CN117721070B - 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂 - Google Patents
一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117721070B CN117721070B CN202410171637.0A CN202410171637A CN117721070B CN 117721070 B CN117721070 B CN 117721070B CN 202410171637 A CN202410171637 A CN 202410171637A CN 117721070 B CN117721070 B CN 117721070B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hipsc
- source
- exosomes
- purity
- exosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 229940124568 digestive agent Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims abstract description 64
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 64
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 63
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 43
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 27
- 239000003866 digestant Substances 0.000 claims description 25
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 16
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 52
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 16
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 16
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 2
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 2
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000803709 Homo sapiens Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000005473 Secretory Phospholipases A2 Human genes 0.000 description 1
- 108010031873 Secretory Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 description 1
- 230000010267 cellular communication Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂，属于生物技术领域。本发明提供的用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法为使用由终浓度为0.1%~1%的Triton X‑100和终浓度为0.1%~0.5%的SDS组合的消化剂对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，并利用纳米流式对消化处理后的样品进行检测，能够准确检测hiPSC源外泌体的纯度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂。
背景技术
外泌体是一类具有生物学活性的，由细胞分泌的细胞外囊泡。其粒径范围为30-150 nm，具有磷脂双分子层结构。外泌体携带供体细胞的分子生物学信息，如核酸、蛋白质和脂质等，参与细胞通讯及多种生理病理过程的调节。人诱导多能干细胞（human inducedpluripotent stem cell，hiPSC）是一种具有强大分化再生潜力的类胚胎干细胞，可分化为人体各个器官和组织所需要的各种细胞类型。由hiPSC分泌的外泌体（以下称hiPSC源外泌体）已被证明具有强大的再生和抗炎作用，对心肌细胞具有保护作用，改善细胞凋亡和肥大引起的心肌损伤（Admiak Marta, 等人. "Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived extracellular vesicles are safer and more effective for cardiacrepair than iPSCs."Circulation research122.3 (2018): 296-309.），对急性肾损伤大鼠模型也表现显著的保护效果（Collino Federica,等人. "Extracellular vesiclesderived from induced pluripotent stem cells promote renoprotection in acutekidney injury model."Cells9.2 (2020): 453.）。因此，对hiPSC源外泌体进行提纯、鉴定、检测和利用具有非常重要的临床应用价值。
外泌体可利用多种方法进行鉴定和检测，如纳米粒子跟踪分析（NanoparticleTracking Analysis，NTA）、Western blot等。这些方法均是针对外泌体样本总体进行检测，无法对单颗粒进行表征，也无法对外泌体与其他颗粒杂质进行区分。虽然透射电镜可以对单颗粒进行表征，但这种方法的样品制备繁琐、检测效率低、设备昂贵，并且无法进行定量。随着技术的发展，纳米流式检测法已被广泛应用于外泌体的检测（例如纯度检测），并且该方法已被外泌体协会纳入团体标准。
已知外泌体囊泡的脂质膜相比于蛋白聚集物，对表面活性剂的敏感度更高，因此在用纳米流式检测法对外泌体进行检测时，通常需要不同类型的表面活性剂来破坏外泌体囊泡的膜结构（Cloutier Nathalie, 等人. "The exposure of autoantigens bymicroparticles underlies the formation of potent inflammatory components: themicroparticle-associated immune complexes."EMBO molecular medicine5.2 (2013):235-249；Wu Cheng Yeu, 等人. "Membrane vesicles nucleate mineralo-organicnanoparticles and induce carbonate apatite precipitation in human bodyfluids."The journal of biological chemistry288.42 (2013): 30571-30484；Rousseau Matthieu, 等人. "Detection and quantification of microparticles fromdifferent cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact ofsecreted phospholipase A2 on microparticle assessment."Plos one10.1 (2015):e0116812；Arraud N, 等人. "A simple flow cytometry method improves thedetection of phosphatidylserine-exposing extracellular vesicles."Journal of thrombosis and haemostasis: JTH13.2 (2015): 237-247. ）。目前，常用纳米流式检测经表面活性剂Triton X-100处理前后的外泌体，通过颗粒数（通常为30 nm~200 nm粒径范围内的颗粒）的变化，来确定外泌体的纯度（György Bence, 等人. "Detection andisolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexesresulting from shared biophysical parameters."Blood117.4 (2011): e39-e48.）。虽然这种方法可适用于多种来源（例如293T细胞、间充质干细胞、牛乳等）的外泌体的纯度检测，但是，这种基于Triton X-100的外泌体纯度检测法并不是通用的，其在针对hiPSC源外泌体时，无法检测hiPSC源外泌体纯度。其他表面活性剂，例如SDS（十二烷基硫酸钠）、Tween20或脱氧胆酸盐虽然也可用于坏外泌体囊泡的膜结构（Osteikoetxea Xabier, 等人. "Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations."Organic&biomolecular chemistry13.38 (2015): 9775-9782.），但这些表面活性剂在单独使用时也均不能充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，因此不能单独用于对hiPSC源外泌体的纯度进行检测。因此，本领域亟需一种可对hiPSC源外泌体纯度进行检测的有效方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法，其使用由Triton X-100和SDS组合的消化剂对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，并利用纳米流式对消化处理后的样品进行检测，其中所述TritonX-100的使用终浓度为0.1%~1%，所述SDS的使用终浓度为0.1%~0.5%。
在一些实施方式中，所述方法包括以下操作：
1）使用所述消化剂对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，作为表面活性剂处理组，并同步使用与所述消化剂同体积的DPBS对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，作为DPBS处理组；
2）利用纳米流式检测所述表面活性剂处理组和DPBS处理组的颗粒数（例如在30-200 nm范围内的颗粒数），并按照下式（I）计算hiPSC源外泌体的纯度：
（I）
式（I）中：
所述表面活性剂是指：Triton X-100和SDS；
所述表面活性剂本底颗粒数是指：当所述消化剂中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂在水溶液中自发形成胶束，胶束尺寸分布广泛，其中存在与hiPSC源外泌体粒径相接近的胶束，这些胶束颗粒为本底颗粒。
在一些实施方式中，所述方法还包括对经所述消化剂处理后的hiPSC源外泌体样品进行超声处理。
在一些实施方式中，所述超声处理的条件为在500W以上条件下超声处理5 min以上。
在一些实施方式中，所述超声处理的条件为500-600W条件下超声处理5-10 min。
本发明另一方面提供一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的专用消化剂，其由使用终浓度为0.1%~1%的Triton X-100和使用终浓度为0.1%~0.5%的SDS组合而成。
本发明提供的所述的专用消化剂在检测hiPSC源外泌体纯度中的应用以及在破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构中的应用也属于本发明的内容。
基于以上技术方案提供的用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法为使用由终浓度为0.1%~1%的Triton X-100和终浓度为0.1%~0.5%的SDS组合的消化剂对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，此种方法能够针对性地充分裂解hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，进而可以准确检测hiPSC源外泌体的纯度。因此，本发明还提供一种专用于检测hiPSC源外泌体的纯度的消化剂，其由使用终浓度为0.1%~1%的Triton X-100和使用终浓度为0.1%~0.5%的SDS组合而成。
附图说明
图1为经1% Triton X-100或0.5% Triton X-100+0.25% SDS的组合消化剂处理hiPSC源外泌体样品后的透射电镜照片，其中第一行图片的比例尺是500 nm，第二行图片的比例尺是100 nm。
具体实施方式
虽然外泌体源于细胞，与供体细胞存在多种相似性，但其磷脂膜成分与供体细胞存在明显的不同（Llorente Alicia, 等人. "Molecular lipidomics of exosomesreleased by PC-3 prostate cancer cells ."Biochimca et biophysica acta1831,7(2013): 1302-1309.)。因此，同种表面活性剂在相同条件下处理不同细胞来源的外泌体时，对外泌体囊泡的膜结构的破坏效果可能存在差异（Osteikoetxea Xabier, 等人. "Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations."Organic&biomolecular chemistry 13.38 (2015): 9775-9782.），造成该种表面活性剂针对某一细胞来源的外泌体囊泡的膜结构有良好的破坏效果，但针对另一细胞来源的外泌体囊泡的膜结构没有破坏效果或者不能充分破坏而不适用，这可能是目前已报道的针对外泌体纯度检测的方法（例如利用Triton X-100、SDS或Tween 20作为表面活性剂对外泌体进行消化的方法）均不适用于对hiPSC源外泌体纯度进行准确检测的原因。然而，本发明人惊讶发现当将使用终浓度为0.1%~1%的Trtion X-100与使用终浓度为0.1%~0.5%的SDS组合用于对hiPSC源外泌体进行消化时，两者能够发挥协同作用，可以针对性地且更加充分消化hiPSC源外泌体和充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，进而提高hiPSC源外泌体纯度的检测准确度。因此，本发明提供一种适用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法，其采用由终浓度为0.1%~1%的Trtion X-100与终浓度为0.1%~0.5%的SDS组合的消化剂对hiPSC源外泌体进行消化，随后利用纳米流式检测方法检测经消化前后的hiPSC源外泌体样品中颗粒数的变化，由此反映hiPSC源外泌体的纯度。进一步地，还在检测方法中采用超声处理，能够减轻或消除hiPSC源外泌体样品中可能存在的蛋白聚集物对纯度检测结果的影响，进而进一步提高hiPSC源外泌体纯度的检测准确度。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例1：不同表面活性剂的组合对hiPSC源外泌体纯度检测的作用效果。
1.1、hiPSC细胞培养
对hiPSC细胞（国典（北京）医药科技有限公司商品）进行扩增培养（使用国典（北京）医药有限公司商品，货号GDM010，进行常规扩增培养）至对数生长期且状态良好，按照Versene Solution试剂盒（购自Thermo Fisher公司，货号15040066）的技术手册消化成小细胞团（3-10个细胞），然后将其铺在玻连蛋白（购自Peprotech公司的Recombinant HumanVitronectin，货号140-09）包被的10 cm细胞培养皿中，贴壁后覆盖率达到60%～70%，37℃，95%空气和5% CO2气氛下培养过夜。如果hiPSC贴壁状况良好，换液为GDEV培养基（参见CN112920991A的实施例1），24 h后换液收取细胞培养上清，重复上一步操作，一批细胞可收取2～3次。
1.2、hiPSC源外泌体精纯样品的制备
取上述步骤1.1中利用GDEV培养基培养细胞获得的细胞培养上清在3000 g条件下室温离心15 min，去除死细胞和细胞碎片。收集上清液，0.22 μm滤器过滤；将滤出液转移至Amicon Ultra-15（100 kDa）或Centricon Plus-70（100 kDa）超滤管中浓缩，3000 g室温离心30 min。用DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液）将浓缩液按照约1：100进行稀释，然后使用相同的装置再次浓缩。即可得到较为纯净的初纯外泌体，随后再利用密度梯度离心法进一步纯化。具体为将初纯外泌体样品加入不同梯度浓度（40%，20%，10%，5%）的蔗糖溶液中，100000 rpm离心18 h，重复一次，获得hiPSC源外泌体精纯样品。经对获得的hiPSC源外泌体精纯样品进行粒径分析、纳米流式检测外泌体表面标志物和电镜分析（具体操作方法参见CN112920991A），证明确实获得了外泌体，并且利用纳米流式检测的样品中颗粒的粒径均处于30-150 nm范围内，且在电镜下观察到颗粒形态基本上都是杯状体结构，可证明确实获得了hiPSC源外泌体精纯样品。
1.3、将上述步骤1.2制备的hiPSC源外泌体精纯样品利用纳米流式仪检测颗粒浓度，并用DPBS稀释至2×1010~5×1010颗粒/mL。分别向稀释之后的hiPSC源外泌体精纯样品中加入Triton X-100（终浓度为0，0.05%，0.1%，0.5%，1%，5%，10%）与Tween 20（终浓度0，0.01%，0.05%，0.1%，0.5%，1%，5%）的组合消化剂，Triton X-100（终浓度0，0.05%，0.1%，0.5%，1%，5%，10%）与SDS（终浓度为0，0.01%，0.05%，0.1%，0.25%，0.5%，1%）的组合消化剂，或Tween 20（终浓度为0，0.01%，0.05%，0.1%，0.5%，1%，5%）与SDS（终浓度为0，0.01%，0.05%，0.1%，0.25%，0.5%，1%）的组合消化剂（组合消化剂的组合信息如下表1-表6所示），或相同体积的DPBS进行处理，每个样品3个重复。充分混匀后，4℃孵育1 h。随后，将各个样品取出，稀释20倍后，利用纳米流式检测各处理组样品的颗粒数，并根据下述公式（I）计算各个处理组对hiPSC源外泌体纯度检测结果。
（I）
上述式（I）中：
表面活性剂是指：向hiPSC源外泌体精纯样品加入的组合消化剂。
表面活性剂本底颗粒数是指：当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度（表面活性剂分子在溶剂中缔合形成胶束的最低浓度）时，表面活性剂在水溶液中自发形成胶束，胶束尺寸分布广泛，其中存在与外泌体粒径相接近的胶束。这些胶束颗粒成为本底颗粒，与外泌体无法区分而被纳米流式识别检测。
根据上述式（I）的纯度计算公式，表面活性剂本底颗粒对纯度的检测结果有直接影响。当本底颗粒过高，被表面活性剂破坏的外泌体颗粒数的变化会被本底颗粒数掩盖，因此，用于检测外泌体纯度的理想表面活性剂应具有两大特点：第一，充分破坏外泌体膜完整性；第二，表面活性剂本底颗粒数低，最好是与DPBS背景相接近。因此，为了筛选合适的表面活性剂，该实施例1首先检测不同的表面活性剂组合（即组合消化剂）的本底颗粒数。根据纳米流式检测线性范围是4000-8000 events，假设外泌体样品纯度为100%，那么经过表面活性剂处理后，检测溶液中的颗粒应只剩本底颗粒，因此本底颗粒数不应大于400 events。为了降低本底颗粒对检测结果的影响，在本申请中规定本底颗粒数应低于300 events。如下表1-表3，表面活性剂单独使用或两两组合，有多组消化剂（例如表1中的（1%-5%）Tween 20+（0.05%-10%）Triton X-100、5% Tween 20、10% Triton X-100+（0%-0.5%）Tween 20、5%Triton X-100+（0.05%-0.5%）Tween 20、10% Triton X-100；表2中的（0.5%-5%）Tween 20+（0.01%-1%）SDS；表3中的（0.05%-1%）SDS+（5%-10%）Triton X-100等）的本底颗粒数大于300events，因此对应的单独表面活性剂或组合的两种表面活性剂浓度不适合用于检测hiPSC源外泌体纯度，因此后续在检测hiPSC源外泌体纯度时不对利用这些组合消化剂或单独的表面活性剂的处理组样品进行计算。
表1：Tween 20与Triton X-100组合消化剂本底颗粒数（events）
表2：Tween 20与SDS组合消化剂的本底颗粒数（events）
表3：Triton X-100与SDS组合消化剂的本底颗粒数（events）
下表4-表6分别列出了使用不同终浓度的表面活性剂组合消化剂对hiPSC源外泌体精纯样品进行处理后，再经纳米流式检测和上述式（I）计算的外泌体纯度检测结果。
由表4-表6的纯度检测结果可知，不同终浓度的Tween 20与Triton X-100组合消化剂的纯度检测结果最高仅达到27.22%±3.31%（0.05% Tween 20+0.1% Triton X-100），不同终浓度的Tween 20与SDS组合消化剂的纯度检测结果最高仅达到18.11%±1.25%（0.05% Tween 20+1% SDS），可见以上组合消化剂针对hiPSC源外泌体精纯样品的纯度检测结果明显偏低，最可能原因是以上组合消化剂均不能充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，因此均不能准确检测hiPSC源外泌体的纯度。相比之下，Triton X-100与SDS的组合消化剂能够实现显著更高的hiPSC源外泌体纯度检测准确度结果，如表6所示，终浓度为0.1%-0.5%的SDS和终浓度为0.1%-1%的Triton X-100组合使用时，hiPSC源外泌体的纯度检测结果均能够达到96%以上，甚至达到99%左右（例如0.5% SDS+0.1% Triton X-100，或0.1% SDS+（0.5%-1%）Triton X-100）。由此可见Triton X-100与SDS的组合消化剂，尤其是终浓度为0.1%-0.5%的SDS和终浓度为0.1%-1%的Triton X-100的组合消化剂在用于检测hiPSC源外泌体的纯度时具有较为准确的检测结果，表明Triton X-100与SDS的组合消化剂能充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，进而有助于hiPSC源外泌体的纯度准确检测，这可能是该组合消化剂中Triton X-100与SDS发挥协同裂解hiPSC源外泌体囊泡的膜结构作用带来的。
另外，由表4和表5的纯度检测结果也可知，如果使用单独的Tween 20（浓度为0.01%-1%）作为消化剂对hiPSC源外泌体纯度进行检测时，其纯度检测结果最高仅达到6.21%±0.78%（1% Tween 20）；由表4和表6的检测结果可知，如果使用单独的Triton X-100（浓度为0.05%-5%）作为消化剂对hiPSC源外泌体纯度进行检测时，其纯度检测结果最高仅达到3.25%±0.98%（0.5% Triton X-100）；由表5和表6所示的结果可知，如果使用单独的SDS（浓度为0.01%-1%）作为消化剂对hiPSC源外泌体纯度进行检测时，其纯度检测结果最高仅达到11.29%±0.93%（1% SDS）；以上这些结果表明单独的Tween 20、Triton X-100或SDS作为消化剂对hiPSC源外泌体纯度进行检测时，纯度检测结果均显著偏低，表明三种表面活性剂单独使用时均不能充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，因此三者均不能单独用于对hiPSC源外泌体的纯度进行准确检测。
表4：Tween 20与Triton X-100组合消化剂的纯度检测结果
表5：Tween 20与SDS组合消化剂的纯度检测结果
表6：Triton X-100与SDS组合消化剂的纯度检测结果
实施例2：优化hiPSC源外泌体纯度检测消化方法。
2.1、按照实施例1中步骤1.1进行hiPSC细胞培养。
2.2、hiPSC源外泌体初纯样品的制备
取上述步骤2.1中利用GDEV培养基培养细胞获得的细胞培养上清在3000 g条件下室温离心15 min，去除死细胞和细胞碎片。收集上清液，0.22 μm滤器过滤；将滤出液转移至Amicon Ultra-15（100 kDa）或Centricon Plus-70（100 kDa）超滤管中浓缩，3000 g室温离心30 min。用DPBS将浓缩液按照约1：100进行稀释，然后使用相同的装置再次浓缩。即可得到hiPSC源外泌体初纯样品。经对获得的hiPSC源外泌体初纯样品进行粒径分析、纳米流式检测外泌体表面标志物和电镜分析，证明确实获得了外泌体。
2.3、将上述步骤2.2制备的hiPSC源外泌体初纯样品利用纳米流式检测样品颗粒浓度，并用DPBS稀释至2×1010~5×1010颗粒/mL。分别向稀释后的hiPSC源外泌体初纯样品中加入终浓度为0.25% Triton X-100与0.5% SDS组合，0.1% Trtion X-100与0.5% SDS组合，或1% Triton X-100与0.1% SDS组合，或相同体积的DPBS进行处理，每个样品6个重复。充分混匀后，4℃孵育1 h。随后，将各处理的样品取出，均分2份，一份稀释20倍后不进行超声处理，另一份在500W超声条件下分别处理1min，5min或10min，每个处理时间3个重复。之后样品稀释20倍，利用纳米流式检测各个处理组样品的颗粒数，并根据上述式（I）计算各个处理组对外泌体纯度检测结果。
检测结果如下表7所示，可见当使用终浓度为0.1%-0.5%的SDS和终浓度为0.1%-1%的Triton X-100的组合消化剂对hiPSC源外泌体初纯样品的纯度进行检测时，相对于未超声处理或者在500W条件下超声处理1 min，在500W条件下超声处理5min以上将更有助于准确检测hiPSC源外泌体初纯样品的纯度，这是因为初纯外泌体样品中含有大量的蛋白聚集物，蛋白聚集物容易掩盖表面活性剂对外泌体的破坏效果，而一定程度的超声处理可以在一定程度上减轻或消除蛋白聚集物对表面活性剂处理外泌体效果的掩盖。因此，在使用Triton X-100与SDS的组合消化剂对hiPSC源外泌体样品的纯度进行检测时，优选结合利用超声处理（例如在500W以上（例如500-600W）条件下超声处理5min以上（例如5-10 min））对hiPSC源外泌体样品进行消化，这有利于减轻或消除hiPSC源外泌体样品中可能存在的大量蛋白聚集物对纯度检测结果的影响。
表7：Triton X-100与SDS组合消化剂检测hiPSC源外泌体初纯样品纯度方法优化
实施例3：利用不同来源外泌体验证组合消化剂对hiPSC源外泌体纯度检测的特异性。
3.1、按照实施例1中步骤1.1进行hiPSC细胞培养，获得hiPSC细胞培养上清。同步利用MSC NutriStem® 的XF人间充质干细胞无血清培养基（BI，本实施例中命名为MSC培养基）培养人间充质干细胞（MSC，按照常规分离方法获取）获取细胞培养上清。还同步利用含有10%血清的DMEM/F12培养基（购自Thermo Fisher公司，货号11320033，本实施例中命名为293T细胞培养基）培养293T细胞，并按常规方法收集获得细胞培养上清。
3.2、精纯外泌体样品制备
分别取上述步骤3.1中利用GDEV培养基，MSC培养基和293T细胞培养基培养细胞获得的细胞培养上清在3000 g条件下室温离心15 min，去除死细胞和细胞碎片。收集上清液，0.22 μm滤器过滤；将滤出液转移至Amicon Ultra-15（100 kDa）或Centricon Plus-70（100kDa）超滤管中浓缩，3000 g室温离心30 min。用DPBS将浓缩液按照约1：100进行稀释，然后使用相同的装置再次浓缩。即可得到由以上三种细胞（iPSC、MSC和293T细胞）分泌的初纯外泌体溶液，随后分别利用密度梯度离心法进一步纯化。具体为将各自的初纯样品加入不同梯度浓度（40%，20%，10%，5%）的蔗糖溶液中，100000 rpm离心18 h，获得源自以上三种细胞的精纯外泌体样品，分别命名为hiPSC源外泌体、MSC源外泌体和293T源外泌体。
3.3、利用纳米流式仪分别检测上述步骤3.2中制备的hiPSC源外泌体、MSC源外泌体或293T源外泌体样品的颗粒数，并分别用DPBS稀释至2×1010~5×1010颗粒/mL。向上述稀释后的三种外泌体样品中分别加入0.25% Trtion X-100与0.5% SDS组合消化剂，或1%Triton X-100作为对照，每个样品3个重复。充分混匀后，4℃孵育1 h。利用纳米流式检测各个处理组样品的颗粒数，并根据上述式（I）计算各个处理组对外泌体纯度检测结果。
结果如下表8所示，可见针对其他细胞来源（例如293T细胞或MSC细胞）的外泌体纯度检测时，不论是使用经典外泌体消化方法（使用1% Triton X-100作为消化剂）处理外泌体还是使用本发明的组合消化剂处理外泌体，对外泌体纯度检测结果均无显著差异。鉴于Triton X-100具有破膜功能，可对有膜颗粒如外泌体进行裂解，而对无膜颗粒无影响，并且现有技术（例如专利文献CN116948947A）已报道可通过Triton X-100裂解293T细胞源外泌体后检测样品中有膜颗粒占比来反映外泌体纯度，并且该方法也被外泌体协会纳入团体标准以对外泌体的纯度进行检测，表明本发明的组合消化剂在对293T细胞或MSC细胞源外泌体进行消化处理时，具有与Triton X-100基本相同的效果。但是当针对hiPSC源外泌体进行纯度检测时，1% Triton无法充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，其检测纯度仅为11.72%±1.22%，明显偏低，而使用本发明提供的组合消化剂（0.25% Trtion X-100+0.5%SDS）时，可以充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，能显著提高对hiPSC源外泌体纯度的检测结果准确度，可达92.46%±2.29%。该结果表明相对于经典外泌体消化方法（使用1%Triton X-100作为消化剂），本发明使用Triton X-100与SDS组合消化剂对外泌体进行消化处理尤其适合用于检测hiPSC源外泌体样品的纯度，具有方法上的特异性。
表8：Triton X-100与SDS组合消化剂与经典方法检测hiPSC源外泌体纯度方法对比结果
实施例4：利用不同纯化程度的hiPSC源外泌体样品验证组合消化剂在区分外泌体和杂质上的有效性。
本实施例按照实施例1中1.1和1.2的操作进行hiPSC细胞培养和hiPSC源外泌体制备，分别得到hiPSC源外泌体初纯样品（按照同样的操作制备两份样品：hiPSC源外泌体初纯样品-1和hiPSC源外泌体初纯样品-2（两种样品均进行三次浓缩处理））和hiPSC源外泌体精纯样品（按照同样的操作制备两份样品：hiPSC源外泌体精纯样品-1和hiPSC源外泌体精纯样品-2（两种样品均进行一次蔗糖密度梯度离心））。利用纳米流式仪分别检测各样品中的颗粒数，并分别用DPBS稀释至2×1010~5×1010颗粒/mL。稀释后，分别向各样品中加入终浓度为0.25% Triton与0.5% SDS的组合消化剂或加入1% Triton X-100作为对照，每个样品3个重复。充分混匀后，4℃孵育1 h。随后，将各处理的样品取出，500W超声5 min，稀释20倍后，利用纳米流式检测各个样品的颗粒数，并根据上述式（I）计算各个处理组对外泌体纯度检测结果。
检测结果如下表9所示，可见经典检测常规外泌体的方法（使用1% Triton X-100作为消化剂）对各组hiPSC源外泌体的纯度检测结果均明显偏低，而本发明的组合消化剂针对不同纯化程度的hiPSC源外泌体样品均能实现较好的纯度检测结果。
表9：Triton X-100与SDS组合消化剂与经典方法检测hiPSC源外泌体纯度方法对比结果
实施例5：透射电镜验证组合消化剂对hiPSC源外泌体的纯度检测结果的可靠性。
将实施例4中获得的hiPSC源外泌体精纯样品-1用DPBS稀释至2×1010~5×1010颗粒/mL后，向其中加入终浓度0.5% Triton X-100+0.25% SDS的组合消化剂，或加入1%Triton X-100作为对照，每个样品3个重复。充分混匀后，4℃孵育1 h。随后，将样品取出，500W超声5 min。利用透射电镜观察各处理组样品形貌。
结果如图1所示，可见向hiPSC源外泌体精纯样品中加入1% Triton X-100处理后，1% Triton X-100不能充分裂解hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，仍存在一些尺寸较大（80 nm左右）的未裂解颗粒，如图1中第2列的高倍镜图的圈中所示，可以看到仍具有外泌体结构裂解一半的颗粒，这些残存的未完全裂解的囊泡颗粒，依旧会被纳米流式检测仪采集，从而导致利用纳米流式检测hiPSC源外泌体纯度的时候，结果偏低。而向hiPSC源外泌体精纯样品中加入终浓度0.5% Triton X-100与0.25% SDS的组合消化剂后，能够充分裂解hiPSC源外泌体囊泡的膜结构，基本上不存在尺寸较大的未裂解外泌体颗粒，如图1中第4列所示，已经不存在外泌体结构，而只剩下蛋白聚集物（如图1中第4列所示的高倍镜图中圈中所示，由于蛋白聚集物的信号峰强度会显著低于外泌体的信号峰强度，因此纳米流式会检测到很少量的蛋白聚集物，并且还可以通过设定阈值来排除蛋白聚集物的影响），从而可以证明TritonX-100与SDS的组合消化剂可以充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构。
鉴于目前使用纳米流式检测法对外泌体纯度检测的原理是：使用纳米流式检测经表面活性剂处理前后的外泌体样品，通过30 nm~200 nm粒径范围内的颗粒数的变化，来确定外泌体的纯度，其中使用表面活性剂处理外泌体样品的目的是充分破坏外泌体囊泡的膜结构，进而使其在处理后不能被纳米流式检测到，由此通过颗粒数的变化来反映外泌体的纯度。在图1的结果已经证明Triton X-100与SDS的组合消化剂可以充分破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构的情况下，也可以证明本发明采用Triton X-100与SDS的组合消化剂对hiPSC源外泌体进行消化处理的方法可以从消化处理前后颗粒数的变化准确反映hiPSC源外泌体的纯度，因此其检测结果是可靠的。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法，其特征在于，所述方法使用由Triton X-100和SDS组合的消化剂对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，并利用纳米流式对消化处理后的样品进行检测，其中所述Triton X-100的使用终浓度为0.1%~1%，所述SDS的使用终浓度为0.1%~0.5%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下操作：
1）使用所述消化剂对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，作为表面活性剂处理组，并同步使用与所述消化剂同体积的DPBS对hiPSC源外泌体样品进行消化处理，作为DPBS处理组；
2）利用纳米流式检测所述表面活性剂处理组和DPBS处理组的颗粒数，并按照下式（I）计算hiPSC源外泌体的纯度：
（I）
式（I）中：
所述表面活性剂是指：Triton X-100和SDS；
所述表面活性剂本底颗粒数是指：当所述消化剂中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂在水溶液中自发形成胶束，胶束尺寸分布广泛，其中存在与hiPSC源外泌体粒径相接近的胶束，这些胶束颗粒为本底颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对经所述消化剂处理后的hiPSC源外泌体样品进行超声处理。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超声处理的条件为在500W以上条件下超声处理5 min以上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超声处理的条件为500-600W条件下超声处理5-10 min。
6.一种专用消化剂在检测hiPSC源外泌体纯度中的应用，其中所述专用消化剂由使用终浓度为0.1%~1%的Triton X-100和使用终浓度为0.1%~0.5%的SDS组合而成。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用所述专用消化剂破坏hiPSC源外泌体囊泡的膜结构。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410171637.0A CN117721070B (zh) | 2024-02-07 | 2024-02-07 | 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410171637.0A CN117721070B (zh) | 2024-02-07 | 2024-02-07 | 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117721070A CN117721070A (zh) | 2024-03-19 |
| CN117721070B true CN117721070B (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90200122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410171637.0A Active CN117721070B (zh) | 2024-02-07 | 2024-02-07 | 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117721070B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108753697A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-06 | 天津市第三中心医院 | 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法 |
| WO2019113711A1 (en) * | 2017-12-14 | 2019-06-20 | University Of Ottawa | Exosome packaging and targeted autophagy |
| CN110951669A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-04-03 | 益善生物技术股份有限公司 | 提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法 |
| CN112920991A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-06-08 | 国典(北京)医药科技有限公司 | 一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用 |
| TW202124709A (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-01 | 財團法人工業技術研究院 | 外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法 |
| CN113699103A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-11-26 | 谢儒生 | 一种禽类间质干细胞外泌体的诱发增援制备工艺及应用 |
| CN114790439A (zh) * | 2021-01-25 | 2022-07-26 | 谛邈生物科技(北京)有限公司 | 牛奶外泌体及其制备方法 |
| CN115820544A (zh) * | 2022-09-25 | 2023-03-21 | 上海圣石生物医学科技有限公司 | 诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用 |
| CN116223316A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-06-06 | 广州睿贝医学科技有限公司 | 一种外泌体的纯度检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11160834B2 (en) * | 2015-04-28 | 2021-11-02 | The Texas A&M University System | Scalable production of standardized extracellular vesicles, extracellular vesicle preparations and uses thereof |
| US11458097B2 (en) * | 2016-03-30 | 2022-10-04 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Biological agent-exosome compositions and uses thereof |
| WO2020198633A1 (en) * | 2019-03-27 | 2020-10-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Nuclear-derived exosomes and methods of use thereof |
| CN114867866A (zh) * | 2019-12-27 | 2022-08-05 | 东曹株式会社 | 细胞外囊泡内部蛋白质的检测方法和细胞外囊泡膜渗透处理剂 |
-
2024
- 2024-02-07 CN CN202410171637.0A patent/CN117721070B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019113711A1 (en) * | 2017-12-14 | 2019-06-20 | University Of Ottawa | Exosome packaging and targeted autophagy |
| CN108753697A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-06 | 天津市第三中心医院 | 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法 |
| CN110951669A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-04-03 | 益善生物技术股份有限公司 | 提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法 |
| TW202124709A (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-01 | 財團法人工業技術研究院 | 外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法 |
| CN112920991A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-06-08 | 国典(北京)医药科技有限公司 | 一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用 |
| CN114790439A (zh) * | 2021-01-25 | 2022-07-26 | 谛邈生物科技(北京)有限公司 | 牛奶外泌体及其制备方法 |
| CN113699103A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-11-26 | 谢儒生 | 一种禽类间质干细胞外泌体的诱发增援制备工艺及应用 |
| CN115820544A (zh) * | 2022-09-25 | 2023-03-21 | 上海圣石生物医学科技有限公司 | 诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用 |
| CN116223316A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-06-06 | 广州睿贝医学科技有限公司 | 一种外泌体的纯度检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters;Bence Gyorgy等;BLOOD;20110127;第117卷(第4期);第39-48页 * |
| Protective effects of human induced pluripotent stem cell‑derived exosomes on high glucose‑induced injury in human endothelial cells;Qianqian Ding等;Experimental and Therapeutic Medicine;20180413;第15卷;第4791-4797页 * |
| 外泌体分离纯化评估方法的建立;龚曼菲;中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑;20190715;第A006-25页 * |
| 循环肿瘤DNA在肿瘤临床应用中的进展;戴五敏;韩晓红;石远凯;;中国新药杂志;20161231;第25卷(第21期);第2456-2461页 * |
| 规模化制备高纯度牛奶外泌体工艺方法的建立及其分子与细胞生物学活性鉴定;杨晶等;吉林大学学报（医学版）;20210531;第47卷(第3期);第777-787页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117721070A (zh) | 2024-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | Fusion between cell membrane and liposomes containing the glycoproteins of influenza virus | |
| CN109153968A (zh) | 从生物流体样品中分离细胞外囊泡（ev） | |
| Heine et al. | Entry of vesicular stomatitis virus into L cells | |
| CN113136362B (zh) | 一种囊泡及其应用 | |
| CN114591905B (zh) | 一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用 | |
| CN112501112A (zh) | 一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法 | |
| Dai et al. | Improved neural differentiation of stem cells mediated by magnetic nanoparticle-based biophysical stimulation | |
| Hashimoto et al. | Dermatomyositis: electron microscopic, immunologic, and tissue culture studies of paramyxovirus-like inclusions | |
| US11731098B2 (en) | Method for extracting nerve tissue-derived exosomes | |
| Silbert et al. | Structure and synthesis of a lipid-containing bacteriophage: III. Purification of bacteriophage PM2 and some structural studies on the virion | |
| CN113134014A (zh) | 囊泡在制备血友病药物中的应用 | |
| CN117721070B (zh) | 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂 | |
| Harms et al. | Purification and characterization of human lysosomes from EB-virus transformed lymphoblasts | |
| CN109430248A (zh) | 一种细胞冻存液及其应用 | |
| Chen et al. | A light-induced hydrogel responsive platform to capture and selectively isolate single circulating tumor cells | |
| Girod et al. | Identification of phospholipids in secretory granules of human submucosal gland respiratory cells. | |
| CN112852725A (zh) | 利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用 | |
| CN102242173B (zh) | 一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法 | |
| Liu et al. | Engineered multifunctional metal–phenolic nanocoatings for label-free capture and “self-release” of heterogeneous circulating tumor cells | |
| Bayer et al. | Effects of bacteriophage fd infection on Escherichia coli HB11 envelope: a morphological and biochemical study | |
| Hai et al. | Human umbilical cord mesenchymal stromal cells promotes the proliferation and osteogenic differentiation of autologous bone marrow stem cells by secreting exosomes | |
| Vento et al. | The effect of retinol on the lysosomal enzymes of bovine retina and pigment epithelium | |
| CN116270745A (zh) | 一种人脐带血来源外泌体改善不孕不育女性卵巢的应用 | |
| CN112538459A (zh) | 一种肝癌组织中的外泌体的分离方法 | |
| Eylar et al. | [15] Isolation of plasma membranes from mammalian cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |