbone per filtrazione; il passaggio del supernatante su una colonna di resina macroreticolare a scambio anionico; l’eluizione con 1M NaCl; la precipitazione del HA con etanolo; il lavaggio con etanolo del precipitato; l’essiccamento del precipitato. Il procedimento proposto non ha valenza industriale perché occorrono 25L di resina a scambio anionico per trattare solo 3L di brodo.
KR 10-0.236.766 descrive un procedimento che prevede le seguenti fasi: l’aggiunta etanolo al brodo di coltura per precipitare l'HA; il lavaggio ripetuto più volte del precipito con etanolo al 65%; la solubilizzazione del precipitato; l’aggiunta di carbone per adsorbire le impurità; la rimozione del carbone per filtrazione; l’aggiunta di alluminato di zinco in polvere per adsorbire le impurità; la rimozione dell’alluminato di zinco per filtrazione; il passaggio della soluzione attraverso una colonna di gel di silice; la filtrazione della soluzione su un filtro 0,2 micron; la precipitazione con etanolo; ripetuti lavaggi con etanolo del precipitato.
KR 10-0.149.793 descrive un procedimento di purificazione caratterizzato dalle seguenti fasi: il trattamento della soluzione di HA recuperata dal brodo con un polimero idrofobo (polietilene, polipropilene, polistirene); l’aggiunta di allumina attivata per rimuovere selettivamente le impurità e l’HA a basso peso molecolare; la precipitazione con un solvente organico; l’essiccamento sotto vuoto del HA precipitato.
JP 2.731.545 descrive un procedimento caratterizzato dalle seguenti fasi: la diluizione del brodo con acqua; la centrifugazione per rimuovere le cellule; l’ultrafiltrazione per ridurre il volume e i contaminanti di basso peso molecolare; la precipitazione del HA con etanolo; l’essiccamento sotto vuoto del precipitato; la solubilizzazione del HA e il trattamento della soluzione in sequenza prima con gel di silice e poi con allumina per rimuovere pirogeni, proteine, acidi nucleici, impurità metalliche, ecc.; la precipitazione con un solvente organico del HA purificato.
JP-A-06-199.656 descrive un procedimento in cui la soluzione contenente HA a pH 6-10 è fatta passare attraverso una membrana per rimuovere i pirogeni e l’HA è recuperato per precipitazione con etanolo.
CN1507704A descrive un procedimento di preparazione di HA da brodi di fermentazione di organismi produttori che prevede le seguenti fasi: la diluizione 1:1v/v del brodo di fermentazione e il suo riscaldamento a 75-80°C; la centrifugazione della soluzione diluita per rimuovere la componente batterica; il trattamento a pH 8,0 con proteinasi alcalina; la precipitazione del HA con un volume di etanolo; il recupero del precipitato per centrifugazione; la solubilizzazione del HA e la sua precipitazione con CPC; il recupero per centrifugazione del precipitato; la sua solubilizzazione in NaCl 0,8M; la precipitazione con 2 volumi di etanolo; il recupero del precipitato per centrifugazione; la sua solubilizzazione in un volume di acqua; l’ultrafiltrazione della soluzione su membrane con cut off 5KDa; l’aggiunta di sodio acetato alla soluzione e la precipitazione con 2 volumi di etanolo; il recupero del precipitato e il lavaggio con etanolo e poi con acetone; l’essiccamento. Il procedimento descritto porta a un HA con un peso molecolare di 1.800KDa, un contenuto proteico del 3% e una resa dichiarata del 98%, non si hanno evidenze del grado di purezza del HA, che per il suo contenuto proteico non è utilizzabile per formulazioni iniettive.
Rangaswamy, V. e Jain, D. (Biotechnol. Letters. 30: 493-496, 2008) descrivono la produzione di HA da brodi di fermentazione di Streptococcus zooepidemicus coltivato in un reattore di 10L che prevede le seguenti fasi: la rimozione delle cellule, dopo diluizione in acqua apirogena (1:1, v/v), mediante centrifugazione ad alta velocità (17.686 g); la precipitazione del HA nel supernatante con 2-propanolo; la solubilizzazione del precipitato in 3% p/v di acetato di sodio; il trattamento su gel di silice; il trattamento su carbone attivo; la microfiltrazione della soluzione di HA; la sua diafiltrazione. L’HA ottenuto con una resa del 65% è dichiarato soddisfare gli standard della Farmacopea Europea.
Kanala J. R. et al. (The Bioscan 6(4) : 601-603, 2011) descrivono la produzione di HA da brodi di fermentazione di Streptococcus zooepidemicus coltivato in un reattore di 22L per 20h che ha dato una resa di 2,3g/L di HA e prevede le seguenti fasi: l’aggiunta di carbone e la rimozione delle cellule e del particolato per centrifugazione; la filtrazione della soluzione di HA su filtri da 0.45µm; la diluizione di 5 volte con acqua apirogena della soluzione filtrata di HA; la diafiltrafiltrazione su membrane da 300 KDa; la concentrazione del retentato; la precipitazione con alcool isopropilico (1:3v/v); l’essiccamento sotto vuoto del precipitato.
In generale tutti i metodi precedentemente riportati implicano complicati processi di trattamento, che rendono elevati i costi di produzione e non sempre garantiscono un’efficiente rimozione di endotossine, proteine, acidi nucleici e altri contaminanti, nel rispetto dei limiti previsti dalla normativa per l’uso farmaceutico del HA.
Pertanto, nonostante la numerosità delle metodiche a oggi sviluppate, è attuale in ambito industriale la ricerca di downstream di purificazione di HA da brodi di coltura di microrganismi produttori di HA, che siano più semplici ed economici e consentano la produzione a livello industriale di HA, in particolare di grado farmaceutico.
Descrizione dell’invenzione
Sorprendentemente è stato trovato che è possibile innovare il processo industriale di produzione di HA con purezza fino al grado farmaceutico, limitando nel numero le fasi del processo, che singolarmente per le loro caratteristiche risultano innovative e migliorative rispetto a quanto oggi noto. La particolare integrazione delle specifiche fasi lavorative si traduce in un importante effetto sinergico, che rende estremamente efficace e competitivo il procedimento sviluppato.
Il processo rivendicato è applicabile in maniera versatile al trattamento di brodi di coltura di microrganismi produttori di HA, quali Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis, Streptococcus equisimilis, Pasteurella multocida, ecc.).
Il processo rivendicato è caratterizzato da 4 distinte fasi: rimozione della biomassa dalla brodocoltura; microfiltrazionediafiltrazione/ultrafiltrazione della soluzione; precipitazione con alcoli in miscela; essiccamento. Di seguito si analizzano le singole fasi che caratterizzano il processo rivendicato.
Rimozione della biomassa dalla brodocoltura – Questa fase del processo prevede la rimozione della biomassa dalla brodocoltura senza effettuare una diluizione della stessa, come invece è previsto nella gran parte dei processi descritti nella letteratura scientifica e brevettuale in precedenza riportata. La diluizione della brodocoltura, necessaria per le filtrazioni convenzionali a causa della elevata viscosità della soluzione, è un elemento negativo da evitare, perché aumenta notevolmente il volume della soluzione da trattare, con un incremento dei costi di impianto e di esercizio. Nel processo rivendicato la diminuzione di viscosità e un contestuale abbattimento delle proteine in soluzione sono ottenuti portando la brodocoltura a un pH compreso tra 4,0 e 5 con acido trifluoroacetico (TFA). La filtrazione su terra costituisce la prima fase del recupero e purificazione di acido ialuronico dal brodo di fermentazione. In particolare, l’obiettivo principale di questa fase è la chiarificazione della brodocoltura allontanando cellule batteriche e aggregati proteici. La rimozione della biomassa e del precipitato proteico è realizzata utilizzando un filtro a piatti orizzontali, tipo Funda, a campana in acciaio AISI 316L, opportunamente termostatato mediante camicia esterna, idoneo alla filtrazione in pressione con scarico automatico del pannello per centrifugazione, dotato di reti metalliche speciali a basso intasamento, sistema idoneo alla filtrazione sia con pre-coating che in assenza di pannello, possibilità inoltre di ottenere processi con lavaggio del pannello e/o con essiccamento dello stesso. Il filtro è collegato a una pompa centrifuga, per l’impaccamento della soluzione contenente la terra filtrante (pre-coat), e a una pompa a lobi, impiegata nel trasferimento della brodocoltura al filtro per il successivo ricircolo della soluzione durante la fase di filtrazione. Il sistema è munito di due manometri per il monitoraggio della pressione in testa alla campana e all’uscita della pompa a lobi. Il mezzo filtrante più efficiente per questo tipo di processo è la Celite High Flow Cell, CLARCEL-Flo (prevalentemente alluminato tricalcico). Con impianti di questo tipo, operando su una scala pilota di 3-5m<3>di fermentato, è possibile processare fino a circa 0,5m<3>/h, produzioni industriali di più ampie dimensioni possono essere realizzati con impianti filtranti sempre di questo tipo ma di scala superiore. La particolare configurazione dei piatti filtranti consente un’alta efficienza di filtrazione, in particolare nella fase finale, definibile "fino all'ultima goccia", e un lavaggio finale della torta filtrante con una piccola quantità di liquido di lavaggio, circa il 10% del volume filtrato. In questo modo i costi sono ridotti e i profitti massimizzati in confronto con altri tipi di sistemi filtranti. Non sono elementi di criticità per questa fase del processo il tipo di microrganismo utilizzato e la concentrazione del HA nel brodo di coltura. Un tale tipo di sistema filtrante può essere azionato sia localmente che da un sistema di controllo centrale. Passaggi tipici durante un ciclo di filtrazione, in genere attivati automaticamente dall’impianto, sono: il riempimento del filtro; il ricircolo pre-filtrazione; la fase di filtrazione; lo svuotamento totale del filtrato; il lavaggio del cake; l’essiccazione del cake; lo scarico del cake; la sanitizzazione dell’impianto per un nuovo ciclo. L’efficienza del processo di filtrazione è legata all’ottimizzazione dei parametri di processo e alla tipologia della terra filtrante utilizzata. Per filtrazioni difficili, come quelle di brodi di fermentazione viscosi di HA, la celite è da preferire.
Processi di membrana - La fase successiva del processo rivendicato è basata su un trattamento integrato con membrane filtranti, per realizzare prima una microfiltrazione del brodo di coltura, filtrato e deproteinizzato, con l’obiettivo di rimuovere cellule microbiche e residui di particolato e, successivamente, una diafiltrazione/ultrafiltrazione per rimuovere i contaminanti a basso peso molecolare e concentrare la soluzione di HA. Un processo di membrana integrato di questo tipo è realizzabile su un impianto con le seguenti caratteristiche: possibilità di operare una filtrazione tangenziale (micro/ultrafiltrazione) mediante cartucce con differenti configurazioni (fibre cave e/o cassette); materiale di costruzione delle membrane costituito da polieteresulfone o materiali affini, con basso adsorbimento di prodotti polisaccaridici e compatibili con le procedure di lavaggio e depirogenazione (NaOH 0.1-0.5 M a 60°C); limite massimo di pressione delle cartucce 2-2.5 bar per quelle di microfiltrazione e 4-4.5 bar per quelle di diafiltrazione/ultrafiltrazione; taglio molecolare delle cartucce di microfiltrazione di 0.2µm, con una superficie filtrante per cartuccia di circa 10m<2>; tagli molecolari delle cartucce di diafiltrazione/ultrafiltrazione tra 30 e 750 kDa, con una superficie filtrante per cartuccia di 20-40m<2>; realizzazione dell’impianto in acciaio inossidabile 316L e/o altri materiali inerti compatibili con produzioni farmaceutiche e le soluzioni per il cleaning degli impianti (NaOH 0.1-0.5 M a 60 °C); rugosità delle superfici interne (Ra) 0.8 o minore; guarnizioni e tenute in EPDM o silicone; connessioni di tipo Tri-Clamp<®>; elettrovalvole a diaframma; pompe di alimentazione a membrana o a lobi rotanti o a pistone, con portate tra 10 e 400L/min; serbatoio di alimentazione a fondo conico o con sezione inferiore a diametro ridotto della capacità di 1-5m<3>, dotato di sensore di livello, di agitatore meccanico con pale di tipo impeller, di camicia esterna per la regolazione della temperatura, con porta di ingresso della linea del ritentato posizionata in prossimità del fondo; sistema dotato di pompa (peristaltica, a lobi o a pistone) a monte del serbatoio di alimentazione in modo da effettuare concentrazioni in fed-batch e diafiltrazioni a volume costante; controllori di pressione, di flusso, di temperatura e di conducibilità sulla linea di alimentazione ritentato e filtrato; valvola di drenaggio localizzata in prossimità del punto più basso dei tubi; punti di prelievo per piccoli volumi localizzati sulla linea di alimentazione, del ritentato e del filtrato; connessione per aria compressa a 0.2-2bar sulla linea del ritentato; sistema certificato con documentazione IQ/OQ e tale da operare in ambiente GMP; sistema automatico dotato di software per il controllo remoto della pompa a monte del serbatoio, per la gestione e il monitoraggio del fattore di concentrazione, del fattore di scambio di diafiltrazione, della portata di ricircolo e TMP, per il monitoraggio delle pressioni di alimentazione, di ritentato e di filtrato, delle portate di alimentazione, ritentato e filtrato, della temperatura e della conducibilità. Con un impianto di questo tipo si ottengono soluzioni di HA fino a 8g/L caratterizzate da una conducibilità < di 20µS/cm e un contenuto di endotossine < di 10EU/mg. Come configurato, questo impianto è scalabile proporzionando tutte le sue componenti a dimensioni di tipo industriale.
Precipitazione del HA con miscele di alcoli - L’HA è recuperato dalla soluzione microfiltrata e diafiltrata/ultrafiltrata per precipitazione con alcoli. In tutti i processi a oggi rivendicati la precipitazione con alcoli è realizzata prevalentemente con etanolo e solo in pochi casi con isopropanolo. Nel processo rivendicato, invece, si impiegano come sistema precipitante propanolo o isopropanolo, a cui si addizionano butanolo o isobutanolo in quantità che non determinano la separazione di fase in presenza di acqua. Questo tipo di miscela precipitante offre due importanti vantaggi rispetto all’esistente: 1) il processo di precipitazione comporta una minore quantità di fase organica per ottenere la completa precipitazione del HA dalla soluzione; 2) si ottiene una drastica riduzione del contenuto di endotossine nel HA precipitato. L’HA precipitato è risolubilizzato in acqua e nuovamente precipitato con la miscela di solventi. Il precipitato è essiccato sotto vuoto.
Di seguito si riportano esempi che meglio descrivono l’invenzione. Esempio 1 – Filtrazione su filtro Funda scala 3m<3>
La diminuzione di viscosità e un contestuale abbattimento delle proteine in soluzione sono ottenuti portando 2,6m<3>di brodocoltura a pH 4,5 con una soluzione acquosa di acido trifluoroacetico (TFA) concentrato (50%p/v). La filtrazione su terra per rimuovere cellule batteriche e aggregati proteici costituisce la prima fase per il recupero e la purificazione del HA dal brodo di fermentazione. Il processo di filtrazione su terra utilizza un filtro a campana tipo Funda in acciaio AISI 316L, opportunamente termostatato mediante camicia esterna, dotato di un sistema di filtrazione a piatti piani, sui quali viene depositata la terra filtrante. Il filtro è collegato a una pompa centrifuga, per l’impaccamento della soluzione contenente la terra filtrante (pre-coat), e a una a lobi, impiegata nel trasferimento della brodocoltura al filtro per il successivo ricircolo della soluzione durante la fase di filtrazione. Il sistema è munito di due manometri per il monitoraggio della pressione in testa alla campana e all’uscita della pompa a lobi.
Come terra filtrante si utilizza terra di diatomee, Celite High Flow Cell, CLARCEL-Flo. Il processo di filtrazione si articola in più fasi: preparazione della soluzione pre-coat (sospensione di quota parte della celite in acqua distillata); impaccamento piatti filtranti (pre-coat); aggiunta di terra filtrante alla brodocoltura; filtrazione della soluzione mediante ricircolo della stessa fino a filtrato limpido.
La formazione del pre-coat prevede l’utilizzo di 1Kg di celite per ogni m<2>di area filtrante. Il sistema di filtrazione è costituito di cinque piatti ciascuno di 1,5 m<2>di superficie, per un’area filtrante totale di 7,5m<2>. Quindi, tenendo conto dei volumi morti, per l’impaccamento si sospendono 8Kg di terra in circa 1m<3>di H2O distillata.
La sospensione, mantenuta sotto continua agitazione, è pompata nel corpo di filtrazione mediante una pompa centrifuga, per depositarsi uniformemente sugli elementi filtranti. Inizialmente, quindi, restano aperte solo le valvole della linea di inlet alla pompa (centrifuga) e quella del ricircolo (tutto pieno). Dopo circa 30min il volume della campana è pieno; si lascia la soluzione a ricircolo per circa 15min e si passa alla fase di impaccamento dei piatti con chiusura della linea di ricircolo e apertura della linea del permeato, contemporaneamente e lentamente, per evitare la formazione di una contropressione all’interno del sistema. L’intera operazione richiede circa 1h e si effettua alla temperatura di 25°C.
Alla sospensione cellulare acidificata a pH 4.0 con TFA si aggiungono sotto energica e costante agitazione 45Kg di terra filtrante/m<3>brodocoltura. La filtrazione della sospensione è realizzata collegando il serbatoio contenente la sospensione da trattare alla linea di inlet del filtro Funda, attivando la fase di filtrazione one-through, realizzata con una pressione interna al filtro di circa 4bar. Dopo la prima fase di filtrazione one-through si utilizza acqua di spostamento per recuperare il prodotto residente nella campana, si utilizzano 600-800L di H2O di spostamento ogni 3 m<3>di brodo recuperandone circa 300L come soluzione di HA da unire al brodo filtrato. Da questo trattamento si ottengono circa 2,8m<3>di un surnatante chiarificato e deproteneizzato, con un OD600abbattuta di circa 150 volte, un contenuto proteico inferiore di 100 volte rispetto all’iniziale e una concentrazione di HA di 5-6g/L.
Esempio 2 – Microfiltrazione-diafiltrazione/ultrafiltrazione
Il processo di microfiltrazione-diafiltrazione/ultrafiltrazione è realizzato su un impianto integrato in grado di operare in maniera sequenziale e automatizzabile i due tipi di processo, la microfiltrazione e la diafiltrazione/ultrafiltrazione dei brodi di fermentazione contenenti HA, sottoposti a filtrazione mediante filtro Funda. L’impianto utilizzato è dimensionato su un trattamento di scala pilota che non eccede i 5m<3>batch. L’impianto, che opera in condizioni di filtrazione tangenziale è equipaggiato con cartucce a cassetta di polieteresulfone, caratterizzate da un basso adsorbimento di prodotti polisaccaridici e compatibili con le drastiche condizioni previste per le procedure di lavaggio e depirogenazione (NaOH 0.1-0.5 M a 60°C) degli impianti. Il processo di microfiltrazione, realizzato a una pressione non superiore a 2bar utilizzando cartucce con un cut-off di 0.2µm e una superficie filtrante per cartuccia di circa 10m<2>, è caratterizzato da un flusso trans-membrana compreso tra 20-100 L/m<2>×h. Il microfiltrato limpido è sottoposto a diafiltrazione con acqua ultrapura (HPW) e poi a ultrafiltrazione per rimuovere i contaminanti a basso peso molecolare e concentrare la soluzione di HA, operando a una pressione non superiore a 4bar su cartucce in polieteresulfone da 100KDa, con una superficie filtrante per cartuccia di 20m<2>. Il processo sviluppato consente di processare 3m<3>in circa 6-8h, con recuperi di HA superiori a 80%, con una concentrazione finale del HA in soluzione di circa 5-7g/L e un contenuto di endotossine in EU/mg di 1-10.
Esempio 3 – Precipitazione con differenti miscele solvente
Le varie sperimentazioni sono state effettuate utilizzando una soluzione di HA (Mw circa 1400kDa) 0.51% p/p, in NaCl 0.125M (13mS/cm) a cui si addiziona sotto agitazione la fase organica, fino a completa precipitazione del HA. Il precipitato è raccolto per centrifugazione, lavato con etanolo e essiccato sotto vuoto a 40°C fino a peso costante. Sul prodotto essiccato è effettuata la determinazione del contenuto in endotossine secondo l’European Pharmacopoeia 5.0 (rif. 2.6.14), utilizzando fiale monouso con sensibilità da 0.03 e 0.25EU/mL e lo strumento Endosafe – PTS (Charles River Endosafe). Le misure di routine sono effettuate con il Gel Clot secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione 0,5g/L di HA; si effettuano diluizioni seriali partendo dalla soluzione iniziale, diluendo il campione a seconda del contenuto endotossico; si aliquotano 200µL di campione in ciascuna fiala; il controllo positivo è rappresentato da Control STD Endotoxin, mentre il controllo negativo dall’acqua LAL; si incubano le fiale a 37°C per 60min; si legge il risultato capovolgendo le fiale, il risultato si considera positivo se si forma un gel compatto, negativo se il gel non si forma. Valutazioni del contenuto di endotossine più accurate sono ottenute utilizzando il sistema Endosafe – PTS, in questo caso i risultati sono forniti automaticamente dall’apparecchio in circa 15min.
In tabella 1 sono riportate le risultanze sperimentali. I dati dimostrano che aumentando la lipofilicità della fase organica precipitante si ha una importante riduzione del rapporto volumetrico tra soluzione di HA e volume di fase organica necessario per una precipitazione quantitativa del HA. Inoltre l’impiego di alcoli a più alto peso molecolare, come il n-propanolo e l’isopropanolo in miscela con il n-butanolo e l’iso-butanolo determina una importante riduzione del contenuto di endotossine, che rende il processo di precipitazione sviluppato uno stadio sufficiente per raggiungere un grado di purezza del HA compatibile con il grado farmaceutico iniettivo.
Fase R* R** pH° Endotossine Fattore di organica EU/mg di HA°° purificazione°* n-p 100 1/1,20 pH 7 >0,2 <40
n-p 100 1/1,16 pH 4 >0,2 <40
iso-p 100 1/1,20 pH 7 >0,2 <40
iso-p 100 1/1,20 pH 4 >0,2 <40
Et 100 1/2,00 pH 7 >2 <4
Et/n-p 68/32 1/1,80 pH 7 >1,5 <5,3
Et/n-p 50/50 1/1.44 pH 7 >1,5 <5,3
Et/iso-p 68/32 1/1,72 pH 7 >1,5 <5,3
Et/iso-p 50/50 1/1,32 pH 7 >1,5 <5,3
Et/n-b 80/20 1/1,96 pH 7 >1,5 <5,3
Et/n-b 68/32 1/1,50 pH 7 >1,5 <5,3
Et/iso-b 68/32 1/1,47 pH 7 >1,5 <5,3
Et/iso-b 60/40 1/1,67 pH 7 >1,5 <5,3
n-p/n-b 75/25 1/1,20 pH 7 <0,05 >160
n-p/n-b 70/30 1/1,20 pH 7 <0,05 >160
R* = %v/v dei componenti della fase organica precipitante (iso-p, isopropanolo; n-p, n-propanolo; iso-b, iso-butanolo; n-b, n-butanolo; Et, etanolo);
R** = rapporto in volume tra soluzione acquosa di HA e fase organica precipitante per avere una precipitazione quantitativa del HA;
pH° = della soluzione di HA da precipitare;
°° = contenuto di endotossine in EU/mg di HA secco; il contenuto di endotossine prima della precipitazione è di 8EU/mg;
°* = EU/mg di HA precipitato/EU/mg di HA prima della precipitazione.
Tabella 1 – Alla soluzione di HA (Mw circa 1400KDa) 0.51% p/p, in NaCl 0.125M (13mS/cm) si addiziona sotto agitazione la fase organica, fino a completa precipitazione del HA (in tutti i casi si ha una resa del 100%). Il precipitato è raccolto per centrifugazione, lavato con etanolo ed essiccato sotto vuoto a 40°C fino a peso costante. Sul prodotto essiccato è effettuata la determinazione del contenuto in endotossine.
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per preparare HA di grado farmaceutico iniettivo da brodi di fermentazione di microrganismi produttori di HA che prevede: la rimozione della biomassa per filtrazione su terra filtrante dei brodi portati a pH acido; un processo di microfiltrazione seguito da uno di diafiltrazione/ultrafiltrazione per la rimozione dei contaminanti a basso peso molecolare e la concentrazione dell’HA in soluzione; la precipitazione del HA con una miscela di alcoli monofunzionali a 3 e 4 atomi di carbonio; il lavaggio del precipitato con un non solvente per l’HA; l’essiccamento del precipitato.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il fermentato è acidificato a pH 4-5 con acido trifluoroacetico.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il fermentato acidificato è filtrato su un filtro Funda, utilizzando celite come terra filtrante.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la microfiltrazione è condotta su membrane di polieteresulfone con cut-off 0,2µm e la diafiltrazione/ultrafiltrazione è realizzata su membrane di polieteresulfone/polipropilene con cut off 100KDa.
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la soluzione ultrafiltrata di HA è precipitata con miscele propanolo/butanolo, n- o iso-, nelle quattro combinazioni possibili, in rapporti da 99:1 a 50:50v/v. Milano, 7 ottobre 2013
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT001654A ITMI20131654A1 (it) | 2013-10-07 | 2013-10-07 | Downstream di purificazione di acido ialuronico da brodi di coltura microbici |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT001654A ITMI20131654A1 (it) | 2013-10-07 | 2013-10-07 | Downstream di purificazione di acido ialuronico da brodi di coltura microbici |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI20131654A1 true ITMI20131654A1 (it) | 2015-04-08 |
Family
ID=49585532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT001654A ITMI20131654A1 (it) | 2013-10-07 | 2013-10-07 | Downstream di purificazione di acido ialuronico da brodi di coltura microbici |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITMI20131654A1 (it) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4517295A (en) * | 1983-02-18 | 1985-05-14 | Diagnostic, Inc. | Hyaluronic acid from bacterial culture |
| EP0244757A2 (en) * | 1986-05-01 | 1987-11-11 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor as well as cosmetic composition containing hyaluronic acid |
| US4784990A (en) * | 1985-01-18 | 1988-11-15 | Bio-Technology General Corporation | High molecular weight sodium hyaluronate |
| WO1992008799A1 (en) * | 1990-11-07 | 1992-05-29 | Fermentech Medical Limited | Production of hyaluronic acid |
| WO2008062998A1 (en) * | 2006-11-23 | 2008-05-29 | Lg Life Sciences Ltd. | Method for purifying hyaluronic acid |
-
2013
- 2013-10-07 IT IT001654A patent/ITMI20131654A1/it unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4517295A (en) * | 1983-02-18 | 1985-05-14 | Diagnostic, Inc. | Hyaluronic acid from bacterial culture |
| US4784990A (en) * | 1985-01-18 | 1988-11-15 | Bio-Technology General Corporation | High molecular weight sodium hyaluronate |
| EP0244757A2 (en) * | 1986-05-01 | 1987-11-11 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor as well as cosmetic composition containing hyaluronic acid |
| WO1992008799A1 (en) * | 1990-11-07 | 1992-05-29 | Fermentech Medical Limited | Production of hyaluronic acid |
| WO2008062998A1 (en) * | 2006-11-23 | 2008-05-29 | Lg Life Sciences Ltd. | Method for purifying hyaluronic acid |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHIARA SCHIRALDI ET AL: "Chapter 20: Biotechnological production and application of hyaluronan", 1 September 2010, BIOPOLYMERS, SCIYO, PAGE(S) 387 - 412, ISBN: 978-953-307-109-1, XP002692233 * |
| CHIARA SCHIRALDI ET AL: "Hyaluronic acid degradation during initial steps of downstream processing", BIOCATALYSIS AND BIOTRANSFORMATION, HARWOOD ACADEMIC PUBL., BASEL, CH, vol. 28, no. 1, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 83 - 89, XP008160269, ISSN: 1024-2422, DOI: 10.3109/10242420903408344 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3655138B1 (en) | Process for the purification of hyaluronic acid | |
| AU2017304290B2 (en) | Process for the preparation and purification of the sodium salt of hyaluronic acid | |
| US11155569B2 (en) | Method of degrading polysaccharide using ozone | |
| WO2008062998A1 (en) | Method for purifying hyaluronic acid | |
| CN102712942B (zh) | K5肝素前体的发酵和纯化 | |
| US6660853B2 (en) | Method for purifying high molecular weight hyaluronic acid | |
| KR101638662B1 (ko) | 히알루론산 및／또는 그의 염의 정제 방법 | |
| TW201306846A (zh) | 製備軟骨素硫酸鈉的方法 | |
| CN103319627A (zh) | 一种对透明质酸钠进行分子量分级的方法 | |
| ITMI20131654A1 (it) | Downstream di purificazione di acido ialuronico da brodi di coltura microbici | |
| CN104014276B (zh) | 一种用于长链高分子生物材料的沉淀造粒设备 | |
| CN115785301B (zh) | 一种去除超低分子量透明质酸钠中内毒素的方法 | |
| CN114585652B (zh) | 在有机溶剂中进行的透明质酸钠盐纯化方法 |