CN104031900A - 一种去除多肽中的内毒素的方法 - Google Patents
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21004—Trypsin (3.4.21.4)
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Abstract
本发明公开了一种去除多肽中的内毒素的方法。该方法包括下述步骤：将多肽粗品溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可；所述的多肽粗品为玻璃酸酶粗品、绒促性素粗品、尿促性素粗品或促皮质素粗品。本发明的在多肽生产过程中去除内毒素的方法，在不影响多肽活性、收率的前提下，有效地去除多肽生产中含有的内毒素污染物，目前已经应用于多肽原料药生产，内毒素含量符合2010版中国药典要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种去除多肽中的内毒素的方法。
背景技术
内毒素产生于革兰氏阴性细菌的细胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及类脂A，是热原的活性部分。它们的相对分子质量一般为1万～2.5万，在水溶液中形成缔合体，相对分子质量可达50万～100万。其具有耐热性和化学稳定性，不易被除灭。注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此，在生物制品生产过程中，需要有严格的工艺控制策略对内毒素进行去除或限量控制。
目前，水溶液中常用的内毒素去除方法主要有如下几种：
1、超滤
内毒素具有较大的相对分子质量，因此，可选用超滤膜去除水中的内毒素。在使用超滤方法去除内毒素时需要根据被处理药物的相对分子质量、特性选择超滤膜的孔径及材质，因此该方法不具备通用性。另外，内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，因此大小不一，这也给超滤法去除内毒素带来了挑战。
2、活性炭吸附法
活性炭吸附是一种较早用于内毒素去除的方法，但是，由于活性炭选择性差，在吸附内毒素的同时吸附有效活性成分，影响产品收率。
3、化学降解法
化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，这种方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，该方法的使用需结合产品的理化性质。
4、离子交换色谱法
离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素，但这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。
蛋白质种类较多，其分离纯化步骤各不相同，不同终产品对内毒素含量要求也有差异，因此，去除内毒素的方法和效果无法完全通用。多肽作为一种活性蛋白类药物，其具有易失活、不稳定的特点，在内毒素去除过程中保证其本身性质及有效活性成分不受影响至关重要，这也是本领域长期以来存在的、难以克服的技术难题。在多肽中的内毒素去除方法选择过程中，超滤法因多肽分子量较大而无法应用，活性炭吸附法专一性不强，化学降解法极易造成多肽失活，色谱法耗时较长，不利于多肽性质的稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服了现有技术中多肽中的内毒素无法去除彻底、易造成多肽失活、耗时较长的缺陷，而提供了一种去除多肽中的内毒素的方法。本发明的方法将超滤与磷酸钙沉淀联合使用，可以有效除去内毒素，且不会影响多肽的活性，适用于大规模条件下除去蛋白质中的内毒素。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种去除多肽中的内毒素的方法，其包括下述步骤：将多肽粗品溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可；所述的多肽粗品为玻璃酸酶粗品、绒促性素粗品、尿促性素粗品或促皮质素粗品。
其中，所述的多肽粗品可为本领域常规的多肽粗品，例如玻璃酸酶粗品是新鲜牛睾丸通过分离、绞碎成浆、酸液泡制、扯浆、盐析所得到的玻璃酸酶粗品，绒促性素粗品是孕妇尿经吸附剂吸附、沉淀、过滤所得到的绒促性素粗品，促皮质素粗品是猪脑垂体经丙酮浸泡脱水、分离前叶再真空干燥，置球磨机中球磨，过筛，干燥得到的促皮质素粗品。
其中，所述的绒促性素粗品较佳地进行下述前处理：加入醋酸钠缓冲液溶解，离心，上清液依次加入聚乙二醇辛基苯基醚、磷酸三丁酯，搅拌，上述溶液通过Spff柱层析进行纯化，洗脱液过滤后加入乙醇，静置，离心，即可。
其中，所述的促皮质素粗品较佳地进行下述前处理：加入丙酮和盐酸，离心，即可。
其中，所述的超滤浓缩采用的超滤膜较佳地为德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜，截留相对分子质量是5kDa或10kDa。
其中，所述的超滤浓缩得到的浓缩液的体积较佳地为超滤浓缩前体积的0.1～0.3倍。
其中，所述的磷酸盐可为本领域常规的可溶于水的各种磷酸盐，较佳地为磷酸钠和/或磷酸钾。
其中，所述的钙盐可为本领域常规的可溶于水的各种钙盐，较佳地为醋酸钙和/或氯化钙。
其中，所述的磷酸盐水溶液与所述的浓缩液的体积比较佳地为(0.1～0.2)：1。
其中，所述的钙盐水溶液与所述的磷酸盐水溶液的体积比较佳地为(0.5～0.7)：1。
其中，所述的磷酸盐水溶液的浓度较佳地为0.2～0.5mol/L。
其中，所述的钙盐水溶液的浓度较佳地为0.8～1.5mol/L。
其中，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比较佳地为1：(0.5～2)，更佳地为1：1.5。
其中，所述的离心的转速较佳地为3000～4000rpm。
其中，所述的离心较佳地为冷冻离心10～30min，冷冻离心的温度较佳地为4～10℃。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明先通过超滤方法大大减少了多肽操作体积，同时，使多肽溶液中内毒素得到富集，有利于后续磷酸钙沉淀内毒素及透析、冻干，提高生产效率。
(2)在磷酸钙沉淀多肽中的内毒素技术方案中，磷酸盐与钙盐的摩尔比为1:1.5时恰好完全反应生成磷酸钙沉淀，用以吸附内毒素，后续经离心操作除去沉淀复合物。过量的磷酸盐或钙盐水溶液不利于多肽稳定性，并且会影响后续终产品质量符合标准(如炽灼残渣)。整个磷酸钙沉淀内毒素操作工序耗时30-60分钟，极大降低了对多肽活性的影响。
(3)本发明的在多肽生产过程中去除内毒素的方法，在不影响多肽活性、收率的前提下，有效地去除多肽生产中含有的内毒素污染物，目前已经应用于多肽原料药生产，内毒素含量符合2010版中国药典要求。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
玻璃酸酶粗品1220g，批号090122，购自乌鲁木齐天山区立信生化制品厂，玻璃酸酶粗品是新鲜牛睾丸通过分离、绞碎成浆、酸液泡制、扯浆、盐析所得，其比活不得低于250U/mg。上述粗品投入不锈钢桶，按照原料(总效价)：纯化水(体积)＝1亿U：800ml溶解，即加入4℃纯化水2800ml，搅拌1小时至完全溶解，溶解后的溶液过滤，滤液用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为530ml。缓慢加入60ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入36ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.40，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟。上清液置冰浴中，加入0.6g活性炭，搅拌30分钟，3000rpm离心30分钟，得上清液。上清液用2M盐酸调节pH至6.5，装盘冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干，得成品Y0201341g。
玻璃酸酶内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
表1玻璃酸酶内毒素检测结果
| 批号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| Y0201 | 0.000010 | —— | ++ |
参照2010版药典玻璃酸酶相关标准，该批次玻璃酸酶符合规定(2010版药典规定，每1单位玻璃酸酶中含内毒素的量应小于0.20EU)。其中，阴性对照物为注射用水、阳性对照物为细菌内毒素工作标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
实施例2
玻璃酸酶粗品1400g，批号090123，购自乌鲁木齐天山区立信生化制品厂，玻璃酸酶粗品是新鲜牛睾丸通过分离、绞碎成浆、酸液泡制、扯浆、盐析所得，其比活不得低于250U/mg。上述粗品投入不锈钢桶，按照原料(总效价)：纯化水(体积)＝1亿U：800ml溶解，即加入4℃纯化水3300ml，搅拌1小时至完全溶解，溶解后的溶液过滤，滤液用5kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为650ml。缓慢加入70ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入42ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.60，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟。上清液置冰浴中，加入0.7g活性炭，搅拌30分钟，3000rpm离心30分钟，得上清液。上清液用2M盐酸调节pH至6.5，装盘冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干，得成品Y0202368g。
玻璃酸酶内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
表2玻璃酸酶内毒素检测结果
| 批号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| Y0202 | 0.000011 | —— | ++ |
参照2010版药典玻璃酸酶相关标准，该批次玻璃酸酶符合规定(2010版药典规定，每1单位玻璃酸酶中含内毒素的量应小于0.20EU)。其中，阴性对照物为注射用水、阳性对照物为细菌内毒素工作标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
实施例3
玻璃酸酶粗品批号100501，购自乌鲁木齐天山区立信生化制品厂，玻璃酸酶粗品是新鲜牛睾丸通过分离、绞碎成浆、酸液泡制、扯浆、盐析所得，其比活不得低于250U/mg；玻璃酸酶粗品500g投料，按照原料(总效价)：纯化水(体积)＝1亿U：800ml溶解，即加入4℃纯化水1120ml，搅拌1小时至完全溶解，溶解后的溶液过滤，留样100ml待测，其余经一步超滤之后得到超滤液(具体操作参照实施例1)。超滤液平均分成若干份，依次加入0.1倍超滤液体积的磷酸钠、醋酸钙溶液，分别达到磷酸根与钙离子摩尔终比例10︰1、5︰1、2︰1、1︰1.5、1︰2、1︰5、0。用2.5M NaOH调节pH至8.3，4℃搅拌10分钟；3000rpm转速条件下，冷冻离心15分钟，收集合并滤液，参照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”检测内毒素含量，部分上述滤液经4℃纯化水透析24小时后冻干，参照2010版药典检测玻璃酸酶质量指标。
表3磷酸钙沉淀对超滤前后样品内毒素去除水平
由表3可以看出，超滤浓缩在一定程度提高玻璃酸酶活性的前提下可有效提高溶液中内毒素浓度，内毒素由超滤前11200EU/ml提高到43226EU/ml，使内毒素得到有效富集，利于提高后续磷酸钙沉淀内毒素去除率，未超滤玻璃酸酶溶液内毒素去除率为99.616％，超滤后玻璃酸酶溶液内毒素去除率提高到99.998％。
表4不同磷酸根、钙离子情况下内毒素去除水平
注：2010版中国药典二部规定，玻璃酸酶效价不应低于300U/mg；酪氨酸含量应小于0.1μg/U。
由表4可以看出，通过磷酸盐和钙离子反应生成磷酸钙凝胶可有效去除玻璃酸酶中存在的内毒素，其中磷酸根离子与钙离子最佳反应比例为1︰1.5，即两者恰好完全反应生成磷酸钙，内毒素去除率可以高于99.998％。磷酸根过量不利于玻璃酸酶中内毒素去除，且会影响玻璃酸酶效价及酪氨酸含量。钙离子过量虽然在去除内毒素水平上与最佳反应比例无差异，但一定程度影响了玻璃酸酶效价，并导致酪氨酸含量及澄清度不符合药典规定。
实施例4
绒促性素粗品500g，批号100310，绒促性素粗品是孕妇尿经吸附剂吸附、沉淀、过滤所得，其比活不得低于300U/mg。用12000ml0.05mol/L醋酸钠缓冲液溶解上述绒促性素粗品，10000rpm离心30min。离心后上清依次加入Triton100(聚乙二醇辛基苯基醚)200ml，磷酸三丁酯200ml，24℃搅拌240分钟。12000ml上述溶液通过Spff柱层析进行纯化，洗脱液收集体积4700ml，洗脱液过滤后加入19000ml95％乙醇，搅拌3小时后4℃放置12h，通过离心得到白色沉淀，5000rpm，20分钟。将沉淀放入干净玻璃平皿中，放入真空干燥箱，干燥24小时得到干燥品30g。干燥品加入3000ml纯化水溶解，过滤，滤液用5kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为800ml。缓慢加入100ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入60ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5MNaOH调节pH至8.50，搅拌20分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，离心后上清液用5mol/L盐酸调节pH至7.0，加入3600ml95％乙醇，析出沉淀，沉淀物用无水乙醇洗涤2次后至真空干燥箱干燥24小时，得绒促性素成品10060126g。
绒促性素内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
表5绒促性素内毒素检测结果
| 批号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| 100601 | ＜检测限 | —— | ++ |
注：参照2010版药典绒促性素相关标准，该批次绒促性素符合规定(2010版药典规定，每1单位绒促性素中含内毒素的量应小于0.010EU)。其中，阴性对照物为注射用水、阳性对照物为细菌内毒素工作标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
实施例5
绒促性素粗品450g，批号100311，绒促性素粗品是孕妇尿经吸附剂吸附、沉淀、过滤所得，其比活不得低于300U/mg。用10800ml0.05mol/L醋酸钠缓冲液溶解上述绒促性素粗品，10000rpm离心30min。离心后上清依次加入Triton100(聚乙二醇辛基苯基醚)180ml，磷酸三丁酯180ml，24℃搅拌240分钟。12000ml上述溶液通过Spff柱层析进行纯化，洗脱液收集体积4500ml，洗脱液过滤后加入18000ml95％乙醇，搅拌3小时后4℃放置12h，通过离心得到白色沉淀，5000rpm，20分钟。将沉淀放入干净玻璃平皿中，放入真空干燥箱，干燥24小时得到干燥品25g。干燥品加入2500ml纯化水溶解，过滤，滤液用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为500ml。缓慢加入50ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入30ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5MNaOH调节pH至8.30，搅拌20分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，离心后上清液用5mol/L盐酸调节pH至6.9，加入3600ml95％乙醇，析出沉淀，沉淀物用无水乙醇洗涤2次后至真空干燥箱干燥24小时，得绒促性素成品100602 21g。
绒促性素内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
表6绒促性素内毒素检测结果
| 批号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| 100602 | 0.000010 | —— | ++ |
注：参照2010版药典绒促性素相关标准，该批次绒促性素符合规定(2010版药典规定，每1单位绒促性素中含内毒素的量应小于0.010EU)。其中，阴性对照物为注射用水、阳性对照物为细菌内毒素工作标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
实施例6
绒促性素粗品批号100310，绒促性素粗品是孕妇尿经吸附剂吸附、沉淀、过滤所得，其比活不得低于300U/mg。绒促性素粗品400g投料，用9600ml0.05mol/L醋酸钠缓冲液溶解上述绒促性素粗品，10000rpm离心30min。离心后上清依次加入Triton100160ml，磷酸三丁酯160ml，24℃搅拌240分钟。10000ml上述溶液通过Spff柱层析进行纯化，洗脱液收集体积4000ml，洗脱液过滤后加入16000ml95％乙醇，搅拌3小时后4℃放置12h，通过离心得到白色沉淀，5000rpm，20分钟。将沉淀放入干净玻璃平皿中，放入真空干燥箱，干燥24小时得到干燥品26g。干燥品加入2600ml纯化水溶解，溶解后的溶液过滤，留样400ml待测，其余经一步超滤之后得到超滤液(具体操作参照实施例4)。超滤液平均分成若干份，依次加入0.1倍超滤液体积的磷酸钠、醋酸钙溶液，分别达到磷酸根与钙离子摩尔终比例10︰1、5︰1、2︰1、1︰1.5、1︰2、1︰5、0。用2.5M NaOH调节pH至8.5，4℃搅拌10分钟；3000rpm转速条件下，冷冻离心15分钟，收集合并滤液，参照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”检测内毒素含量，部分上述滤液经4℃纯化水透析24小时后乙醇沉淀、洗涤、干燥(具体操作参照实施例4)，参照2010版药典检测绒促性素质量指标。
表7磷酸钙沉淀对超滤前后样品内毒素去除水平
由表7可以看出，超滤浓缩在提高绒促性素活性的前提下可有效提高溶液中内毒素浓度，内毒素由超滤前1058EU/ml提高到6300EU/ml，使内毒素得到有效富集，利于提高后续磷酸钙沉淀内毒素去除率，未超滤绒促性素溶液内毒素去除率为98.980％，超滤后绒促性素溶液内毒素去除率提高到99.982％。
表8不同磷酸根、钙离子情况下内毒素去除水平
注：2010版中国药典二部规定，绒促性素效价不应低于4500U/mg。
由表8可以看出，通过磷酸盐和钙离子反应生成磷酸钙凝胶可有效去除绒促性素中存在的内毒素，其中磷酸根离子与钙离子最佳反应比例为1︰1.5，即两者恰好完全反应生成磷酸钙，内毒素去除率可以高于99.98％。磷酸根过量不利于玻璃酸酶中内毒素去除，且会影响绒促性素活性。钙离子过量虽然在去除内毒素水平上与最佳反应比例无差异，也不会影响绒促性素活性，但会导致绒促性素溶液澄清度不符合药典规定。
实施例7
猪脑垂体经丙酮浸泡脱水、分离前叶置真空干燥箱P2O5真空干燥，干后置球磨机中球磨，经60目筛过筛，再置真空干燥箱P2O5真空干燥得前叶粉。
称取前叶粉2kg，加入丙酮20000ml，1mol/L盐酸溶液7000ml，15分钟内加热升温至50℃，保温30分钟，冷却到25℃以下开始离心，滤渣加入丙酮6000ml，1mol/L盐酸溶液12000ml，继续离心，合并两次滤液冷却至4℃，保温30分钟过滤。滤液加入7倍(v/v)-10℃的丙酮沉淀，沉淀用丙酮脱水，P2O5真空干燥得到精制品240g。上述精制品加入2400ml纯化水溶解，过滤，滤液用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为600ml。缓慢加入100ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入60ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.00，搅拌15分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液用7500ml丙酮沉淀，沉淀物用丙酮脱水，P2O5真空干燥得促皮质素成品Y0901216g。
促皮质素内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
表9促皮质素内毒素检测结果
| 批号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| Y0901 | 0.0032 | —— | ++ |
注：目前2010版药典对促皮质素内毒素暂无规定，参照注射类药物绒促性素相关标准，促皮质素符合规定(2010版药典规定，每1单位绒促性素中含内毒素的量应小于0.010EU)。其中，阴性对照物为注射用水、阳性对照物为细菌内毒素工作标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
实施例8
猪脑垂体经丙酮浸泡脱水、分离前叶置真空干燥箱P2O5真空干燥，干后置球磨机中球磨，经60目筛过筛，再置真空干燥箱P2O5真空干燥得前叶粉。
称取前叶粉2.5kg，加入丙酮25000ml，1mol/L盐酸溶液8800ml，15分钟内加热升温至50℃，保温30分钟，冷却到25℃以下开始离心，滤渣加入丙酮7000ml，1mol/L盐酸溶液14000ml，继续离心，合并两次滤液冷却至4℃，保温30分钟过滤。滤液加入7倍(v/v)-10℃的丙酮沉淀，沉淀用丙酮脱水，P2O5真空干燥得到精制品276g。上述精制品加入2800ml纯化水溶解，过滤，滤液用5kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为710ml。缓慢加入100ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入60ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.50，搅拌15分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液用8500ml丙酮沉淀，沉淀物用丙酮脱水，P2O5真空干燥得促皮质素成品Y0902253g。
促皮质素内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
表10促皮质素内毒素检测结果
| 批号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| Y0902 | 0.0027 | —— | ++ |
注：目前2010版药典对促皮质素内毒素暂无规定，参照注射类药物绒促性素相关标准，促皮质素符合规定(2010版药典规定，每1单位绒促性素中含内毒素的量应小于0.010EU)。其中，阴性对照物为注射用水、阳性对照物为细菌内毒素工作标准品(购自中国食品药品检定研究院)。
实施例9
取垂体前叶粉1kg(垂体前叶粉具体参见实施例7)，加入丙酮10000ml，1mol/L盐酸溶液3500ml，15分钟内加热升温至50℃，保温30分钟，冷却到25℃以下开始离心，滤渣加入丙酮2800ml，1mol/L盐酸溶液5600ml，继续离心，合并两次滤液冷却至4℃，保温30分钟过滤。滤液加入7倍(v/v)-10℃的丙酮沉淀，沉淀用丙酮脱水，P2O5真空干燥得到精制品116g。上述精制品加入1160ml纯化水溶解，溶解后的溶液过滤，留样100ml待测，其余经一步超滤之后得到超滤液(具体操作参照实施例7)。超滤液平均分成若干份，依次加入0.1倍超滤液体积的磷酸钠、醋酸钙溶液，分别达到磷酸根与钙离子摩尔终比例10︰1、5︰1、2︰1、1︰1.5、1︰2、1︰5、0。用2.5MNaOH调节pH至8.3，4℃搅拌10分钟；3000rpm转速条件下，冷冻离心15分钟，收集合并滤液，参照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”检测内毒素含量，部分上述滤液经4℃纯化水透析24小时后丙酮沉淀、脱水、干燥(具体操作参照实施例7)，参照药典检测促皮质素质量指标。
表11磷酸钙沉淀对超滤前后样品内毒素去除水平
由表11可以看出，超滤浓缩在一定程度提高促皮质素活性的前提下可有效提高溶液中内毒素浓度，内毒素由超滤前7120EU/ml提高到37360EU/ml，使内毒素得到有效富集，利于提高后续磷酸钙沉淀内毒素去除率，未超滤促皮质素溶液内毒素去除率为99.928％，超滤后促皮质素溶液内毒素去除率提高到99.996％。
表12不同磷酸根、钙离子情况下内毒素去除水平
注：促皮质素效价不应低于1.0U/mg。
由表12可以看出，通过磷酸盐和钙离子反应生成磷酸钙凝胶可有效去除促皮质素中存在的内毒素，其中磷酸根离子与钙离子最佳反应比例为1︰1.5，即两者恰好完全反应生成磷酸钙，内毒素去除率可以高于99.99％。该工艺中磷酸根过量不利于促皮质素中内毒素去除，同时对促皮质素效价产生影响；钙离子过量虽然在去除内毒素水平上与最佳反应比例无差异，对促皮质素效价亦无显著影响，但会导致促皮质素澄清度不符合药典规定。
实施例10
糜蛋白酶原料批号091269，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其纯度(质量百分比)不应低于30％。糜蛋白酶原料投料1100g，加7倍量(v/w)纯化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml调节pH为3.0，搅拌8小时后，放置过夜。次日搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH为2.6，再加2倍量(v/w)饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，再用5mol/L NaOH溶液调pH为5.0，置25℃恒温箱，保温48小时，布氏漏斗过滤，收集滤饼，滤液弃去。过滤所得滤饼，用3倍量(v/w)纯化水溶解后，以1倍量(v/w)饱和硫酸铵盐析，25℃恒温保温24小时，反复3次，后二次滤出母液，收集待用，滤饼待活化。将以上结晶后过滤的滤饼置于不锈钢桶内，加入3倍量(v/w)纯化水，并加2.5mol/LH2SO4溶液90ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗过滤，收集滤液，用2.5mol/LH2SO4溶液调滤液pH至3.0，搅拌3小时。
加5mol/L NaOH溶液调pH为7.6，再加入1倍量(v/w滤饼重)0.5mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液，搅拌均匀得结晶物溶液，测pH为7.6，再按比例(胰蛋白酶∶结晶物溶液＝5mg∶100ml)加入胰蛋白酶，置4℃冰箱中活化72小时，活化第二天应注意其pH值，pH控制在7.6。
将以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液调pH为3.9，测活化液体积，按500g/L加入固体硫酸铵进行盐析，放置过夜，次日布氏漏斗过滤，弃滤液，收集滤饼1648g，加纯化水16500ml溶解，过滤，收集滤液。用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为2400ml。缓慢加入240ml0.4mol/L的4℃磷酸三钠溶液，搅拌，再缓慢加入144ml1mol/L的4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.51，搅拌10分钟后用3000转/分的转速4℃离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，4℃左右透析3天，每12小时换水一次(水温控制在4℃左右)。
收集、合并透析液，加100g硅藻土，过滤，量取滤液体积，用折叠式过滤器(0.22μm孔径滤膜、德国赛多利斯公司)过滤，调节pH为6.0，滤液装盘(1000ml/盘)，送冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得糜蛋白酶成品110201。
实施例11
糜蛋白酶原料批号091270，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于30％。糜蛋白酶原料投料1100g，加7倍量(v/w)纯化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml调节pH为3.1，搅拌8小时后，放置过夜。次日搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH为2.5，再加2倍量(v/w)饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，再用5mol/L NaOH溶液调pH为4.9，置25℃恒温箱，保温48小时，布氏漏斗过滤，收集滤饼，滤液弃去。过滤所得滤饼，用3倍量(v/w)纯化水溶解后，以1倍量(v/w)饱和硫酸铵盐析，25℃恒温保温24小时，反复3次，后二次滤出母液，收集待用，滤饼待活化。将以上结晶后过滤的滤饼置于不锈钢桶内，加入3倍量(v/w)纯化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液110ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗过滤，收集滤液，用2.5mol/L H2SO4溶液调滤液pH至2.9，搅拌3小时。
加5mol/L NaOH溶液调pH为7.6，再加入1倍量(v/w滤饼重)0.5mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液，搅拌均匀得结晶物溶液，测pH为7.6，再按比例(胰蛋白酶∶结晶物溶液＝5mg∶100ml)加入胰蛋白酶，置4℃冰箱中活化72小时，活化第二天应注意其pH值，pH控制在7.6。
将以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液调pH为4.1，测活化液体积，按500g/L加入固体硫酸铵进行盐析，放置过夜，次日布氏漏斗过滤，弃滤液，收集滤饼1895g，加纯化水18950ml溶解，过滤，收集滤液。用5kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为2800ml。缓慢加入300ml0.4mol/L的4℃磷酸三钠溶液，搅拌，再缓慢加入180ml1mol/L的4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.00，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，4℃左右透析3天，每12小时换水一次(水温控制在4℃左右)。
收集、合并透析液，加100g硅藻土，过滤，量取滤液体积，用折叠式过滤器(0.22μm孔径滤膜、德国赛多利斯公司)过滤，调节pH为6.0，滤液装盘(1000ml/盘)，送冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得糜蛋白酶成品110202。
实施例12
糜蛋白酶原料批号091271，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于30％。糜蛋白酶原料投料1100g，加7倍量(v/w)纯化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml调节pH为2.9，搅拌8小时后，放置过夜。次日搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH为2.5，再加2倍量(v/w)饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，再用5mol/L NaOH溶液调pH为5.0，置25℃恒温箱，保温48小时，布氏漏斗过滤，收集滤饼，滤液弃去。过滤所得滤饼，用3倍量(v/w)纯化水溶解后，以1倍量(v/w)饱和硫酸铵盐析，25℃恒温保温24小时，反复3次，后二次滤出母液，收集待用，滤饼待活化。将以上结晶后过滤的滤饼置于不锈钢桶内，加入3倍量(v/w)纯化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液100ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗过滤，收集滤液，用2.5mol/L H2SO4溶液调滤液pH至2.9，搅拌3小时。
加5mol/L NaOH溶液调pH为7.6，再加入1倍量(v/w滤饼重)0.5mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液，搅拌均匀得结晶物溶液，测pH为7.6，再按比例(胰蛋白酶∶结晶物溶液＝5mg∶100ml)加入胰蛋白酶，置4℃冰箱中活化72小时，活化第二天应注意其pH值，pH控制在7.6。
将以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液调pH为4.1，测活化液体积，按500g/L加入固体硫酸铵进行盐析，放置过夜，次日布氏漏斗过滤，弃滤液，收集滤饼1850g，加纯化水18000ml溶解，过滤，收集滤液。用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart赛多利斯、德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为2500ml。缓慢加入480ml0.4mol/L的4℃磷酸三钠溶液，搅拌，再缓慢加入288ml1mol/L的4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至9.00，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，4℃左右透析3天，每12小时换水一次(水温控制在4℃左右)。
收集、合并透析液，加100g硅藻土，过滤，量取滤液体积，用折叠式过滤器(0.22μm孔径滤膜、德国赛多利斯公司)过滤，调节pH为6.0，滤液装盘(1000ml/盘)，送冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得糜蛋白酶成品110203。
实施例13
实施例10～12中的三批次糜蛋白酶内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定，检测结果如下表13所示，其中阴性对照品为注射用水，阳性对照品为内毒素标准品(购于中国食品药品检定研究院)。
表13三批糜蛋白酶成品内毒素检测结果
| 批号 | 编号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| 110201 | 实施例10 | 0.000015 | -- | ++ |
| 110202 | 实施例11 | 0.000026 | -- | ++ |
| 110203 | 实施例12 | 0.000018 | -- | ++ |
由上表可知，实施例10～12得到的三批次糜蛋白酶成品均符合2010版药典要求(2010版药典规定，每1单位糜蛋白酶中含内毒素的量应小于0.075EU)。
实施例14
糜蛋白酶原料批号091271，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其纯度不应低于30％。糜蛋白酶原料1000g经多步盐析、结晶、过滤、活化、盐析(具体方法参照实施例10)后的滤饼用10倍量纯化水溶解，留样500ml待测，其余经一步超滤之后得到超滤液(具体操作参照实施例10)。超滤液平均分成若干份，依次加入0.1倍超滤液体积15％(w/v)的磷酸钠、17.3％(w/v)醋酸钙溶液，分别达到磷酸根与钙离子摩尔终比例为10︰1、5︰1、2︰1、1︰1.5、1︰2、1︰5、0。用2.5M NaOH调节pH至8.5，4℃搅拌10分钟；3000rpm转速条件下，冷冻离心15分钟，收集合并滤液，参照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”检测内毒素含量，部分上述滤液经透析后冻干，参照2010版药典检测糜蛋白酶质量指标。
表14磷酸钙沉淀对超滤前后样品内毒素的去除水平
由表14可以看出，超滤浓缩在不影响糜蛋白酶效价的前提下可有效提高溶液中内毒素浓度，内毒素由超滤前4020EU/ml提高到19000EU/ml，使内毒素得到有效富集，利于提高后续磷酸钙沉淀内毒素去除率，未超滤糜蛋白酶溶液内毒素去除率为99.788％，超滤后糜蛋白酶溶液内毒素去除率提高到99.988％。
表15不同磷酸根、钙离子情况下内毒素去除水平
| 序号 | 磷酸根/钙离子 | 内毒素含量 | 内毒素去除 | 糜蛋白酶效价 | 糜蛋白酶炽灼 |
| (摩尔比) | (EU/ml) | (％) | (U/mg) | 残渣(％) | |
| 1 | 10：1 | 1200 | 93.1 | 1128 | 2.1 |
| 2 | 5:1 | 320 | 98.2 | 1293 | 1.8 |
| 3 | 2:1 | 30 | 99.8 | 1336 | 1.2 |
| 4 | 1:1.5 | ＜3 | ＞99.98 | 1450 | 0.3 |
| 5 | 1:2 | ＜3 | ＞99.98 | 1409 | 2.7 |
| 6 | 1:5 | ＜3 | ＞99.98 | 1300 | 3.2 |
| 7 | 0 | 17500 | 0 | 1150 | 1.9 |
注：2010版中国药典二部规定，糜蛋白酶炽灼残渣量不应大于2.5％。
由表15可以看出，通过磷酸盐和钙离子反应生成磷酸钙凝胶可有效去除糜蛋白酶中存在的内毒素，其中磷酸根离子与钙离子最佳反应比例为1︰1.5，内毒素去除率可以高于99.98％。磷酸根过量不利于糜蛋白酶中内毒素去除，且会影响糜蛋白酶效价及炽灼残渣量。钙离子过量在不影响糜蛋白酶效价的前提下可有效去除内毒素，但会造成糜蛋白酶炽灼残渣超标。
实施例15
胰蛋白酶原料批号120901，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，胰蛋白酶原料是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于10％；胰蛋白酶原料投料4000g，先用5倍量(V/W)纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液5000mL调pH至3.0，以助其溶解。计量溶液体积，按415g/L比例加固体硫酸铵入其中，使之达0.7饱和度，待其溶解后，静置沉淀8小时。将溶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，称量滤饼重量9115g，按滤饼重的3倍量(V/W)补加纯化水27345ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，加入硫酸铵溶液18230ml，使之达0.4饱和度，静置沉淀16小时。将溶液用离心机离心，3000rpm，离心20分钟，量取上清液体积40000ml，加入等倍量(V/V)饱和硫酸铵，达0.7饱和度，静置沉淀16小时。
将上清液弃去，沉淀物用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，并在滤饼上加入15毫升饱和硫酸镁溶液，抽干，将滤饼取出，待活化。按每批3Kg量计算做活化，将滤饼溶于4倍量(V/W)0.005mol/L盐酸溶液，待滤饼完全溶解后调溶液pH至3.0，将溶液至于冰箱(4℃)放置1小时，1小时后加入5倍量(V/W)pH8.0，0.8mol/L硼酸缓冲液及8倍量(V/W)纯化水，再加入2倍量(V/W)1mol/L氯化钙溶液，使溶液总体积为滤饼的20倍量(V/W)，用5mol/L氢氧化钠调pH至7.6，加1％结晶胰蛋白酶进行72小时活化，将溶液放置冰箱(4℃)中静置，24小时后测pH值，控制pH在7.6左右。
活化后的溶液用2.5mol/L硫酸调pH至2.9，再按242g/L加入固体硫酸铵14181g，搅拌溶解，置5℃存放48小时后用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，滤液按205g/L加入固体硫酸铵12680g，使达0.7饱和度，置5℃处存放20小时。
将0.7饱和液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得滤饼，再按其1.5倍量(V/W)加入pH9.0，0.8mol/L硼酸缓冲液，用2.5mol/L硫酸溶液调pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中(4℃)，结晶(外透)120小时。
取出结晶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得结晶物2440g，加纯化水24400ml溶解，过滤，收集滤液。用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为3000ml。缓慢加入300ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入180ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.10，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，5℃左右透析3天，每12小时换水一次(每12小时换水一次，水温控制在5℃左右)。
取出透析液，加入200克硅藻土，用布氏漏斗加一层澄清板、一层中速滤纸过滤，得滤液，滤液用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，进冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得结晶胰蛋白酶成品121101，共计430g。
实施例16
胰蛋白酶原料批号120902，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，胰蛋白酶原料是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于10％；胰蛋白酶原料投料4500g，先用5倍量(V/W)纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，以助其溶解。计量溶液体积，按415g/L比例加固体硫酸铵入其中，使之达0.7饱和度，待其溶解后，静置沉淀8小时。将溶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，称量滤饼重量9500g，按滤饼重的3倍量(V/W)补加纯化水28500ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，加入液体硫酸铵19000ml，使之达0.4饱和度，静置沉淀16小时。将溶液用离心机离心，3000rpm，离心20分钟，量取上清液体积54000ml，加入等倍量(V/V)饱和硫酸铵，达0.7饱和度，静置沉淀16小时。
将上清液弃去，沉淀物用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，并在滤饼上加入15毫升饱和硫酸镁溶液，抽干，将滤饼取出，待活化。按每批3Kg量计算做活化，将滤饼溶于4倍量(V/W)0.005mol/L盐酸溶液，待完滤饼全溶解后调溶液pH至3.0，将溶液至于冰箱(4℃)放置1小时，1小时后加入5倍量(V/W)pH8.0，0.8mol/L硼酸缓冲液及8倍量(V/W)纯化水，再加入2倍量(V/W)1mol/L氯化钙溶液，使溶液总体积为滤饼的20倍量(V/W)，用5mol/L氢氧化钠调pH至7.6，加1％结晶胰蛋白酶进行72小时活化，将溶液放置冰箱(4℃)中静置，24小时后测pH值，控制pH在7.6左右。
活化后的溶液用2.5mol/L硫酸调pH至2.9，再按242g/L加入固体硫酸铵15004g，搅拌溶解，置5℃存放48小时后用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，滤液按205g/L加入固体硫酸铵12710g，使达0.7饱和度，置5℃处存放20小时。
将0.7饱和液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得滤饼，再按其1.5倍量(V/W)加入pH9.0，0.8mol/L硼酸缓冲液，用2.5mol/L硫酸溶液调pH至8.06，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中(5℃)，结晶(外透)120小时。
取出结晶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得结晶物3500g，加纯化水35000ml溶解，过滤，收集滤液。用5kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为5000ml。缓慢加入800ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入480ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.00，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，5℃左右透析3天，每12小时换水一次(每12小时换水一次，水温控制在5℃左右)。
取出透析液，加入200克硅藻土，用布氏漏斗加一层澄清板、一层中速滤纸过滤，得滤液，滤液用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，进冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得结晶胰蛋白酶成品121102，共计500g。
实施例17
胰蛋白酶原料批号120903，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，胰蛋白酶原料是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于10％；胰蛋白酶原料投料4500g，先用5倍量(V/W)纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，以助其溶解。计量溶液体积，按415g/L比例加固体硫酸铵入其中，使之达0.7饱和度，待其溶解后，静置沉淀8小时。将溶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，称量滤饼重量10000g，按滤饼重的3倍量(V/W)补加纯化水30000ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调pH至3.0，加入液体硫酸铵20000ml，使之达0.4饱和度，静置沉淀16小时。将溶液用离心机离心，3000rpm，离心20分钟，量取上清液体积53000ml，加入等倍量(V/V)饱和硫酸铵，达0.7饱和度，静置沉淀16小时。
将上清液弃去，沉淀物用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，并在滤饼上加入15毫升饱和硫酸镁溶液，抽干，将滤饼取出，待活化。按每批3Kg量计算做活化，将滤饼溶于4倍量(V/W)0.005mol/L盐酸溶液，待完滤饼全溶解后调溶液pH至3.0，将溶液至于冰箱(4℃)放置1小时，1小时后加入5倍量(V/W)pH8.0，0.8mol/L硼酸缓冲液及8倍量(V/W)纯化水，再加入2倍量(V/W)1mol/L氯化钙溶液，使溶液总体积为滤饼的20倍量(V/W)，用5mol/L氢氧化钠调pH至7.6，加1％结晶胰蛋白酶进行72小时活化，将溶液放置冰箱(4℃)中静置，24小时后测pH值，控制pH在7.6左右。
活化后的溶液用2.5mol/L硫酸调pH至3.1，再按242g/L加入固体硫酸铵20570g，搅拌溶解，置5℃存放48小时后用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤，滤液按205g/L加入固体硫酸铵17835g，使达0.7饱和度，置5℃处存放20小时。
将0.7饱和液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得滤饼，再按其1.5倍量(V/W)加入pH9.0，0.8mol/L硼酸缓冲液，用2.5mol/L硫酸溶液调pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中(4℃)，结晶(外透)120小时。
取出结晶液用布氏漏斗加三层中速滤纸过滤得结晶物4300g，加纯化水43000ml溶解，过滤，收集滤液。用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为6600ml。缓慢加入700ml0.4mol/L的4℃磷酸钠溶液，搅拌，再缓慢加入420ml1mol/L4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.90，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，5℃左右透析3天，每12小时换水一次(每12小时换水一次，水温控制在5℃左右)。
取出透析液，加入200克硅藻土，用布氏漏斗加一层澄清板、一层中速滤纸过滤，得滤液，滤液用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，进冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得结晶胰蛋白酶成品121103，共计520g。
实施例18
实施例15～17中的三批次胰蛋白酶内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定，检测结果如下表16所示，其中阴性对照品为注射用水，阳性对照品为内毒素标准品(购于中国食品药品检定研究院)。
表16三批胰蛋白酶成品内毒素检测结果
| 批号 | 编号 | 内毒素含量(EU/1单位) | 阴性对照 | 阳性对照 |
| 121101 | 实施例15 | 0.000011 | -- | ++ |
| 121102 | 实施例16 | 0.000017 | -- | ++ |
| 121103 | 实施例17 | 0.000036 | -- | ++ |
目前2010版药典对胰蛋白酶内毒素暂无规定，参照与其功能类似，同为肌肉注射类药物糜蛋白酶相关标准，三批次胰蛋白酶符合规定(2010版药典规定，每1单位糜蛋白酶中含内毒素的量应小于0.075EU)。
实施例19
胰蛋白酶原料批号120901，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，胰蛋白酶原料是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其纯度不应低于10％；胰蛋白酶原料4000g经多步盐析、结晶、过滤、活化、盐析、结晶(具体方法参照实施例15)后的滤饼10倍量纯化水溶解，留样1000ml待测，其余经一步超滤之后得到超滤液(具体操作参照实施例15)。超滤液平均分成若干份，依次加入0.1倍超滤液体积的磷酸钠、醋酸钙溶液，分别达到磷酸根与钙离子摩尔终比例10︰1、5︰1、2︰1、1︰1.5、1︰2、1︰5、0。用2.5MNaOH调节pH至8.2，4℃搅拌10分钟；3000rpm转速条件下，冷冻离心15分钟，收集合并滤液，参照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”检测内毒素含量，部分上述滤液经透析后冻干，参照2010版药典检测胰蛋白酶质量指标。
表17磷酸钙沉淀对超滤前后样品内毒素的去除水平
由表17可以看出，超滤浓缩在不影响胰蛋白酶效价的前提下可有效提高溶液中内毒素浓度，内毒素由超滤前4170EU/ml提高到26680EU/ml，使内毒素得到有效富集，利于提高后续磷酸钙沉淀内毒素去除率，未超滤胰蛋白酶溶液内毒素去除率为99.851％，超滤后胰蛋白酶溶液内毒素去除率提高到99.993％。
表18不同磷酸根、钙离子情况下内毒素去除水平
注：2010版中国药典二部规定，胰蛋白酶效价不应低于2500U/mg。
由表18可以看出，通过磷酸盐和钙离子反应生成磷酸钙凝胶可有效去除胰蛋白酶中存在的内毒素，其中磷酸根离子与钙离子最佳反应比例为1︰1.5，内毒素去除率可以高于99.99％。磷酸根过量不利于胰蛋白酶中内毒素去除，且会影响胰蛋白酶效价。钙离子过量在不影响胰蛋白酶效价的前提下可有效去除内毒素，但会造成胰蛋白酶澄清度不符合规定。
Claims (10)
1.一种去多肽中的内毒素的方法，其包括下述步骤：将多肽粗品溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可；所述的多肽粗品为玻璃酸酶粗品、绒促性素粗品、尿促性素粗品或促皮质素粗品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的绒促性素粗品进行下述前处理：加入醋酸钠缓冲液溶解，离心，上清液依次加入聚乙二醇辛基苯基醚、磷酸三丁酯，搅拌，上述溶液通过Spff柱层析进行纯化，洗脱液过滤后加入乙醇，静置，离心，即可；
所述的促皮质素粗品进行下述前处理：加入丙酮和盐酸，离心，即可。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超滤浓缩采用的超滤膜为德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜，截留相对分子质量是5kDa或10kDa；
和/或，所述的超滤浓缩得到的浓缩液的体积为超滤浓缩前体积的0.1～0.3倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐为磷酸钠和/或磷酸钾；
和/或，所述的钙盐为醋酸钙和/或氯化钙。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐水溶液与所述的浓缩液的体积比为(0.1～0.2)：1；
和/或，所述的钙盐水溶液与所述的磷酸盐水溶液的体积比为(0.5～0.7)：1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐水溶液的浓度为0.2～0.5mol/L；
和/或，所述的钙盐水溶液的浓度为0.8～1.5mol/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比为1：(0.5～2)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比为1：1.5。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为3000～4000rpm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心为冷冻离心10～30min；所述的冷冻离心的温度较佳地为4～10℃。
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