CN105837705A

CN105837705A - 一种去除透明质酸中热源的方法

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Publication number: CN105837705A
Application number: CN201610139266.3A
Authority: CN
Inventors: 冯翠军; 杨君奎
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2016-08-10

Abstract

本发明提供了一种去除透明质酸中热源的方法，该方法先后结合层析、超滤和普通过滤，符合多糖纯化的工艺流程，在有效去除热源的同时实现多糖的纯化，且不影响多糖自身性质。此外，本发明通过对过滤模式、过滤压力、膜孔径等条件的优化设计，简化了操作步骤和操作时间，从而降低了生产成本、提升处理量，利用本发明方法可将热源含量降低至医疗要求范围内，并且在去除热源的同时不影响制品本身的性质，适合规模化生产应用。

Description

一种去除透明质酸中热源的方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种去除透明质酸中热源的方法。

背景技术

透明质酸是具有较高临床价值的生化药物，广泛应用于各类眼科手术，还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。

透明质酸(HA)是构成关节软骨和滑液的主要成分，当发生骨性关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)以及其他感染性和非感染性关节疾病时，HA在关节内的产生代谢发生异常，滑液中HA的浓度和相对分子质量(Mr)明显降低，软骨发生降解和破坏导致关节生理功能障碍。透明质酸具有黏弹性，对于骨关节维持良好生理功能是至关重要的。

热源是革兰氏阴性菌菌体中存在的毒性物质的总称，此类物质由菌体裂解后释放，又称为“内毒素”。热源耐热性较强，在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。与外毒素不同之处在于：热源不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素。少量热源即可引起机体发热，严重的可引起微循环障碍、热源休克及播散性血管内凝血等。

现有技术中针对热源主要的去除方法包括，活性炭吸附法、化学降解法、层析法、相分离法以及超滤法。其中活性炭吸附法是一种应用较早的去热源方法。但活性炭对各类不同成分的吸附作用研究尚不清楚，在吸附热源的同时会吸附部分有效成分。化学降解法是以强酸、强碱或氧化物等使热源降解的方法。这种方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，该方法的使用需结合产品的理化性质，透明质酸等产品不适用。层析法包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等。层析法选择性差，由于热源在高盐溶液中容易形成聚集体，往往需要多种不同的层析方法相结合才能达到去除热源的目的，而这将需要耗费大量时间。相分离法虽然操作简单快速，但处理量小，并且中间有低温到高温的温度变化，这对不稳定的透明质酸极为不利。此外，后续抽提试剂的去除也是一个问题。超滤是以压力差为推动力的膜分离过程，可广泛用于微粒的脱除，其中包括细菌、病毒、热原和其他异物的去除。在此情况下，如何开发一种高效的热源去除方法，在保证产品活性的基础上提升去除率、降低产品成本成为了亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种去除透明质酸中热源的方法，以解决现有技术中存在的热源去除效率较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是提供一种不影响透明质酸成分和性质的热源去除方法。

本发明解决的再一技术问题是提供一种降低透明质酸中热源去除工艺的成本。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种去除透明质酸中热源的方法，包括以下步骤：

1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的多糖；

2)取步骤1)得到的目的多糖利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口压力为30～40psi，回流口压力为10～15psi；

3)取步骤2)产物用0.22～0.45μm孔径的滤膜过滤，收集滤过液。

优选的，步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例不低于0.1ft²/L。

优选的，步骤2)用于超滤的加压泵对每平方英尺膜面积其流量不低于1.2L/min。

优选的，步骤3)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H₃PO₄溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗剂或Henkel P3-11清洗膜包；在此基础上进一步优选的，所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mM。

优选的，步骤2)所述膜包的截留分子量为100～1000KD。

优选的，步骤2)所述膜包的截留分子量为1～100KD。

优选的，步骤2)对目的多糖超滤后，利用缓冲液继续执行超滤3～5min，收集滤过的缓冲液与超滤后的目的多糖混合，而后执行步骤3)。

优选的，步骤2)所述的超滤为切向流过滤。

优选的，步骤1)所述的层析是亲和层析或离子交换层析或疏水层析或凝胶过滤层析。

在以上技术方案中，层析纯化可以根据样品的性质选择相应的填料，可以是特异性的也可以非特异性的纯化目的多糖，该步骤一方面可以对多糖起到纯化作用，同时可以去除部分热源。步骤2)中利用膜包执行超滤，在特定的截留分子量及压力条件下一方面能够有效去除热源，同时还能够对样品多糖起到浓缩作用，便于后续生产。在执行超滤操作后，进一步以0.22～0.45μm孔径的滤膜执行过滤能进一步去除热源，该孔径条件下对过滤压力要求不大，能够满足规模化处理的工艺要求。

在优选技术方案中，限定膜面积与待处理样品比例、限定加压泵流量均是为了在满足装置耐受能力的条件下确保较快的处理速度，其中单位ft²是平方英尺。在超滤后增加对膜包的清洗步骤能够显著延长膜包使用寿命，节约成本，所选用的清洗剂中Henkel P3-11是商品名称，具体限定由Henkel公司生产的、型号为P3-11的清洗剂，Tergazyme同样也是商品名，具体限定由ALCONOX公司生产的型号为Tergazyme的酶活性清洁剂。限定截留膜包的两种截留孔径是发现该条件下超滤对多糖性质无任何影响同时又能够最大程度的取出热源。在对目的多糖执行超滤后进一步利用缓冲液超滤3～5min并予以收集是为了尽可能完全的利用，避免多糖损失。

本发明中所述的膜包可以根据不同样品分子量大小、溶剂性质、有效成分性质，判断和选择膜包的材质、孔径。根据处理样品的多少可以选择不同大小面积的膜，对于每10L的处理流体，至少要选用1ft²的膜面积，要保证足够的过滤效率，对于每平方英尺的膜面积，泵的能力应至少达到1.2L/min。

本发明方法可以在不改变制剂原有性质的条件下，有效地去除多糖样品中的热源，可以用于大规模生物医药制剂的生产过程中。另一方面，本发明方法首先运用层析法进行预处理，在纯化了目的多糖的同时去除了部分热源。此外，本发明中运用膜包在去除热源的同时更重要的可以将样品进行浓缩，操作简单、耗时短、便于大规模应用。

综合来看，本发明处理量大、处理时间短、操作简便、生产成本低、可将热源含量降低至畜禽临床应用标准范围之内，并且在去除热源的同时不影响制品本身的性质，适合规模化生产应用。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1.1(透明质酸粗品的纯化)

介质混匀，装柱；用大约4个柱体积的平衡液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，PH 8.0)平衡介质，直到流出液A280值接近零；取收集的上清液上样，流速约1-2mL/min；用平衡液清洗介质，直到流出液A280值趋于平衡；用约2个柱体积的洗液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，PH 8.0)清洗Ni²⁺柱，直到流出液A280值趋于平衡；洗脱液(50mM NaH₂PO₄，10mM Tris-Cl，250mM咪唑，8M尿素，PH 8.0)洗脱多糖，收集洗脱液，即为目的多糖。

实施例1.2(膜包浓缩)

采用截留分子量为300KD和5KD的膜包进行切向流过滤浓缩。首先用去离子水冲洗回路，控制进液口压力不超过0.1MPa，出液口压力不超过0.05MPa。再用缓冲液在系统中循环3～5min，以减少样品的损失。之后对收集的目的多糖进行超滤浓缩，直至所需浓缩倍数。

实施例1.3(滤膜过滤)

浓缩后的样品用0.22um的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为目的多糖。

实施例1.4(以上方法去除热源后，对产物中热源含量的检测)

应用鲎试剂凝胶半定量法测定样品中热源含量。

(1)对鲎试剂灵敏度复核：使用厦门市鲎试剂实验厂有限公司生产的鲎试剂盒(灵敏度λ＝0.5EU/ml)和热源标准品(10EU/ml)，按厂家说明书进行操作。经测定，该批鲎试剂灵敏度的测定值在0.5λ～2λ(包含0.5λ及2λ)，可用于细菌热源检查

(2)对重组多糖的稀释和凝胶半定量法测定热源含量：按《中华人民共和国药典》2010版中《细菌热源检查法》的“凝胶半定量实验”进行。用细菌热源检查用水稀释供试品，每一支装有0.1ml鲎试剂的安碚瓶中分别加入0.1ml系列稀释的供试品作为试品管，每个稀释度做2个平行；另取2支加入0.1ml 2λ热源工作标准品作为阳性对照；2支加入去热源水0.1ml作为阴性对照。将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的温箱中，保温60±2min(保温过程和拿取试管要小心，避免因受到震动造成阴性结果)。实验结果如表1～3所示。

表1(第一部分)样品经纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量法测定结果

1

2

3

4

5

6

7

稀释倍数

1∶2

1∶4

1∶8

1∶16

1∶32

1∶64

1∶128

平行管1

+

-

平行管2

+

-

表1(第二部分)样品经纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量法测定结果

	8	9	10	11	阳性对照	阴性对照
							稀释倍数	1∶256	1∶512	1∶1024	1∶2048
平行管1	-	-	-	-		-
							平行管2	-	-	-	-	-

表1中：样品热源浓度＝λ×反应终点浓度＝0.5EU/ml×64＝32EU/ml

供试品热源终浓度＝32EU/ml×4倍＝128EU/ml

表2(第一部分)样品纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，用0.22um滤膜过滤后，4倍稀释，凝胶半定量法测定结果

	1	2	3	4	5	6	7
								稀释倍数	1∶2	1∶4	1∶8	1∶16	1∶32	1∶64	1∶128
平行管1	+	+	-	-	-	-	-
								平行管2	+	+	-	-	-	-	-

表2(第二部分)样品纯化、300KD和5KD膜包浓缩后，用0.22um滤膜过滤后，4倍稀释，凝胶半定量法测定结果

表2中：样品热源浓度＝λ×反应终点浓度＝0.5EU/ml×4＝2EU/ml

供试品热源终浓度＝2EU/ml×4倍＝8EU/ml

表3(第一部分)样品纯化、5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量法测定结果

1

2

3

4

5

6

稀释倍数

1∶2

1∶4

1∶8

1∶16(0.0625)

1∶32(0.03125)

1∶64

平行管1

+

-

平行管2

+

-

表3(第二部分)样品纯化、5KD膜包浓缩后，4倍稀释后用凝胶半定量法测定结果

	7	9	10	11	阳性对照	阴性对照
							稀释倍数	1∶128	1∶512	1∶1024	1∶2048
平行管1	-	-	-	-		-
							平行管2	-	-	-	-	-

表3中：G＝(0.03125×0.0625)^1/2＝0.4419＝1∶22.6

样品热源浓度＝λ×反应终点浓度＝0.5EU/ml×22.6＝11.313EU/ml

供试品热源终浓度＝11.313EU/ml×4倍＝45EU/ml

如以上表1～3所示结果，样品纯化后，同时运用300KD和5KD膜包浓缩，用0.22um滤膜过滤后，热源含量可降低至畜禽临床应用标准范围之内。

实施例2

一种去除透明质酸中热源的方法，包括以下步骤：

1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的多糖；

2)取步骤1)得到的目的多糖利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口压力为35psi，回流口压力为12psi；

3)取步骤2)产物用0.22μm孔径的滤膜过滤，收集滤过液。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例为0.1ft²/L。

步骤2)用于超滤的加压泵对每平方英尺膜面积其流量为1.2L/min。

步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H₃PO₄溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗剂或Henkel P3-11清洗膜包，其中所述NaOH溶液的浓度为0.1mM。

步骤2)所述膜包的截留分子量为100D。

步骤2)所述膜包的截留分子量为3KD。

步骤2)对目的多糖超滤后，利用缓冲液继续执行超滤3min，收集滤过的缓冲液与超滤后的目的多糖混合，而后执行步骤3)。

步骤2)所述的超滤为切向流过滤。

步骤1)所述的层析是亲和层析或离子交换层析或疏水层析或凝胶过滤层析。

实施例3

一种去除透明质酸中热源的方法，包括以下步骤：

1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的多糖；

2)取步骤1)得到的目的多糖利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口压力为30psi，回流口压力为10psi；

3)取步骤2)产物用0.25μm孔径的滤膜过滤，收集滤过液。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例为0.7ft²/L。

步骤2)用于超滤的加压泵对每平方英尺膜面积其流量为2.5L/min。

步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H₃PO₄溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗剂或Henkel P3-11清洗膜包，其中所述NaOH溶液的浓度为0.5mM。

步骤2)所述膜包的截留分子量为500KD。

步骤2)所述膜包的截留分子量为10KD。

步骤2)对目的多糖超滤后，利用缓冲液继续执行超滤5min，收集滤过的缓冲液与超滤后的目的多糖混合，而后执行步骤3)。

实施例4

一种去除透明质酸中热源的方法，包括以下步骤：

1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的多糖；

2)取步骤1)得到的目的多糖利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口压力为40psi，回流口压力为15psi；

3)取步骤2)产物用0.22μm孔径的滤膜过滤，收集滤过液。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例为0.4ft²/L。

步骤2)用于超滤的加压泵对每平方英尺膜面积其流量为1.7L/min。

步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H₃PO₄溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗剂或Henkel P3-11清洗膜包。

步骤2)所述的超滤为切向流过滤。

实施例5

一种去除透明质酸中热源的方法，包括以下步骤：

1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的多糖；

2)取步骤1)得到的目的多糖利用超滤膜包进行超滤，收集滤过液，其中膜包进口压力为32psi，回流口压力为14psi；

3)取步骤2)产物用0.45μrm孔径的滤膜过滤，收集滤过液。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种去除透明质酸中热源的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)对待处理样品进行层析纯化，收集目的多糖；

3)取步骤2)产物用0.22～0.45μm孔径的滤膜过滤，收集滤过液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述膜包中的膜面积与待处理样品总量的比例不低于0.1ft²/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)用于超滤的加压泵对每平方英尺膜面积其流量不低于1.2L/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)收集滤过液后，利用NaOH溶液或H₃PO₄溶液或NaCLO溶液清洗膜包。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mM。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述膜包的截留分子量为100～1000KD。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述膜包的截留分子量为1～100KD。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)对目的多糖超滤后，利用缓冲液继续执行超滤3～5min，收集滤过的缓冲液与超滤后的目的多糖混合，而后执行步骤3)。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述的超滤为切向流过滤。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述的层析是亲和层析或离子交换层析或疏水层析或凝胶过滤层析。