CN115785301B - 一种去除超低分子量透明质酸钠中内毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去除超低分子量透明质酸钠中内毒素的方法，属于生物化工技术领域。本发明公开了一种去除超低分子量透明质酸钠中内毒素的方法，包括以下步骤：(1)直接用水室温溶解平均分子量低于10KDa的超低分子量透明质酸钠，配制得到澄清透明的超低分子量透明质酸钠水溶液；(2)使用含有超滤膜包的超滤系统处理步骤(1)得到的超低分子量透明质酸钠溶液，收集透出液；其中超滤膜包的截留分子量为超低分子量透明质酸钠平均分子量的约2～5倍；(3)得到内毒素含量低于0.005EU/mg的超低分子量透明质酸钠纯品。本发明步骤少，操作简单，处理量大；所用溶剂不涉及有机溶液，不产生废液，环保；有利于工业化大规模生产，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种去除超低分子量透明质酸钠中内毒素的方法，属于生物技术领域。
背景技术
透明质酸(钠)又名玻尿酸、玻璃酸，是一种酸性粘多糖，由D-葡萄糖醛酸以及N-乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位构成的大型多糖类。其大量存在于生物体内的许多组织，例如皮下组织、眼球、关节等。与其他多糖类相比较，透明质酸不含硫，其分子能携带500倍以上的水分，是当今公认的最佳保湿成分，广泛应用于化妆品、保健品、食品、医疗美容和医药等领域中。
透明质酸根据分子量的不同可以分为多种类型：分子量大于1000KDa的为高分子量透明质酸钠，分子量介于100KDa到1000KDa的为中等分子量透明质酸钠，分子量在10～100KDa的为低分子量透明质酸钠，分子量小于10KDa的为超低分子量透明质酸钠或寡聚透明质酸钠。其中超低分子量透明质酸钠渗透性强，可以深入真皮内部，长久保湿。同时可有效消除紫外线照射诱导的活性氧自由基(ROS)，增强细胞抗氧化能力，提升肌肤对紫外线的防御力，进而减少皱纹，抗衰老。
透明质酸钠的细菌内毒素主要来源于产品生产过程中使用物料以及环境中可能引入的革兰氏阴性菌，菌体自溶或被裂解时产生细菌内毒素。目前利用微生物培养酶解纯化得到的透明质酸钠粗品中含有大量对人体有危害的内毒素，虽然其毒性比较弱，但仍然可以引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等不良反应。为了保证使用上的安全性，需要严格控制去除内毒素，以达到化妆品、保健品、食品、医疗美容和医药等领域中内毒素含量标准。国家药品标准中规定，透明质酸钠中含内毒素的量：眼内注射用应小于0.5EU/mg，关节内注射用应小于0.05EU/mg。目前行业内的内毒素水平普遍按照药典标准控制在小于0.05EU/mg。
目前高分子量或中等分子量透明质酸钠基本通过醇沉工艺去除内毒素，高分子量或中等分子量透明质酸钠加水后形成透明胶状，流动相极差，并不适合采用超滤工艺去除内毒素。如工艺中有涉及超滤工艺，基本都是采用超滤膜用来浓缩反应液、脱盐或分离目的，并非是去除内毒素作用。超低分子量透明质酸钠，因为分子量低，吸水性极强，溶解度极高，甚至低浓度溶液可以溶于无水乙醇，并不适合采用醇沉工艺去除内毒素。
而去除平均分子量低于10KDa的超低分子量透明质酸钠中内毒素的文献报道较少，因此对于平均分子量低于10KDa的超低分子量透明质酸钠中的内毒素控制是一个技术难点。中国专利CN201910785756.4公开了一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，此法先用氢氧化钠和氯化钠与寡聚透明质酸钠共处理搅拌，再用乙醇醇沉干燥得到内毒素小于0.05EU/mg的样品。该法采用了有机溶剂乙醇和强碱氢氧化钠，存在较大的危险性，有机溶剂废液处理麻烦，成本较高，单次处理量少，生产周期长等问题。
因此有必要开发一种新的制备方法来控制超低分子量透明质酸钠中的内毒素含量在较低范围内。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种安全、简单、成本低、处理量大的方法来去除平均分子量低于10KDa的超低分子量透明质酸钠中的内毒素。
为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种去除超低分子量透明质酸钠中内毒素的方法，包括以下步骤：
(1)直接用水室温溶解平均分子量低于10KDa的超低分子量透明质酸钠，配置得到澄清透明的超低分子量透明质酸钠水溶液；
(2)使用含有超滤膜包的超滤系统处理步骤(1)得到的超低分子量透明质酸钠溶液，收集透出液；其中超滤膜包的截留分子量为超低分子量透明质酸钠平均分子量的约2～5倍；
(3)得到内毒素含量低于0.005EU/mg的超低分子量透明质酸钠纯品。
内毒素又叫脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，位于细胞壁最外层，覆盖在细胞壁的黏肽上，内毒素一般是细菌死亡溶解或人工破坏细菌细胞之后才能释放出来，其毒性成份主要为类脂A，分子量约为10～100KDa，也可能发生聚合形成分子量高达几百KDa～上千KDa的聚合物。
作为本发明的一种实施方式，超滤膜包的截留分子量为超低分子量透明质酸钠平均分子量的2～5倍中的任何数，如2.5倍、3倍、3.5倍、4.0倍或4.5倍。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中超低分子量透明质酸钠的平均分子量约为0.4～10KDa，例如约0.9KDa以上、约1KDa以上、约2KDa以上、约3KDa以上、约4KDa以上，或约9KDa以下、约8KDa以下、约7KDa以下、约6KDa以下、约5KDa以下；优选约为0.8～5KDa，进一步优选约为0.8～1.2KDa；所述超滤膜包的截留分子量约为3～20KDa，如5KDa，10KDa，15KDa，20KDa，25KDa，优选约为3～15KDa，进一步优选约为3KDa。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中得到的超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度约为5～200g/L，在该范围内，其浓度越高，内毒素截留效果越好。当超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度低于5g/L时，有部分超低分子量透明质酸钠截留在超滤膜包中，导致超低分子量透明质酸钠的质量损失；同时导致透出液浓度太低，后期的浓缩工作量加大。当超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度超过200g/L时，在水溶液中超低分子量透明质酸钠会发生聚集，反而导致超低分子量透明质酸钠透出率变低，从而影响产品收率。超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度优选约为100～120g/L。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中的水为超纯水，不会引入新的内毒素或其它杂质。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中的超滤系统的压强约为0.02～0.1MPa，流量约为10～200ml/min。当压强低于0.02MPa时，导致透出液中超低分子量透明质酸钠浓度太低，大部分为水，后期超低分子量透明质酸钠的浓缩工作量加大。当压强高于0.1MPa时，会直接导致超滤膜包使用寿命大大缩短。优选压强为0.05MPa，流量为80ml/min。作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中的超滤次数为1次或1次以上。
作为本发明的一种实施方式，包括以下步骤：
(1)直接用水溶解平均分子量约为0.8～1.2KDa的超低分子量透明质酸钠，配置得到澄清透明的超低分子量透明质酸钠水溶液；
(2)使用含有截留分子量约为3KDa的超滤膜包的超滤系统处理步骤(1)得到的超低分子量透明质酸钠溶液，收集透出液；
(3)得到内毒素含量低于0.005EU/mg的超低分子量透明质酸钠纯品。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中得到的超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度约为100～120g/L。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中的超滤系统的压强为0.05MPa，流量为80ml/min。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中的超滤次数为1次或1次以上。
本文中所用的术语“约”表示所示例数值的±10％。例如，对于超低分子量透明质酸钠的平均分子量是如下的范围时，平均分子量低于约10KDa，约为0.4～10KDa，例如约0.9KDa以上、约1KDa以上、约2KDa以上、约3KDa以上、约4KDa以上，或约9KDa以下、约8KDa以下、约7KDa以下、约6KDa以下、约5KDa以下；或约为0.8～5KDa，约为0.8～1.2KDa，将被理解成对应上述范围的±10％。即超低分子量透明质酸钠的平均分子量约为0.4～10KDa，可以是如下的范围：0.4±0.4x10％～10±10x10％ KDa，即0.36～11KDa。
作为本发明的一种实施方式，进一步包括以下步骤：将步骤(3)得到的超低分子量透明质酸钠纯品经过冻干或喷雾干燥处理。
本发明相对现有技术，具有以下优势：
1.本发明避免了有机溶剂和强碱溶剂的使用，安全性更高，且不产生废液，更加环保。
2.本发明通过筛选合适截留分子量的超滤膜包，尤其是3～20KDa的超滤膜包，能够有效去除平均分子量低于10KDa的超低分子量透明质酸钠中的内毒素，使内毒素含量严格且稳定控制在＜0.005EU/mg，是中国药典最高标准的1/10，且蛋白质含量也稳定控制在＜0.005％，因此提供的产品质量和安全性更高，处于行业领先水平，能够满足辅料级、化妆品级、医药级、滴眼液级、注射级超低分子量透明质酸钠的需求。
3.本发明提供的方法采用水溶解原料，直接采用超滤膜包一次处理，工艺简单，生产周期短，显著降低生产成本，且可连续处理，处理量大，有利于工业化大规模生产，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中实施例和对比例中所用的平均分子量为0.4～10KDa的超低分子量透明质酸钠原料粉末采购自南京乐韬生物科技有限公司。3～20KDa的超滤膜包采购于密理博中国有限公司。
本发明所述内毒素的检测方法：采用《中国药典》1143通则-方法2：光度测定法-显色基质法-动态显色法进行内毒素检查。检测限度为0.005EU/mg，当内毒素含量低于0.005EU/mg或超过5EU/mL，则检测不出。
本发明所述蛋白含量的检测方法：蛋白质含量通过《中国药典》2015版0731第五法考马斯亮蓝法测定。
实施例1
取50g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液，将截留分子量为3KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.002％。
实施例2
取36g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于300ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为120g/L的溶液，将截留分子量为3KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.003％。
实施例3
取50g平均分子量为0.8KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；将截留分子量为3KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.002％。
实施例4
取50g平均分子量为1.2KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；将截留分子量为3KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.002％。
实施例5
取50g平均分子量为3KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；将截留分子量为8KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.003％。
实施例6
取50g平均分子量为5KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；将截留分子量为10KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.002％。
实施例7
取50g平均分子量为10KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；将截留分子量为20KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.002％。
实施例8
取50g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；将截留分子量为3KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.02MPa，流量控制在10ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.002％。
实施例9
取50g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；将截留分子量为3KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.1MPa，流量控制在200ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.003％。
实施例10
取50g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液，将截留分子量为2KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.001％。
实施例11
取50g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液，将截留分子量为5KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为小于0.005EU/mg，蛋白含量为0.004％。
对比例1
采用专利CN201910785756.4公开的方法，取50g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)溶于500ml超纯水中，充分搅拌至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液；分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为0.5％，氯化钠最终浓度为5％，室温搅拌8小时；用适量冰醋酸调溶液pH至中性；加入7倍体积95％乙醇，发现没有沉淀产生，即使在无水乙醇中也很难完全沉降下来，只形成浑浊液体。分析主要原因是超低分子量透明质酸钠的溶解度很高，该工艺无法实现超低分子量透明质酸钠的醇沉。
对比例2
取50g平均分子量为1KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液，将截留分子量为1KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。发现超滤效果不佳，透出液中几乎为水，透出液中超低分子量透明质酸钠浓度极低，大部分残留在截留液中，严重影响收率。
对比例3
取50g平均分子量为3KDa的超低分子量透明质酸钠粉末(内毒素含量＞5EU/mg，蛋白含量0.005％)在常温下溶于500ml超纯水中，充分搅拌10min至溶液澄清透明，配置成浓度为100g/L的溶液，将截留分子量为30KDa的超滤膜包安装于超滤系统中，通过蠕动泵将溶液泵入超滤系统，超滤一次，截留液出口压强控制在0.05MPa，流量控制在80ml/min；收集透出液。检测透出液中的内毒素含量为4EU/mg，严重超标。
将上述实施例1～9和对比例1～3所得超低分子量透明质酸钠去除内毒素数据汇总，结果如下表1所示：
表1
通过表1的实验结果发现，当超滤膜包的截留分子量为超低分子量透明质酸钠平均分子量的2～5倍时，均能实现内毒素含量小于0.005EU/mg的指标要求。当超滤膜包的截留分子量为超低分子量透明质酸钠平均分子量的1倍时，发现超滤效果不佳，透出液中几乎为水，透出液中超低分子量透明质酸钠浓度极低，大部分残留在截留液中，严重影响收率。当超滤膜包的截留分子量为超低分子量透明质酸钠平均分子量的10倍时，发现透出液中的内毒素含量为4EU/mg，严重超标，且蛋白质含量没有发生变化。
Claims (11)
1.一种去除超低分子量透明质酸钠中内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)直接用水溶解平均分子量为0.4～10KDa的超低分子量透明质酸钠，所述超低分子量透明质酸钠的内毒素含量＞5EU/mg，配置得到澄清透明的超低分子量透明质酸钠水溶液；
(2)使用含有超滤膜包的超滤系统处理步骤(1)得到的超低分子量透明质酸钠溶液，收集透出液；所述超滤系统的压强为0.02～0.1MPa，流量为10～200ml/min；其中超滤膜包的截留分子量为超低分子量透明质酸钠平均分子量的2～5倍；
(3)得到内毒素含量低于0.005EU/mg的超低分子量透明质酸钠纯品；
所述超滤膜包的截留分子量为3～20KDa，所述步骤(1)中得到的超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度为5～200g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中超低分子量透明质酸钠的平均分子量为0.8～5KDa；所述超滤膜包的截留分子量为3～15KDa。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中超低分子量透明质酸钠的平均分子量为0.8～1.2KDa；所述超滤膜包的截留分子量为3KDa。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中得到的超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度为100～120g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的超滤系统的压强为0.05MPa，流量为80ml/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的水为超纯水，步骤(2)中的超滤次数为1次以上。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)直接用水溶解平均分子量为0.8～1.2KDa的超低分子量透明质酸钠，配置得到澄清透明的超低分子量透明质酸钠水溶液；
(2)使用含有截留分子量为3KDa的超滤膜包的超滤系统处理步骤(1)得到的超低分子量透明质酸钠溶液，收集透出液；
(3)得到内毒素含量低于0.005EU/mg的超低分子量透明质酸钠纯品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中得到的超低分子量透明质酸钠水溶液的浓度为100～120g/L。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的超滤系统的压强为0.05MPa，流量为80ml/min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的超滤次数为1次以上。
11.根据权利要求1～6或8任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：将步骤(3)得到的超低分子量透明质酸钠纯品经过冻干或喷雾干燥处理。
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