CN114790439A - 牛奶外泌体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物大分子提取纯化领域，特别涉及牛奶外泌体及其制备方法。本发明提出了柠檬酸钠溶解蛋白法，磷酸钠沉淀蛋白法，EDTA沉淀蛋白法和硫酸铵沉淀蛋白法去除酪蛋白，并进行了详细摸索，去除酪蛋白之后后续应用切向流超滤法可实现其他杂蛋白的去除以至10mL到几千升样品的初纯与浓缩，接着利用色谱柱进行精细纯化，可实现牛奶外泌体的大规模制备，并且与超离法和试剂盒法相比产量高，纯度高。

Description

牛奶外泌体及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物大分子提取纯化领域，特别涉及牛奶外泌体及其制备方 法。
背景技术
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将 其命名为"exosome"。现今，其特指直径在30-150nm的球状囊泡。多种细胞 在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内 陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其 特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中 被发现，1987年Johnstone将其命名为"exosome"。多种细胞在正常及病理状 态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体， 经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
目前现有的外泌体纯化技术主要有以下几种方法
1、超速离心法(差速离心)
超离法是最常用的外泌体纯化手段，是外泌体提取的金标准，但规模较 小，过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到 质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。
2、密度梯度离心
在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层， 是一种区带分离法。密度梯度离心存在的问题是步骤繁琐，耗时。
3、超滤离心
超滤离心法提取外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效 率较低。
4、磁珠免疫法
磁珠法提取外泌体效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不 利于下游实验，难以广泛普及。
5、PEG-base沉淀法
聚乙二醇(PEG)沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂 蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或 者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等。
6、试剂盒提取
商业化的外泌体提取试剂盒，提取外泌体规模小，并且会产生很多杂蛋 白，外泌体纯度和回收率低。
以上几种外泌体提取方法都存在操作规模小，外泌体的纯度和回收率低， 难以规模化生产的问题。牛奶外泌体的提取相对于其他外泌体的提取最重要 的在于牛奶样品中酪蛋白的去除。对于牛奶中酪蛋白的去除文献中也有柠檬 酸去除法，磷酸钠沉淀法，EDTA去除法，用这些方法处理后都是用的超离 法进行后续一步外泌体的提取。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了牛奶外泌体及其制备方法。该方法能够实现外 泌体的大规模制备，并且操作简单，纯度和回收率高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、前处理；
步骤2、初步纯化、浓缩；
步骤3、精纯；
所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白；
所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤；
所述精纯包括CIMmultus QA柱纯化、Capto柱纯化、S400分子筛色谱法 纯化中的一种或两者以上的组合。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中去除脂肪包括：
(1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪；和/或
(2)采用离心的方法去除脂肪；
所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白 法和/或沉淀蛋白法；
所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法；
所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉 淀蛋白法中的一种或两者的组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述柠檬酸钠溶解法包括如下步骤： 取等体积的牛奶与质量浓度为2％～16％的柠檬酸钠溶液混合，冰浴震摇，滤 膜过滤。
所述柠檬酸钠溶解法具体为：将等体积的牛奶倒入质量浓度为2％～16％ 的柠檬酸钠溶液中，摇床冰浴震摇60min，牛奶样品均变澄清，将澄清的牛奶 样品用0.2μm滤膜进行过滤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述EDTA沉淀蛋白法包括如下步骤： 取等体积的牛奶与EDTA溶液混合，室温静置，离心，滤膜过滤；所述EDTA 溶液的浓度为0.15M～0.35M，pH值为6.0～7.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述柠檬酸钠溶解法具体为：取等体 积的牛奶倒入EDTA溶液中，室温沉淀，静置15min，沉淀后的牛奶样品 12000rpm，离心40min，接着将上清用0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤；或 不离心，直接使用囊式滤器进行过滤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M～2.0M， pH值为5.2～8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M，pH值 为5.3、6.5或7.6；或
所述磷酸钠溶液的浓度为1M，pH值为5.2、6.3或pH 7.6；或
所述磷酸钠溶液的浓度为2.0M，pH值为6.0、pH 7.0或pH 8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤：
不同的牛奶种类，磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同：
(1)全脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶与磷酸钠溶液 混合，搅拌，沉淀，-80℃冷冻；
(2)脱脂牛奶
将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，室温静置，于3500rpm 离心10min，收集上清经滤膜过滤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠沉淀蛋白法具体包括如下 步骤：取牛奶16000rpm，离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶倒入磷酸钠 溶液中，磁力搅拌器350rpm，搅拌15min，沉淀后的牛奶样品3500rpm，离 心10min，接着将上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述硫酸铵沉淀蛋白法包括如下步骤： 取等体积的牛奶与硫酸铵溶液混合，25℃～50℃静置，离心，滤膜过滤；所述 硫酸铵溶液的浓度为3.0M～6.0M。
在本发明的一些具体实施方案中，所述硫酸铵沉淀蛋白法包括如下步骤： 取等体积的牛奶与硫酸铵溶液混合，25℃静置，离心，滤膜过滤；所述硫酸 铵溶液的浓度为3.0M。
在本发明的一些具体实施方案中，所述硫酸铵沉淀蛋白法具体包括如下 步骤：将等体积的牛奶倒入硫酸铵溶液中，边倒边轻轻用玻璃棒搅拌，室温 进行沉淀，静置1.5h，沉淀后的牛奶样品6000rpm，离心20min，接着将上清 依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述切向流超滤法采用截留分子量为 300KD的中空纤维柱或截留分子量为750KD的中空纤维柱。
在本发明的一些具体实施方案中，所述Capto柱纯化采用Core400柱或 Core700柱。
在本发明的一些具体实施方案中，所述S400分子筛色谱法纯化采用 HiPrep 16/60-S400-HR柱。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括：
(I)、柠檬酸钠溶解蛋白、TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、 Capto Core700柱纯化；或
(II)、EDTA沉淀蛋白、TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
(III)、磷酸钠沉淀蛋白、截留分子量为300KD的中空纤维柱TFF切向 流超滤、CIMmultus QA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
磷酸钠沉淀蛋白、截留分子量为300KD的中空纤维柱TFF切向流超滤、 CIMmultusQA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(IV)、磷酸钠沉淀蛋白、截留分子量为750KD的中空纤维柱TFF切向 流超滤、CIMmultus QA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
磷酸钠沉淀蛋白、截留分子量为750KD的中空纤维柱TFF切向流超滤、 CIMmultusQA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(V)、硫酸铵沉淀蛋白、截留分子量为300KD的中空纤维柱TFF切向 流超滤、CIMmultus QA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
硫酸铵沉淀蛋白、截留分子量为300KD的中空纤维柱TFF切向流超滤、 CIMmultusQA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(VI)、硫酸铵沉淀蛋白、截留分子量为750KD的中空纤维柱TFF切向 流超滤、CIMmultus QA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
硫酸铵沉淀蛋白、截留分子量为750KD的中空纤维柱TFF切向流超滤、 CIMmultusQA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(VII)、硫酸铵沉淀蛋白、截留分子量为750KD的中空纤维柱TFF切 向流超滤、Capto Core700柱纯化；或
硫酸铵沉淀蛋白、截留分子量为750KD的中空纤维柱TFF切向流超滤、 HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化。
需要指出的是，本发明中离心可以用过滤的操作替代。所述过滤包括深 层过滤和/或囊式滤器过滤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述囊式滤器过滤具体包括如下步骤：
①预冲洗：用超纯水以3L/min流速冲洗10分钟；
②安装滤器到蠕动泵例如AKTA FLUX系统，确保流向与囊氏滤器组件 上的流向箭头一致；
③将滤器竖直摆放，排气阀在整个囊式滤器的最高点，利于排气；
④设置流速500mL/min，耐压5bar；
⑤松开排气阀，同时将缓冲液充进滤器，使滤器上游充满液体，并排尽 壳体内的空气；
⑥空气排尽后缓慢拧紧排气阀开始过滤料液，注意参数，切勿超过滤器 允许的压力上限；
⑦过滤完毕，加压(空气)把滤器上游面未过滤的部分液体进行过滤， 减少滤器内料液残留；
⑧过滤完毕后用2L超纯水冲洗滤器，然后更换2L 0.5M NaOH冲洗，最 终用0.1MNaOH冲洗保存。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的制备方法制得的牛奶外泌 体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述牛奶外泌体的粒径分布介于 30～150nm之间。
本发明还提供了所述的牛奶外泌体在制备治疗结肠炎或抑制免疫细胞炎 症反应的药物中的应用。
此外，本发明还提供了药物，包括所述的牛奶外泌体以及药学上可接受 的辅料或佐剂。该药物的剂型可以为药物领域的所有剂型，本发明在此不做 限定，均在本发明的保护范围之内。
本发明提出了柠檬酸，磷酸钠沉淀法，EDTA沉淀蛋白法去除酪蛋白， 并且提出硫酸铵去除酪蛋白方法，并进行了详细摸索，去除酪蛋白之后后续 应用切向流超滤法可实现其他杂蛋白的去除以至10mL到几千升样品的初纯 与浓缩，接着利用色谱柱进行精细纯化，可实现牛奶外泌体的大规模制备， 并且与超离法和试剂盒法相比产量高，纯度高。
本发明的有益效果包括但不限于：
1)、对于牛奶样品的前处理部分，采用不同的方法对牛奶中蛋白进行沉 淀或溶解；
2)、利用切向流超滤与色谱法结合可实现大规模制备，实现工业化生产；
3)、利用切向流超滤与色谱法结合能获得产量高纯度高的外泌体产品；
4)、利用HPLC进行验证此纯化方法通用性广，重复性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示硫酸铵浓度的摸索实验结果；其中，图1(A)示硫酸铵浓度对TFF (切向流超滤)前后蛋白浓度的影响；图1(B)示硫酸铵浓度对NanoFCM检 测的外泌体颗粒浓度的影响；
图2示QA柱纯化的结果；其中，图2(A)示截留分子量为300KD的中空 纤维柱处理的牛奶样品用QA柱纯化的结果；图2(B)示截留分子量为750KD 的中空纤维柱处理的牛奶样品用QA柱纯化的结果；
图3示利用HPLC验证不同处理方法纯化得到的牛奶外泌体纯度；其中， 图3左上角示HPLC验证磷酸钠处理TFF初纯的牛奶外泌体纯度；图3右上角示 HPLC验证硫酸铵处理TFF初纯的牛奶外泌体纯度；图3左下角示HPLC验证超 离法得到的牛奶外泌体纯度；图3右下角示HPLC验证商品化试剂盒法得到的 牛奶外泌体纯度；
图4示利用投射电镜验证不同处理方法纯化得到的牛奶外泌体形态与纯 度；其中，图4(A)示TEM验证磷酸钠处理TFF初纯的牛奶外泌体纯度；图4 (B)示TEM验证硫酸铵处理TFF初纯的牛奶外泌体纯度；图4(C)示TEM验 证超离法得到的牛奶外泌体纯度；
图5示摸索不同的QA-B液对洗脱峰的影响；其中，图5(A)示QA柱纯化 结果(先采用20％B液洗脱，再用20％-100％B液梯度洗脱)；图5(B)示QA 柱纯化结果(直接采用0％-100％B液梯度洗脱)；
图6示摸索不同的Capto core柱的纯化效果；其中图6(A)示Core400柱纯 化结果；图6(B)示Core400柱纯化得到的牛奶外泌体利用HPLC分析结果； 其中图6(C)示Core700柱纯化结果；图6(D)示Core700柱纯化得到的牛奶 外泌体利用HPLC分析结果；
图7示HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化并用HPLC进行验证；其中，图7(A) 示HiPrep16/60-S400-HR柱纯化结果；图7(B)示HiPrep 16/60-S400-HR柱纯 化收集峰1利用HPLC分析结果；
图8示利用WB对纯化得到的牛奶外泌体进行表征；
图9示其中，图9(A)示透射电镜检测图；图9(B)示扫描电镜检测图；
图10示外泌体活性检测(入胞实验)；其中，图10(A)示不同时间细胞 对外泌体的内吞量；图10(B)示不同细胞对外泌体的内吞量；
图11示NanoFCM检测不同方法纯化的外泌体的粒径分布；其中，图11(A) 示磷酸钠处理纯化的牛奶外泌体粒径分布；图11(B)示硫酸铵处理纯化的牛 奶外泌体粒径分布；图11(C)示超离法处理纯化的牛奶外泌体粒径分布；图11(D)示商品化试剂盒处理纯化的牛奶外泌体粒径分布；
图12示不同纯化方法所得的牛奶外泌体的产量与纯度比较；图12(A)示 不同纯化方法所得的牛奶外泌体的产量比较；图12(B)示不同纯化方法所得 的牛奶外泌体的纯度比较；
图13示TFF+SEC纯化不同品牌牛奶milk EV-HPLC-A210叠加图；
图14示TFF+SEC三元脱脂牛奶三次重复实验milk EV-HPLC-A210叠加；
图15示柠檬酸钠法300KD中空纤维柱滤出液蛋白浓度随着时间变化曲线 图；
图16示柠檬酸钠法CIMmultus QA色谱图；
图17示柠檬酸钠法Capto Core 700精纯色谱图；
图18示EDTA沉淀法CIMmultus QA色谱图；其中，图18(A)示0.15M EDTA_CIMmultusQA-1纯化色谱图；图18(B)示0.25M EDTA_CIMmultus QA-1纯化色谱图；图18(C)示0.35MEDTA_CIMmultus QA-1纯化色谱图；
图19示EDTA沉淀法Capto Core 700精纯色谱图；
图20示磷酸钠沉淀法300KD中空纤维柱滤出液蛋白浓度随时间变化曲线 图；
图21示磷酸钠沉淀法CIMmultus QA色谱图；
图22示磷酸钠沉淀法Capto Core 700精纯色谱图；
图23示磷酸钠沉淀法300KD中空纤维柱滤出液蛋白浓度随时间变化曲线 图；
图24示磷酸钠沉淀法CIMmultus QA色谱图；
图25示磷酸钠沉淀法HiPrep 16/60-S400-HR精纯色谱图；
图26示磷酸钠沉淀法750KD中空纤维柱滤出液蛋白浓度随时间变化曲线 图；
图27示磷酸钠沉淀法CIMmultus QA色谱图；
图28示磷酸钠沉淀法HiPrep 16/60-S400-HR精纯色谱图；
图29示硫酸铵沉淀法300KD中空纤维柱滤出液蛋白浓度随时间变化曲线 图；
图30示硫酸铵沉淀法CIMmultus QA色谱图；
图31示硫酸铵沉淀法750KD中空纤维柱滤出液蛋白浓度随时间变化曲线 图；
图32示硫酸铵沉淀法CIMmultus QA色谱图；
图33示硫酸铵沉淀法750KD中空纤维柱滤出液蛋白浓度随时间变化曲线 图；
图34示硫酸铵沉淀法CIMmultus QA色谱图；
图35示硫酸铵沉淀法HiPrep 16/60-S400-HR柱色谱图；
图36示硫酸铵沉淀法Capto Core700色谱图；
图37示硫酸铵沉淀法Capto Core700色谱图；
图38示硫酸铵沉淀法截留分子量为750KD的中空纤维柱滤出液蛋白浓度 随时间变化曲线图；
图39示硫酸铵沉淀法HiPrep 16/60-S400-HR柱色谱图；
图40示不同浓度牛奶外泌体对DSS小鼠溃疡性结肠炎的治疗效果；
图41示牛奶外泌体能抑制免疫细胞炎症反应。
具体实施方式
本发明公开了牛奶外泌体及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明 的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本 发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组 合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的牛奶外泌体及其制备方法中，所用原料及试剂均可由市场 购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1牛奶的前处理(主要是在于去除蛋白)
1)溶解蛋白法：柠檬酸钠溶解法
原理：柠檬酸钠对Ca2+、Mg2+等金属离子具有良好的络合能力，并具有 极好的溶解性能可以使蛋白溶解
操作步骤：配制不同浓度的柠檬酸钠溶液(2％，4％，6％，8％，16％)， 将等体积的牛奶倒入柠檬酸钠溶液中，摇床冰浴震摇60min，牛奶样品均变澄 清，将澄清的牛奶样品用0.2μm滤膜或囊式滤器进行过滤。
表1不同浓度的柠檬酸钠
Solution 14 2％柠檬酸钠 50mL g 1
Solution 15 4％柠檬酸钠 50mL g 2
Solution 16 6％柠檬酸钠 50mL g 3
Solution 17 8％柠檬酸钠 50mL g 4
Solution 18 16％柠檬酸钠 50mL g 8
表2不同浓度柠檬酸钠处理后样品的过滤阻力与澄清度
Figure BDA0002914540500000101
对于柠檬酸钠溶解蛋白法，2％柠檬酸钠溶解蛋白最为合适。
结论：不同浓度的柠檬酸钠均能较好的溶解蛋白，利用0.2μm的滤膜进 行过滤较好过滤，低浓度就能达到很好的效果，优先选择2％的浓度。
2)沉淀蛋白法：EDTA沉淀蛋白法
原理：蛋白的主要离子是钙离子，EDTA可以螯合钙离子，蛋白不稳定 产生聚集进而产生沉淀
操作步骤：分别配制0.15M(pH6.0，pH7.0，pH8.0)，0.25M(pH6.0， pH7.0，pH8.0)，0.35M(pH6.0，pH7.0，pH8.0)的9种溶液，将等体积的 牛奶倒入EDTA溶液中，室温沉淀，静置15min，沉淀后的牛奶样品12000rpm， 离心40min，接着将上清用0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
表3不同浓度不同pH的EDTA
EDTA浓度(M) pH值
溶液-1 0.15 6.0
溶液-2 0.15 7.0
溶液-3 0.15 8.0
溶液-4 0.25 6.0
溶液-5 0.25 7.0
溶液-6 0.25 8.0
溶液-7 0.35 6.0
溶液-8 0.35 7.0
溶液-9 0.35 8.0
表4不同浓度pH的EDTA处理后样品的过滤阻力与澄清度
Figure BDA0002914540500000111
Figure BDA0002914540500000121
结论：根据过滤阻力与澄清度两个指标，对于EDTA沉淀蛋白法，0.35M pH7.0时效果较好。
3)沉淀蛋白法：磷酸钠沉淀蛋白法
原理：蛋白的主要离子是钙离子，磷酸钠中的磷酸根与钙离子结合能力 更强，酪蛋白不稳定出现沉淀
操作步骤：分别配制0.5M(pH5.3，pH6.5，pH7.6)，1.0M(pH5.2，pH6.3， pH7.6)，2.0M(pH6.0，pH7.0，pH8.0)的9种溶液，牛奶16000rpm，离心 30min去除脂肪，将等体积的牛奶倒入磷酸钠溶液中，磁力搅拌器350rpm， 搅拌15min，沉淀后的牛奶样品3500rpm，离心10min，接着将上清依次用 0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤
结果：都出现了沉淀，将样品3500rpm，离心10min，上清依次用0.8μm， 0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
表5不同浓度pH的磷酸钠处理后样品的过滤阻力与澄清度
Figure BDA0002914540500000122
Figure BDA0002914540500000131
结论：根据过滤阻力和澄清度两个指标，NaPO4沉淀法最适条件是1M， pH6.3时沉淀蛋白效果最好，对于全脂牛奶和脱脂牛奶的处理稍有不同。
结论：Na3PO4沉淀法经过-80℃可省去第二步的低速离心。
4)沉淀蛋白法：硫酸铵沉淀蛋白法
原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破 坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来
操作步骤：分别配制1.0M，2.0M，3.0M，4.0M，6.0M的5种溶液，将 等体积的牛奶倒入硫酸铵溶液中，边倒边轻轻用玻璃棒搅拌，室温进行沉淀， 静置1.5h，沉淀后的牛奶样品6000rpm，离心20min，接着将上清依次用0.8μm， 0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤
结果：1.0M，2.0M没有出现沉淀，3.0M，4.0M，6.0M出现沉淀，沉淀 后的牛奶样品6000rpm，离心20min，上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的 滤膜进行过滤，其中3.0M和6.0M较好过滤，上清较为澄清，再根据TFF(切 向流超滤)前后蛋白浓度以及NanoFCM检测的外泌体颗粒浓度(如图1A、 图B所示)进行选择最终牛奶样品沉淀硫酸铵浓度。
表6不同浓度的硫酸铵处理后样品的过滤阻力与澄清度
Figure BDA0002914540500000132
Figure BDA0002914540500000141
结论：由于6.0M的硫酸铵沉淀蛋白浓度过高，将外泌体也一并沉淀，因 此综合以上硫酸铵沉淀蛋白的浓度选择3.0M。
硫酸铵沉淀蛋白温度的摸索
(1)实验步骤
表7
Figure BDA0002914540500000142
(2)实验结果
表8
Figure BDA0002914540500000143
Figure BDA0002914540500000151
硫酸铵可有效沉淀去除牛奶中蛋白。
实施例2前处理样品的初纯与浓缩
TFF(切向流超滤)的具体操作步骤：利用AKTA Flex系统进行切向流 超滤。
表9
Figure BDA0002914540500000152
结论：如图2(A)、图2(B)所示，从QA柱流穿的结果可以看出，750KD 中空纤维柱处理的牛奶样品流穿基本没有吸收峰，说明截留分子量为750KD 的中空纤维柱去杂蛋白效果更好。
将磷酸钠-TFF和硫酸铵-TFF初纯的样品与超离法(外泌体提取的金标准) 和商品化试剂盒法进行比较：
结论：如图3所示利用HPLC对不同EV提取方法进行验证，从图中可以 看出磷酸钠和硫酸铵处理的杂蛋白峰更少，目的峰更明显。图4所示，利用 用透射电镜对不同外泌体提取方法进行验证，从图中可以看出磷酸钠-TFF和 硫酸铵-TFF初纯处理的相比与超离法背景更干净，外泌体样品密度高。商品 化试剂盒法由于背景太杂，导致电镜拍摄结果失败。
实施例3初纯样品的精纯：对不同柱子进行摸索
1)CIMmultus QA柱：是一个阴离子交换柱，外泌体的表面带有负电， 因此会结合在CIMmultus QA柱上，再利用不同的盐浓度将外泌体洗脱下来 CIMmultus QA柱具体操作步骤：利用AKTA蛋白纯化系统进行纯化。
表10
Figure BDA0002914540500000161
初始摸索0-20％B液进行洗脱，再用20-100％进行洗脱，如图5(A)所 示，一共出现3个峰，利用Cytoflex流式仪进行检测，发现峰3的颗粒数浓 度和纯度较高。
后期改为直接利用0-100％进行洗脱，如图5(B)所示出现一个峰，利用 NanoFCM进行检测，颗粒数浓度与纯度都较高。
2)Capto柱：
Capto柱具体操作步骤：利用AKTA蛋白纯化系统进行纯化。
表11
Figure BDA0002914540500000162
Figure BDA0002914540500000171
结论：用HPLC对Core400柱和Core700柱纯化的样品进行验证，如图 6A～图6D所示，Core700纯化得到的样品更纯。
3)HiPrep 16/60-S400-HR柱：
HiPrep 16/60-S400-HR柱具体操作步骤：利用AKTA蛋白纯化系统进行 纯化。
表12
Figure BDA0002914540500000172
结论：S400纯化结果如图7(A)，用HPLC对S400柱纯化的样品进行 验证，如图7(B)所示，S400纯化得到的样品保留时间在7.5左右，并且基 本没有杂质峰，得到的样品较纯。
实施例4
对精纯外泌体进行表征以及活性检测，确定提取的是外泌体，并且有活 性，同时产量高纯度高。
1)外泌体特异性蛋白的表征(WB检测)
如图8所示。从图中可以看出磷酸钠处理和硫酸铵处理得到的EV都含 有标志物CD81，Alix，TSG101。
2)、外泌体形态的表征(电镜检测)
如图9(A)，9(B)所示。结论：TFF+SEC精纯牛奶外泌体的电镜样品 背景很干净，外泌体的形态清晰。
3)、外泌体活性检测(入胞实验)
如图10(A)，10(B)所示，共孵育四小时后大部分细胞均有外泌体进 入胞内，显示外泌体样品经纯化后保留了天然的入胞活性。
实施例5
分组——实验组1：磷酸钠-SEC；实验组2：硫酸铵-SEC；对照组1：超 离法；对照组2：商品化试剂盒(华盈生物外泌体提取试剂盒)。
结果如图11所示。
图11显示：不同处理方法得到的MilkEV粒径分布不同，粒径分布都在 30-150nm之间。磷酸钠-SEC和硫酸铵-SEC得到的EV分布较为集中，超离 法和试剂盒法分散较为广泛，并且超离法在150nm之后还有分布。
图12显示：磷酸钠和硫酸铵纯化得到的Milk EV产量与纯度远高于超离 和试剂盒提取。
图13显示：利用TFF+SEC对不同品牌的牛奶进行纯化，发现得到的milk EV基本都没有杂质峰，证明得到的样品较纯，方法通用性广。
图14显示：利用TFF+SEC对三元脱脂牛奶进行三次重复实验milk EV 保留时间基本一致，说明EV提取方法的重复性较好。
实施例6柠檬酸钠法制备牛奶外泌体
将牛奶加入柠檬酸钠溶液中进行蛋白溶解，随后采用TFF(切向流超滤) 进行初纯与浓缩，接着再采用CIMmultus QA柱和Capto Core700柱两次精纯， 各阶段的实施步骤如下：
1柠檬酸钠沉淀蛋白及TFF
(1)取250mL脱脂牛奶4℃16000rpm离心30min，去除沉淀和上层脂 蛋白；
(2)取250mL 2％(质量体积比(w/v))柠檬酸钠溶液放入烧杯中，将250mL 牛奶缓慢加入250mL 2％柠檬酸钠溶液的烧杯中，冰浴搅拌2h；
(3)先用0.8μm滤膜进行过滤，再用0.45μm滤膜进行过滤；
(4)处理完成后的样品用300KD的中空纤维柱进行TFF与浓缩，将 500mL样品用中空纤维柱浓缩至200mL，然后用2L的1％(质量体积比(w/v)) 柠檬酸钠对样品不断地进行置换，直到样品置换浓缩至100mL；
(5)然后再加入300mL的QA-A液(20mM Tris+100mM NaCl)进行置 换，最后将样品置换浓缩至50mL；
(6)收集样品，再用10mL的QA-A液(20mM Tris+100mM NaCl)冲 洗管路与中空纤维柱，收集收集截留液体，并与步骤(5)所得50mL浓缩液 合并获得约60mL样品液；
(7)切向流超滤与浓缩过程中，每隔半小时监测并记录滤出端液体蛋白 浓度，经过大约4.5h，滤出液蛋白浓度降至0mg/mL，遂收集截留段液体， 记录如表13和图15所示：
表13柠檬酸钠法300kD中空纤维柱滤出液蛋白浓度变化数据表
Figure BDA0002914540500000191
2 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出放 室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)冲洗完成后更换CIMmultus QA-A液(20mM Tris+100mM NaCl)， 洗泵后继续用QA-A液平衡柱子5个柱体积；
(3)将上步收集好的样品以10mL/min流速上CIMmultus QA柱；
(4)上样结束后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(5)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液20mM Tris+1M Nacl)梯度洗脱 (10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(6)分别合并收集各吸收峰组分，如图16。
(7)CIP：对柱子进行在线清洗，流速10mL/min(30％异丙醇，1M NaOH+2M NaCl，1M醋酸铵，各清洗5个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲 洗，于4℃保存。
3 Capto Core 700精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，pump wash洗泵后继续 用超纯水以2mL/min流速冲洗系统，连接Capto Core 700柱，超纯水冲洗5 个柱体积；
(2)冲洗完成后更换Capto Core 700平衡和洗脱液(PBS)，洗泵后继 续用PBS溶液平衡柱子5个柱体积；
(3)将上步QA柱得到的样品浓缩，以3mL/min流速上柱，每次上样 0.5CV，收集流穿样品，如图17所示；
(4)上样结束后，用PBS溶液平衡柱子至基线稳定(3个CV)；
(5)调整流速2mL/min，用B液(30异丙醇+1M NaOH)对柱子进行在 位清洗CIP；
(6)超纯水洗3个CV，更换20％乙醇冲洗3个CV，于4℃保存；
(7)收集的牛奶外泌体利用液氮进行速冻，速冻结束放入-80℃冰箱进行 保存。
4外泌体检测
得到的产品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为Skim-milk_QA(8)-P1_Core700的颗粒数为7.14E+9/mL，纯度为 53.33％，Skim-milk_QA(8)-P2_Core700的颗粒数为2.61E+9/mL，纯度为 91.51％。
实施例7 EDTA沉淀蛋白法
将牛奶加入EDTA溶液中进行蛋白沉淀，随后采用CIMmultus QA柱和 Capto Core700柱进行纯化，各阶段的实施步骤如下：
1 EDTA沉淀蛋白
(1)150mL脱脂牛奶4℃12000rpm离心30min；
(2)去除沉淀后分成9份加入等体积的不同浓度不同pH值的EDTA溶 液。室温静置15min，然后4℃12000rpm离心40min；
表14不同浓度不同pH EDTA溶液
Figure BDA0002914540500000201
Figure BDA0002914540500000211
(3)离心取上清，依次用0.45μm、0.22μm滤膜进行过滤。
2 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出 放室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)冲洗完成后更换CIMmultus QA-A液(20mM Tris+100mM NaCl)， 洗泵后继续用QA-A液平衡柱子10个柱体积；
(3)将上步收集好的样品以5mL/min流速上CIMmultus QA柱；
(4)上样结束后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(5)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液：20mM Tris+1M Nacl)梯度洗 脱(10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(6)分别合并收集各吸收峰组分，如图18A-图18C。
结果显示：不同条件的EDTA处理最大的差异是0.35M EDTA和0.25M EDTA pH8.0处理的样本在QA柱纯化时减少一个峰。从不同处理条件得到的 峰的A210、A280、A260两两比值来看，每个峰对应的成分一致。
(7)CIP：对柱子进行在线清洗，流速10mL/min(1M NaOH+2M NaCl， 1M醋酸铵，各清洗10个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲洗，于4℃保存。 2.3 Capto Core 700精纯。
针对上述出峰位置的样品进行Capto Core 700精纯，具体步骤如下所述：
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，pμmp wash洗泵后继续 用超纯水以2mL/min流速冲洗系统，连接Capto Core 700柱，超纯水冲洗5 个柱体积；
(2)冲洗完成后更换Capto Core 700平衡和洗脱液，洗泵后继续用PBS 溶液平衡柱子5个柱体积；
(3)将上步QA柱得到的样品浓缩，以2mL/min流速上柱，每次上样 0.5CV，收集流穿样品，用液氮进行速冻，速冻结束放入-80℃冰箱进行保存。 色谱图如图19所示；
(4)上样结束后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定(3个CV)；
(5)调整流速2mL/min，用B液对柱子进行在位清洗CIP；
(6)超纯水洗3个CV，更换20％乙醇冲洗3个CV，于4℃保存。
4外泌体检测
结果显示，过滤阻力0.35M，pH7.0最容易过滤且杂峰少，故针对该样品 进行CytoFlex流式细胞仪检测，结果显示：其颗粒数浓度为5.65E+10/mL， 纯度为42.58％。
实施例8磷酸钠沉淀蛋白法1
将牛奶加入磷酸钠溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流超滤 (300KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用QA柱和Core700柱两 次精纯，各阶段的实施步骤如下：
1磷酸钠沉淀蛋白
(1)取250mL三元脱脂牛奶4℃16000rpm离心30min，去除沉淀和上 层脂蛋白；
(2)先取250mL 1M，PH 6.3磷酸钠溶液放入烧杯中，烧杯放入冰盒中， 再将冰盒放在磁力搅拌器上，利用转子使溶液旋转起来，将250mL牛奶缓慢 加入250mL 1M pH 6.3磷酸钠溶液中。冰浴摇震15min后放入-80℃冷冻；
(3)过夜后，取出置于37℃水浴锅内解冻，然后3500rpm，离心10min。
(4)取上清依次用0.8μm、0.45μm、0.22μm滤膜进行过滤；
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)样品用2L的磷酸钠缓冲液稀释后，500mL倒入循环瓶中，设置循 环瓶置换体积低于200mL进行补液，溶液进样的泵速120mL/min，持续上样 进行切向流超滤与浓缩，每隔半小时监测并记录滤出端液体蛋白浓度，经过 大约2.0h，滤出液蛋白浓度降至0mg/mL，遂收集截留段液体，记录如表15 和图20所示：
表15磷酸钠沉淀法300KD中空纤维柱滤出液蛋白量变化数据表
时间(30min) 0 30 60 90 120 150
滤出液蛋白量(mg/mL) 2.1 0.55 0.20 0.09 0.00 0.00
(4)浓缩样品至100mL，加入300mL的QA-A液平衡液进行稀释，最 后将样品浓缩至90mL；
(5)收集样品，再用20mLQA-A液(20mM Tris+100mM NaCl)冲洗管 路与中空纤维柱，收集截留液体，并与步骤(4)所得90mL浓缩液合并获得 约110mL样品液。
3 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出 放室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)冲洗完成后更换CIMmultus QA-A液(20mM Tris+100mM NaCl)， 洗泵后继续用QA-A液平衡柱子10个柱体积；
(3)将TFF收集好的样品以10mL/min流速上CIMmultus QA柱；
(4)上样结束后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(5)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液20mM Tris+1M Nacl)梯度洗脱 (10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(6)分别收集各吸收峰组分，样品P1(#2-6)，P2(#7-9)，如图21；
(7)CIP：对柱子进行在线清洗，流速5mL/min(30％异丙醇，1M NaOH+2M NaCl，1M醋酸铵，各清洗5个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲 洗，于4℃保存。
4 Capto Core 700精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接Capto Core 700柱，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)冲洗完成后更换Capto Core 700平衡和洗脱液，洗泵后继续用QA-A 液平衡柱子5个柱体积；
(3)将上步QA柱得到的样品P2(#7-9)，以3mL/min流速上柱，每 次上样0.5CV，收集流穿样品，如图22；
(4)上样结束后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定(3个CV)；
(5)调整流速2mL/min，用B液(30％异丙醇+1M NaOH)对柱子进行 在位清洗CIP；
(6)超纯水洗3个CV，更换20％乙醇冲洗3个CV，于4℃保存；
(7)收集的牛奶外泌体利用液氮进行速冻，速冻结束放入-80℃冰箱进行 保存。
5外泌体检测
得到的产品利用NanoFCM流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为7.90E+10/mL，纯度为85.19％。
实施例9磷酸钠沉淀蛋白法2
将生牛乳加入磷酸钠溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流超滤 (300KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用QA柱和HiPrep 16/60-S400-HR柱两次精纯，各阶段的实施步骤如下：
1磷酸钠沉淀蛋白
(1)将250mL生牛乳从-80℃冰箱拿出放在4度冰箱静置，让生牛乳的 脂肪静置分层；
(2)将250mL生牛乳4℃16000rpm离心30min，去除上层脂蛋白和下 层沉淀；
(3)取250mL 1M，PH 6.3磷酸钠溶液放入烧杯中，烧杯放入冰盒中， 再将冰盒放在磁力搅拌器上，利用转子使溶液旋转起来，将250mL生牛乳缓 慢加入250mL1 M，pH 6.3磷酸钠溶液中。冰浴摇震15min后放入-80℃冷冻；
(4)约2h完全冷冻后取出置于37℃水浴锅内解冻，然后3500rpm，离 心10min；
(5)取上清依次用0.8μm、0.45μm、0.22μm滤膜进行过滤。
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)500mL样品倒入循环瓶中，设置循环瓶体积200mL，样品用QA-A 液平衡液缓冲液进行不断的补液置换，选择合适的泵速120mL/min，持续上 样进行切向流超滤与浓缩，每隔半小时监测并记录滤出端液体蛋白浓度，经 过大约4.0h，滤出液蛋白浓度降至0mg/mL，遂收集截留段液体，记录如表 16及图23：
表16磷酸钠沉淀法300KD中空纤维柱滤出液蛋白量变化数据表
时间(30min) 0 30 60 90 120 150 180 210 240
滤出液蛋白量(mg/mL) 2.59 2.32 1.00 0.37 0.25 0.12 0.07 0.00 0.00
(4)将样品浓缩到100mL，收集流出样品，再用10mL QA-A液冲洗管 路，共收集样品110mL；
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为7.75E+9/mL，纯度为56.67％。
3 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出放 室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)冲洗完成后更换CIMmultus QA-A液(20mM Tris+100mM NaCl)， 洗泵后继续用QA-A液平衡柱子10个柱体积；
(3)将TFF收集好的样品以10mL/min流速上CIMmultus QA柱；
(4)上样结束后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(5)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液20mM Tris+1M Nacl)梯度洗脱 (10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(6)分别收集并合并各吸收峰组分，如图24；
(7)CIP：对柱子进行在线清洗，流速5mL/min(30％异丙醇，1M NaOH+2M NaCl，1M醋酸铵，各清洗5个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲 洗，于4℃保存。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验， QA-P2的颗粒数浓度为3.65E+9/mL，纯度为62.04％。
4 HiPrep 16/60-S400-HR精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接HiPrep 16/60-S400-HR柱，超纯水冲洗1个柱 体积；
(2)冲洗完成后更换PBS平衡缓冲液，洗泵后继续用PBS溶液平衡柱 子1个柱体积；
(3)将上步QA柱得到的样品QA-P2以1mL/min流速上HiPrep 16/60-S400-HR柱，收集样品峰，如图25；
(4)上样结束后，用PBS溶液平衡柱子至基线稳定；
(5)收集的生牛乳外泌体利用液氮进行速冻，速冻结束放入-80冰箱进 行保存。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为5.32E+8/mL，纯度为94.23％。
实施例10磷酸钠沉淀蛋白法3
将生牛乳加入磷酸钠溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流超滤 (750KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用QA柱和HiPrep 16/60-S400-HR柱两次精纯，各阶段的实施步骤如下：
1磷酸钠沉淀蛋白
(1)将2瓶250g生牛乳从-80℃冰箱拿出放在37℃恒温水浴锅中进行解 冻；
(2)解冻后将2瓶250g生牛乳4℃16000rpm离心30min，去除上层 脂蛋白和下层沉淀(离心后体积为450mL)；
(3)取250mL 1M，PH 6.3磷酸钠溶液放入烧杯中，再将烧杯放在磁力 搅拌器上，利用转子使溶液旋转起来，将450mL生牛乳缓慢加入450mL 1M， PH 6.3磷酸钠溶液中。摇震15min后放入-80℃冰箱冷冻；
(4)约2h完全冷冻后取出置于37℃水浴锅内解冻，然后依次用0.8μm、 0.45μm、0.22μm滤膜进行过滤。
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)500mL样品倒入循环瓶中，设置循环瓶体积200mL，样品用QA-A 液平衡液缓冲液进行不断的补液置换，进样泵速120mL/min，持续上样进行 切向流超滤与浓缩，每隔半小时监测并记录滤出端液体蛋白浓度，经过大约 6.5h，滤出液蛋白浓度降至0mg/mL，遂收集截留段液体，记录如表17及图 26：
表17磷酸钠沉淀法750KD中空纤维柱滤出液蛋白量变化数据表
Figure BDA0002914540500000271
(4)将样品浓缩到140mL，收集流出样品，再用10mL QA-A液冲洗管 路，共收集样品150mL。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为2.76E+10/mL，纯度为60.34％。利用HPLC-SEC(图3左上角) 和透射电镜(图4A)对TFF后得到的EV产品进行验证与表征，结果显示， 电镜样品密度高，外泌体的形态清晰，但其中也还有脂蛋白，TFF并未完全 去除杂蛋白。
3 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出放 室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)冲洗完成后更换CIMmultus QA平衡和洗脱液，洗泵后继续用QA-A 液平衡柱子10个柱体积；
(3)将TFF收集好的样品以10mL/min流速上CIMmultus QA柱；
(4)上样结束后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(5)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液20mM Tris+1M Nacl)梯度洗脱 (10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(6)分别收集并合并各吸收峰组分，结果如图27；
(7)CIP：对柱子进行在线清洗，流速5mL/min(30％异丙醇，1M NaOH+2M NaCl，1M醋酸铵，各清洗5个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲 洗，于4℃保存。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为5.83E+9/mL，纯度为75.62％。
4 HiPrep 16/60-S400-HR精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 1mL/min流速冲洗系统，连接HiPrep 16/60-S400-HR柱，超纯水冲洗1个柱 体积；
(2)冲洗完成后更换PBS平衡缓冲液，洗泵后继续用PBS溶液平衡柱 子1个柱体积；
(3)将上步QA柱得到的样品以1mL/min流速上HiPrep 16/60-S400-HR 柱，收集样品峰，如图28；
(4)收集的生牛乳外泌体利用液氮进行速冻，速冻结束放入-80℃冰箱进 行保存。
得到的样品分别利用CytoFlex流式细胞仪和NanoFCM进行颗粒数浓度 和纯度的检验，其颗粒数浓度分别为2.06E+9/mL和5.44E+10/mL，纯度分别 为95.91％和89.25％。此外，NanoFCM检测结果显示(如图11A所示)，外 泌体的粒径分布在40-100nm之间，符合文献报道的30-150nm，平均粒径在 60nm左右。经Western blot(WB)的表征结果来看(如图8所示)，经磷酸 钠沉淀法处理得到的EV都含有标志物CD81、Alix和TSG101。
实施例11硫酸铵沉淀蛋白法1
将牛奶加入硫酸铵溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流超滤 (300KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用QA柱1次精纯，各阶 段的实施步骤如下：
1硫酸铵沉淀蛋白
(1)-80℃冰箱中拿出2瓶250g生牛乳放在37℃水浴锅中解冻，然后 16000rpm，离心30min，离心结束后去除上层脂蛋白以及下层沉淀；
(2)烧杯中分别倒220mL 3M硫酸铵，然后将离心后的牛奶与硫酸铵1:1 混合，加入转子，将转速调至500rpm，搅拌10min，然后将其放入37℃水浴 锅中；
(3)沉淀结束后，用0.8μm，0.45μm，0.2μm过滤上清液。下层沉淀， 3500rpm离心10min，用0.8μm，0.45μm，0.2μm的滤膜进行过滤；
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)滤膜过滤后过TFF(300KD)，用QA-A液进行不断的补液置换(置 换体积设置为200mL，少于200mL就会进行补液)，直到滤出液蛋白量降至 0mg/mL，记录如表18和图29；
表18硫酸铵沉淀法中空纤维柱滤出液蛋白量变化数据表
时间(min) 0 30 60 90 120 150 180 210
滤出液蛋白量(mg/mL) 2.71 1.53 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.00
(4)将样品浓缩到90mL，收集流出样品，再用10mL QA-A液冲洗管 路，共收集样品100mL。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为5.06E+8/mL，纯度为63.49％。
3 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出放 室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)超纯水冲洗结束，用6M的盐酸胍冲洗柱子，直到基线冲平，然后 将系统暂停，使盐酸胍在柱中静置2h，2h后用超纯水进行冲洗柱子；
(3)冲洗完成后更换CIMmultus QA平衡和洗脱液，洗泵后继续用A液 平衡柱子10个柱体积；
(4)将处理好的样品以10mL/min流速上CIMmultus QA柱，上样结束 后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(5)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液20mM Tris+1M Nacl)梯度洗脱 (10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(6)分别收集并合并各吸收峰组分，如图30；
(7)CIP：对柱子进行在线清洗，流速5mL/min(30％异丙醇，1M NaOH+2M NaCl，1M醋酸铵，各清洗5个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲 洗，于4℃保存。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为2.07E+8/mL，纯度为76.1％。
实施例12硫酸铵沉淀蛋白法2
将牛奶加入硫酸铵溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流超滤 (750KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用QA柱1次精纯，各阶 段的实施步骤如下：
1硫酸铵沉淀蛋白
(1)-80℃冰箱中拿出2瓶250g生牛乳放在37℃水浴锅中解冻，然后 16000rpm，离心30min，离心结束后去除上层脂蛋白以及下层沉淀；
(2)烧杯中分别倒220mL 3M硫酸铵，然后将离心后的牛奶与硫酸铵1:1 混合，加入转子，将转速调至500rpm，搅拌10min，然后将其放入37℃水浴 锅中；
(3)沉淀结束后，用0.8μm，0.45μm，0.2μm过滤上清液。
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)滤膜过滤后过TFF(750KD)，用QA-A液进行不断的补液置换(置 换体积设置为200mL，少于200mL就会进行补液)，直到滤出液蛋白量降至 0mg/mL，记录如表19和图31所示；
表19硫酸铵沉淀法中空纤维柱滤出液蛋白量变化数据表
时间(min) 0 30 60 90 120 150
滤出液蛋白量(mg/mL) 2.38 4.28 2.30 0.51 0.03 0.00
(4)透过的蛋白为0后，将杯中的200mL液体继续浓缩，浓缩到90mL， 然后加10mL的QA-A液冲洗管路与中空纤维柱，收集的总体积为100mL；
(5)750KD的TFF结束后，用超纯水冲洗系统，冲洗结束后，用0.1M 的NaOH充满750KD的中空纤维柱。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为3.34E+8/mL，纯度为67.74％。
3 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出放 室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)超纯水冲洗结束，用6M的盐酸胍冲洗柱子，直到基线冲平，然后 将系统暂停，使盐酸胍在柱中静置2h，2h后用超纯水进行冲洗柱子；
(3)冲洗完成后更换CIMmultus QA平衡和洗脱液，洗泵后继续用A液 平衡柱子10个柱体积；
(4)将处理好的样品以10mL/min流速上CIMmultus QA柱，上样结束 后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(5)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液20mM Tris+1M Nacl)梯度洗脱 (10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(6)分别收集并合并各吸收峰组分，如图32；
(7)CIP：对柱子进行在线清洗，流速5mL/min(30％异丙醇，1M NaOH+2M NaCl，1M醋酸铵，各清洗5个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲 洗，于4℃保存。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为2.16E+8/mL，纯度为81.87％。
实施例13硫酸铵沉淀蛋白法3
将牛奶加入硫酸铵溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流超滤(采 用750KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用QA柱和HiPrep 16/60-S400-HR柱精纯，各阶段的实施步骤如下：
1硫酸铵沉淀蛋白
(1)-80℃冰箱中拿出2瓶250g生牛乳放在37℃水浴锅中解冻，然后 16000rpm，离心30min，离心结束后去除上层脂蛋白以及下层沉淀；
(2)37℃水浴锅中沉淀2h，沉淀结束后用3500rpm，离心20min；
(3)离心结束后，用0.8μm，0.45μm，0.2μm过滤；
(4)配制3mM的CHAPS溶液50mL(称取粉末0.092g)，取20mL CHAPS 溶液加入过滤后的牛奶硫酸铵溶液中，CHAPS溶液的终浓度为0.15mM。
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)离心过滤后过TFF(750KD)，用QA-A液进行不断的补液置换(置 换体积设置为200mL，少于200mL进行补液)，直到滤出液蛋白量降至0 mg/mL，记录如表20和图33所示；
表20硫酸铵沉淀法中空纤维柱滤出液蛋白量变化数据表3
时间(min) 0 30 60 90 110
滤出液蛋白量(mg/mL) 3.44 3.51 0.56 0.03 0.00
(4)透过的蛋白为0后，将杯中的200mL液体继续浓缩，浓缩到100mL， 然后加10mL的QA-A液冲洗管路与中空纤维柱，收集的总体积为110mL。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为1.32E+9/mL，纯度为62.38％。利用HPLC(如图3右上角所示) 和透射电镜(如图4B所示)对TFF后得到的EV产品进行验证与表征，结 果显示，电镜样品密度高，外泌体的形态清晰，但其中也还有脂蛋白，TFF 并未完全去除杂蛋白。
3 CIMmultus QA柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，洗泵后继续用超纯水以 2mL/min流速冲洗系统，连接CIMmultus QA柱(柱子提前12h从4℃拿出放 室温，柱体积CV＝8mL)，超纯水冲洗5个柱体积；
(2)冲洗完成后更换CIMmultus QA平衡和洗脱液，洗泵后继续用A液 平衡柱子10个柱体积；
(3)将处理好的样品以10mL/min流速上CIMmultus QA柱，上样结束 后，用QA-A液平衡柱子至基线稳定；
(4)0％(v/v)B-100％(v/v)B(B液20mM Tris+1M Nacl)梯度洗脱 (10个CV)，洗脱完成至基线平稳；
(5)分别收集并合并各吸收峰组分，如图34所示；
(6)CIP：对柱子进行在线清洗，流速5mL/min(30％异丙醇，1M NaOH+2M NaCl，1M醋酸铵，各清洗5个CV)，最终将柱子用20％乙醇冲 洗，于4℃保存。
得到的样品利用CytoFlex流式细胞仪进行颗粒数浓度和纯度的检验，其 颗粒数浓度为3.46E+8/mL，纯度为78.10％。
4 HiPrep 16/60-S400-HR柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，pump wash洗泵后继续 用超纯水以1mL/min流速冲洗系统，连接HiPrep 16/60-S400-HR柱，超纯水 冲洗1个柱体积；
(2)冲洗完成后更换PBS平衡缓冲液，洗泵后继续用PBS溶液平衡柱 子1个柱体积；
(3)将处理好的样品以10mL/min流速上HiPrep 16/60-S400-HR柱，分 别收集并合并各吸收峰组分，如图35；
(4)上样结束后，用PBS溶液平衡柱子至基线稳定。
得到的样品分别利用CytoFlex流式细胞仪和NanoFCM进行颗粒数浓度 和纯度的检验，其颗粒数浓度分别为2.96E+8/mL和4.74E+10/mL，纯度分别 为92.15％和85.19％。此外，NanoFCM检测结果显示(如图11B所示)，外 泌体的粒径分布在40-120nm之间，符合文献报道的30-150nm，平均粒径在 60nm左右。
实施例14硫酸铵沉淀蛋白法4
将伊利脱脂牛奶加入硫酸铵溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流 超滤(采用750KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用Core700柱进 行精纯，各阶段的实施步骤如下：
1硫酸铵沉淀蛋白
(1)1.5L伊利脱脂常温牛奶用16000rpm，离心30min，离心结束后去除 上层脂蛋白以及下层沉淀；
(2)将1.5L伊利脱脂牛奶用硫酸铵进行室温沉淀2h，沉淀结束后用 3500rpm，离心20min；
(3)沉淀结束后，用0.8μm，0.45μm，0.2μm滤膜过滤；
2TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)滤膜过滤后过TFF(750KD)，用QA-A液进行不断的补液置换(置 换体积设置为200mL，少于200mL就会进行补液)，直到滤出液蛋白量降至 0mg/mL；
(4)透过的蛋白为0后，将杯中的200mL液体继续浓缩，浓缩到40mL， 然后加10mL的QA-A液冲洗管路与中空纤维柱，收集的总体积为50mL。
3 Capto Core 700柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，pump wash洗泵后继续 用超纯水以2mL/min流速冲洗系统，连接Capto Core 700柱，超纯水冲洗5 个柱体积；
(2)冲洗完成后更换Capto Core 700平衡和洗脱液，洗泵后继续用A液 平衡柱子5个柱体积；
(3)将上步TFF得到的样品用10KD的超滤管进行浓缩，过Capto core700 柱，用上样环以2mL/min流速上柱，收集流穿样品，如图36；
(4)调整流速2mL/min，用B液对柱子进行在位清洗CIP；
(5)超纯水洗3个CV，更换20％乙醇冲洗3个CV，于4℃保存。
得到的样品利用NanoFCM进行颗粒数浓度和纯度的检验，其颗粒数浓度 为4.57E+11/mL，纯度为91.20％。
实施例15硫酸铵沉淀蛋白法5
将伊利全脂牛奶加入硫酸铵溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF切向流 超滤(采用750KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用Core700柱进 行精纯，各阶段的实施步骤如下：
1硫酸铵沉淀蛋白
(1)1.5L伊利全脂常温牛奶用16000rpm，离心30min，离心结束后去除 上层脂蛋白以及下层沉淀；
(2)将1.5L伊利全脂牛奶用硫酸铵进行室温沉淀2h，沉淀结束后用 3500rpm，离心20min；
(3)沉淀结束后，用0.8μm，0.45μm，0.2μm滤膜过滤。
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系 统；
(3)滤膜过滤后过TFF(750KD)，用QA-A液进行不断的补液置换(置 换体积设置为200mL，少于200mL就会进行补液)，直到滤出液蛋白浓度降 至0mg/mL；
(4)透过的蛋白为0后，将杯中的200mL液体继续浓缩，浓缩到40mL， 然后加10mL的QA-A液冲洗管路与中空纤维柱，收集的总体积为50mL。
3 Capto Core 700柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，pump wash洗泵后继续 用超纯水以2mL/min流速冲洗系统，连接Capto Core 700柱，超纯水冲洗5 个柱体积；
(2)冲洗完成后更换Capto Core 700平衡和洗脱液，洗泵后继续用A液 平衡柱子5个柱体积；
(3)将上步TFF得到的样品用10KD的超滤管进行浓缩，过Capto core700 柱，用上样环以2mL/min流速上柱，收集流穿样品，如图37；
(4)调整流速2mL/min，用B液对柱子进行在位清洗CIP；
(5)超纯水洗3个CV，更换20％乙醇冲洗3个CV，于4℃保存。
得到的样品利用NanoFCM进行颗粒数浓度和纯度的检验，其颗粒数浓度 为3.62E+11/mL，纯度为59.98％。经Western blot(WB)的表征结果来看， 经硫酸铵沉淀法处理得到的EV都含有标志物CD81、Alix和TSG101。
实施例16硫酸铵沉淀蛋白法6
将Devondale脱脂牛奶加入硫酸铵溶液中进行蛋白沉淀，随后采用TFF 切向流超滤(采用750KD中空纤维柱)进行初纯与浓缩，接着再采用HiPrep 16/60-S400-HR柱进行精纯，各阶段的实施步骤如下：
1硫酸铵沉淀蛋白
(1)将1L Devondale脱脂牛奶用硫酸铵(3M的硫酸铵溶液与牛奶1:1 混合，硫酸铵终浓度为1.5M)进行室温沉淀2h，沉淀结束后用3500rpm，离 心20min；
(2)沉淀结束后，用0.8μm，0.45μm，0.2μm滤膜过滤，蛋白含量为 2.53mg/mL。
2 TFF
(1)设置参数：TMP最大压力2bar，报警压力3bar；体积：最小体积 100mL，报警100mL；
(2)排空系统中的保存液，用ddH2O水进行冲洗后，用缓冲液冲洗系统；
(3)离心过滤后过TFF，用PBS溶液进行不断的补液置换(设置置换体 积为200mL，低于200mL进行补液)，直到滤出液蛋白浓度将至0mg/mL， 记录如表21和图38所示；
表21硫酸铵沉淀法中空纤维柱滤出液蛋白量变化数据表
时间(min) 0 30 90 180 210 270
滤出液蛋白量(mg/mL) 2.35 2.39 1.75 0.37 0.08 0.00
(4)透过的蛋白为0.00后，将杯中的200mL液体继续浓缩，浓缩到40mL， 然后加10mL的PBS溶液冲洗管路与中空纤维柱，收集的总体积为50mL。
3 HiPrep 16/60-S400-HR柱精纯
(1)蛋白纯化系统冲洗：超纯水抽滤超声脱气，pump wash洗泵后继续 用超纯水以1mL/min流速冲洗系统，连接HiPrep 16/60-S400-HR柱，超纯水 冲洗1个柱体积；
(2)冲洗完成后更换PBS平衡缓冲液，洗泵后继续用PBS溶液平衡柱 子1个柱体积；
(3)将处理好的样品分以1mL/min流速上HiPrep 16/60-S400-HR柱，收 集流穿样品，如图39；
(4)上样结束后，用PBS溶液平衡柱子至基线稳定；
(5)所有样品上样结束后，用PBS溶液平衡柱子至基线稳定。
得到的样品利用NanoFCM进行颗粒数浓度和纯度的检验，其颗粒数浓度 为9.36E+12/mL，纯度为83.35％。
4其他类似产品结果
采用上述方法处理的牛奶样品及结果如表22和图13所示。由此可以看 出，该方法具有通用性，能够分离纯化多品牌牛奶，且得到的牛奶外泌体基 本都没有杂质峰，得到的样品较纯，适合推广。
表22不同品牌全脂/脱脂牛奶硫酸铵沉淀蛋白法颗粒数及纯度统计 不同品牌的牛奶的纯度与产量
Figure BDA0002914540500000371
Figure BDA0002914540500000381
实施例17不同时间细胞对外泌体的内吞量
(1)HeLa细胞用24孔板进行接种，接种6孔(细胞接种量3.6E4 cells/ 孔)；
(2)实施例8制得的牛奶外泌体用PKH67染料进行染色，染色后用 HiTrapdesalting柱去除游离染料；
(3)HeLa细胞两孔加入未染色的外泌体(1E9)作为对照，另外4孔加 入染色的牛奶外泌体(1E9)，分别在4h后和15h后收集细胞，用流式细胞 仪检测外泌体在不同时间的入胞情况。
如图10(A)结果显示，牛奶外泌体在4h时被HeLa细胞摄取的内吞量 已达到99.92％。
实施例18不同细胞对外泌体的内吞量
1)HeLa细胞，HepG2细胞，Caco2细胞用24孔板进行接种，每种细胞 接种4孔(细胞接种量Hela-3.6E4 cells/孔，HepG2-1.06E5 cells/孔，Caco-2-2.8E4 cells/孔)；
2)实施例8制得的牛奶外泌体用PKH67染料进行染色，染色后用HiTrap desalting柱去除游离染料。
3)HeLa细胞，Caco2细胞各两孔加入未染色的外泌体(1E9)作为对照， 另外2孔加入染色的牛奶外泌体(1E9)，在4h后收集不同细胞，用流式细 胞仪检测不同细胞对外泌体摄取情况。
表23不同细胞对外泌体的内吞量
样品名称 分析颗粒数P1 V1L％父群 V1R％父群 MeanFITC-A
Blank 20000 99.32％ 0.69％ 7502.6
HeLa 20000 0.60％ 99.40％ 35654.6
CaCO2 20000 5.62％ 94.39％ 16737.0
如图10(B)结果显示，牛奶外泌体在4h时被HeLa细胞摄取的能力最 强。
实施例19牛奶外泌体治疗DSS小鼠溃疡性结肠炎
(1)订购雌性C57小鼠30只，对每只小鼠进行标记称重，每笼5只放 在SPF级饲养间进行饲养，其中3只为正常对照组，其余27只用3.5％DSS 进行动物肠炎模型造模。
(2)每天对小鼠进行称重，记录小鼠的体重，观察小鼠的粪便情况(稀 软程度，是否有便血)含3.5％DSS的水每2天更换一次，在第四天小鼠体重 开始下降，对小鼠体重下降进行排序，然后均分小鼠为3组，一组给予生理 盐水，一组给牛奶外泌体(1E9颗粒数/只)，一组给外泌体(1E11颗粒数/只)
给药每天记录小鼠体重，结果如图40所示，从图中可以看出给药组 (milk-EV)小鼠体重下降速度越来越慢，体重逐渐恢复，其中给药组(1E9) 效果最好，并且生理盐水组在整个过程中死去3只，说明milk-EV给药组可 降低肠炎小鼠的死亡率，将死亡率从30％降为0。
表24实验全程中小鼠体重的测量结果
Figure BDA0002914540500000391
Figure BDA0002914540500000401
实施例20牛奶外泌体能抑制免疫细胞炎症反应
(1)1μg/mL CD3单抗包被96孔板x2块板；
(2)复苏PBMC细胞，400g离心10min，弃上清；计数PBMC细胞为： 3.46E6/mL×3.2mL。按照1E6/mL重悬补加7.872mL培养基。将PBMC细胞 悬液按下表分装至EP管内(80μL细胞悬液+1mL PBS/管)，离心弃上清。用 240μL含对应刺激的培养基重悬细胞沉淀，接种至CD3预包被的96孔板内。 置于37度细胞培养箱内静置培养。
表25 PBMC细胞处理方法表
编号 细胞数量 活化剂 牛奶外泌体 地塞米松-μg/mL
1 8E4 cells 1μg/mL CD3+5μg/mL CD28 / /
2 8E4 cells 1μg/mL CD3+5μg/mL CD28 1E5颗 /
3 8E4 cells 1μg/mL CD3+5μg/mL CD28 1E7颗 /
4 8E4 cells 1μg/mL CD3+5μg/mL CD28 1E9颗 /
5 8E4 cells 1μg/mL CD3+5μg/mL CD28 / 1
(3)培养72h后收取PBMC细胞至EP管内，400g离心10min，收取 上清。参照说明书，利用ELISA试剂盒检测细胞上清中gamma干扰素(IFN-γ) 的含量。
表26细胞上清中gamma干扰素(IFN-γ)的含量
Figure BDA0002914540500000411
图41显示，牛奶外泌体能够降低gamma干扰素分泌，抑制炎症。
实施例21 NanoFCM检测不同纯化方法对牛奶外泌体粒径分布的影响
采用本发明的磷酸钠沉淀蛋白法3和硫酸铵沉淀蛋白法6与现有外泌体 常规的分离方法——超速离心法和商品化试剂盒(华盈生物)法进行对比， 结果如图12所示。结果显示，不同处理方法得到的Milk EV粒径分布不同， 粒径分布都在30-150nm之间，但磷酸钠沉淀蛋白法3和硫酸铵沉淀蛋白法6 得到的EV分布较为集中，超离法和试剂盒法分散较为广泛，并且超离法在 150nm之后还有分布。
实施例22 HPLC和透射电镜验证不同纯化方法对牛奶外泌体纯度的影响
将磷酸钠沉淀蛋白法3和硫酸铵沉淀蛋白法6中经中空纤维柱初纯的样 品与超速离心法和商品化试剂盒法提取的外泌体样品采用HPLC和透射电镜 进行结果的表征，比较结果如图3、4所示，从图中可以看出磷酸钠-TFF和硫 酸铵-TFF初纯处理的杂蛋白峰更少，磷酸钠沉淀蛋白法3和硫酸铵沉淀蛋白 法6中经中空纤维柱初纯处理的背景更干净，外泌体样品密度更高(商品化 试剂盒法提取的外泌体样品由于背景过于杂乱，在透射电镜中看不到相应的 外泌体)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (22)

1.牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、前处理；
步骤2、初步纯化、浓缩；
步骤3、精纯；
所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白；
所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤；
所述精纯包括CIMmultus QA柱纯化、Capto柱纯化、S400分子筛色谱法纯化中的一种或两者以上的组合。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中去除脂肪包括：
(1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪；和/或
(2)采用离心的方法去除脂肪；
所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白法和/或沉淀蛋白法；
所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法；
所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉淀蛋白法中的一种或两者的组合。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠溶解法包括如下步骤：取等体积的牛奶与质量浓度为2％～16％的柠檬酸钠溶液混合，冰浴震摇，滤膜过滤。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA沉淀蛋白法包括如下步骤：取等体积的牛奶与EDTA溶液混合，25℃-50℃静置，离心，滤膜过滤；所述EDTA溶液的浓度为0.15M～0.35M，pH值为6.0～7.0。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M～2.0M，pH值为5.2～8.0。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钠溶液的浓度为0.5M，pH值为5.3、6.5或7.6；或
所述磷酸钠溶液的浓度为1M，pH值为5.2、6.3或pH 7.6；或
所述磷酸钠溶液的浓度为2.0M，pH值为6.0、pH 7.0或pH 8.0。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤：
不同的牛奶种类，磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同：
(1)全脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，-80℃冷冻；
(2)脱脂牛奶
将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，室温静置，于3500rpm离心10min，收集上清经滤膜过滤。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀蛋白法包括如下步骤：取等体积的牛奶与硫酸铵溶液混合，25℃～50℃静置，离心，滤膜过滤；所述硫酸铵溶液的浓度为3.0M～6.0M。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述切向流超滤法采用截留分子量为300KD的中空纤维柱或截留分子量为750KD的中空纤维柱。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Capto柱纯化采用Core400柱或Core700柱。
12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S400分子筛色谱法纯化采用HiPrep 16/60-S400-HR柱。
13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(I)、柠檬酸钠溶解蛋白、TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
(II)、EDTA沉淀蛋白、TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
(III)、磷酸钠沉淀蛋白、截留分子量为300KD的中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultusQA柱纯化、Capto Core700柱纯化；或
磷酸钠沉淀蛋白、300KD中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(IV)、磷酸钠沉淀蛋白、750KD中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、CaptoCore700柱纯化；或
磷酸钠沉淀蛋白、750KD中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(V)、硫酸铵沉淀蛋白、300KD中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、CaptoCore700柱纯化；或
硫酸铵沉淀蛋白、300KD中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(VI)、硫酸铵沉淀蛋白、750KD中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、CaptoCore700柱纯化；或
硫酸铵沉淀蛋白、750KD中空纤维柱TFF切向流超滤、CIMmultus QA柱纯化、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化；或
(VII)、硫酸铵沉淀蛋白、750KD中空纤维柱TFF切向流超滤、Capto Core700柱纯化；或
硫酸铵沉淀蛋白、750KD中空纤维柱TFF切向流超滤、HiPrep 16/60-S400-HR柱纯化。
14.如权利要求1至13任一项所述的制备方法制得的牛奶外泌体。
15.如权利要求14所述的牛奶外泌体，其特征在于，其粒径分布介于30～150nm之间。
16.如权利要求14或15所述的牛奶外泌体在制备治疗炎症反应的药物中的应用。
17.如权利要求14或15所述的牛奶外泌体在制备治疗消化道炎症的药物中的应用。
18.如权利要求14或15所述的牛奶外泌体在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。
19.如权利要求14或15所述的牛奶外泌体在制备治疗结肠炎或抑制免疫细胞炎症反应的药物中的应用。
20.如权利要求14或15所述的牛奶外泌体在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
21.药物，其特征在于，包括如权利要求14或15所述的牛奶外泌体以及药学上可接受的辅料或佐剂。
22.食品，其特征在于，包括如权利要求14或15所述的牛奶外泌体以及食品上可接受的助剂。
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