CN115820544A

CN115820544A - 诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用

Info

Publication number: CN115820544A
Application number: CN202211168979.4A
Authority: CN
Inventors: 朱源源
Original assignee: Shanghai Shengshi Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Shengshi Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-09-25
Filing date: 2022-09-25
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了一种诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用。本发明通过离得到胚胎干细胞和成体表皮干细胞，对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因改造的胚胎干细胞。将成体表皮干细胞作为饲养层细胞对其进行细胞编程，得到诱导多能干细胞，并通过刺激得到其分泌的外泌体，发现该外泌体能够表达SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因，并且具有改善D‑半乳糖的衰老型小鼠的体重，清除小鼠体内自由基抑制机体氧化反应可改善衰老，保护肝脏；通过调控衰老蛋白Sirt3、Sirt4、Sirt5和p53含量，抑制促细胞凋亡基因Bax表达量的增多，对抗机体衰老。

Description

诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用

技术领域

本发明涉及诱导多能干细胞技术领域，具体涉及诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用。

背景技术

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)，是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。iPSCs在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选以及神经系统疾病、心血管疾病等临床疾病治疗等方面具有巨大的潜在价值。

发明内容

为此，本发明通过离得到胚胎干细胞和成体表皮干细胞，对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因改造的胚胎干细胞。将成体表皮干细胞作为饲养层细胞对其进行细胞编程，得到诱导多能干细胞，并通过刺激得到其分泌的外泌体，发现该外泌体能够表达SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因，并且具有改善D-半乳糖的衰老型小鼠的体重，清除小鼠体内自由基抑制机体氧化反应可改善衰老，保护肝脏；通过调控衰老蛋白Sirt3、Sirt4、Sirt5和p53含量，抑制促细胞凋亡基因Bax表达量的增多，对抗机体衰老。为此，本发明至少公开了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种诱导多能干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

分离来自脐带组织的胚胎干细胞和成体表皮干细胞；

对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造，获得基因改造的胚胎干细胞；

以成体表皮干细胞作为饲养层细胞对所述基因改造的胚胎干细胞进行共培养，分化得到诱导多能干细胞；

对诱导多能干细胞进行刺激得到外泌体。

进一步的，“对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造”的步骤包括：

构建携带SIRT3和GFP基因的第一病毒载体、携带SIRT4和GFP基因的第二病毒载体，携带SIRT5和GFP基因的第三病毒载体，以及携带Sox2和GFP基因的第四病毒载体；

分别将所述第一病毒载体、所述第二病毒载体、所述第三病毒载体和所述第四病毒载体转染293T细胞培养液，得到第一病毒液、第二病毒液、第三病毒液和第四病毒液；

将所述第一病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第一逆转录病毒液；

再将所述第一逆转录病毒液和所述第二病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第二逆转录病毒液；

将所述第二逆转录病毒液和所述第三病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；

将所述第三逆转录病毒液和所述第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。

分别构建携带SIRT3、SIRT4和GFP基因的第五病毒载体，携带SIRT5和GFP基因的第三病毒载体以及携带Sox2和GFP基因的第四病毒载体；

将所述第三病毒载体、所述第四病毒载体和所述第五病毒载体分别转染293T细胞培养液，得到第三病毒液、第四病毒液和第五病毒液；

将所述第三病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；

将所述第三逆转录病毒液和所述第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第四逆转录病毒液；

将所述第四病毒逆转录病毒液和所述第五病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。

进一步的，所述第一病毒载体的构建方法包括：获得SIRT3基因的cDNA，采用如SEQID NO.1所示的SIRT3-F和如SEQ ID NO.2所示的SIRT3-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到第一病毒载体；

所述第二病毒载体的构建方法包括：获得SIRT4基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.3所示的SIRT4-F和如SEQ ID NO.4所示的SIRT4-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到所述第二病毒载体；

所述第三病毒载体的构建方法包括：获得SIRT5基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.5所示的SIRT5-F和如SEQ ID NO.6所示的SIRT5-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到所述第三病毒载体；

所述第四病毒载体的构建方法包括：获得Sox2基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.7所示的SIRT5-F和如SEQ ID NO.8所示的SIRT5-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到第四病毒载体。

进一步的，所述第五病毒载体的构建方法包括：

通过重叠延伸技术扩增得到SIRT3和SIRT4的融合目的片段，再将该融合目的片段与经BamH I和HindⅢ双酶切后PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用下，于4℃条件下连接反应12h，将连接产物转化到DH5α中，细菌转化及克隆筛选，质粒少量提取，酶切鉴定，DNA测序鉴定，即可得到第五病毒载体。

进一步的，所述融合目的片段的获得包括：

利用SIRT3-F和如SEQ ID NO.9所示的SIRT3-R’扩增得到SIRT3的目的片段，利用如SEQ ID NO.10所示的SIRT4-F’和SIRT3-R扩增得到SIRT4的目的片段；

将SIRT3目的片段和SIRT4目的片段通过如SEQ ID NO.11所示的接头进行连接得到融合目的片段。

进一步的，所述成体表皮干细胞培养用培养基的制备步骤包括：用去离子水配制DMEM/F12(1:1)，添加体积分数为10％的FBS，0.05mM CaCl₂，10μg/L EGF，25mg/L牛垂体提取物，1.8×10^-4mol/L腺嘌呤，100kU/L青霉素，100mg/L链霉素，过滤除菌，4℃保存。

第二方面，本发明提供了一种抗衰老制剂，其包含如权利要求1～7任一所述的制备方法制得的诱导多能干细胞分泌的外泌体，用于分散和保持所述外泌体的含有5wt％FBS和5wt％DMEM/F12的DMSO溶液。

第三方面，本发明提供了第一方面所述的制备方法制得的诱导多能干细胞外泌体在制备抗衰老制剂中的应用。

现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：

本发明提供了一种诱导多能干细胞是来源于胚胎干细胞，其能够表达SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因，其分泌的外泌体也能表达SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因，并且该外泌体能够改善D-半乳糖的衰老型小鼠的体重，清除小鼠体内自由基抑制机体氧化反应可改善衰老，保护肝脏；通过调控衰老蛋白Sirt3、Sirt4、Sirt5和p53含量，抑制促细胞凋亡基因Bax表达量的增多，对抗机体衰老。

附图说明

图1为本发明实施例提供的胚胎干细胞的第2天(左图)和第7天(右图)的围观图。

图2为本发明实施例提供的成体表皮干细胞K19(左图)和β1(右图)免疫细胞化学染色图。

图3为本发明实施例提供的第一病毒载体(泳道1)、第二病毒载体(泳道2)、第三病毒载体(泳道3)、第四病毒载体(泳道4)、第五病毒载体(泳道5)、第六病毒载体(泳道6)的1％琼脂糖凝胶电泳图。

图4为本发明实施例1提供的包装生产逆转录病毒质粒转染48小时明视野(A图)和暗视野(B图)下293T细胞荧光显微图，感染UMC逆转录病毒感染胚胎干细胞72小时明视野(C图)和暗视野(D图)下胚胎干细胞荧光显微图。

图5为本发明实施例1、2和对比例1得到的基因改造胚胎干细胞中SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2的mRNA的相对表达量结果图。

图6为本发明实施例1、2和对比例1、2得到的基因改造细胞干细胞克隆的AP免疫荧光染色图。

图7为本发明实施例1、2和对比例1、2得到的诱导多能干细胞克隆的SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的免疫荧光染色图。

图8为本发明实施例1、2和对比例2得到的诱导多能干细胞外泌体中的SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2的相对表达量。

图9为本发明抗衰老动物试验中各组小鼠血清及肝脏生化指标检测结果图。

图10为本发明抗衰老动物试验中各组小鼠肝脏Sirt3、Sirt4、Sirt5、Bax和p53表达量检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

1、胚胎干细胞

手术切取2cm脐带组织，放入添加PBS液离心试管中，并用PBS液清洗组织三遍，用眼科剪刀将组织标木剪碎。加IV型胶原蛋白酶(2mg/mL，C6745，Sigma-Aldrich)与剪碎组织混匀，置于37℃、5％CO₂培养箱消化4小时，3000rpm，室温下离心10min，取沉淀，用含I型脱氧核糖核酸酶(1mg/mL，D5319，Sigma-Aldrich)的PBS溶液重悬细胞沉淀，置于37℃、5％CO₂培养箱消化15min，按上述离心条件再次离心，弃上清液。添加0.25％胰酶的PBS溶液重悬组织细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱消化15min，再次离心弃上清液。添加胚胎干细胞培养液(DMEM/F12+10％FBS)重悬组织细胞。应用40μm细胞容器过滤组织块，将滤液移入铺有明胶的培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。每天更换培养液，当细胞生长密度达95％以上时，进行细胞传代培养和冻存。

结果如图1所示，原代胚胎干细胞消化分离脐带组织第2天，镜下观察可见少量细胞贴壁生长，培养至第7天，胚胎干细胞数量增多呈短棒状、长梭形、三角形、锥形、有突起、胞膜有折光性。

2、饲养层细胞的制备

本发明实施例提供的饲养层细胞为成体表皮干细胞，其分离自人包皮环切术患者包皮。

一个成体表皮干细胞的分离实施例中，无菌条件下取包皮环切术患者包皮，用D-Hanks液洗2次，浸入含青霉素、链霉素的PBS溶液处理30min，无菌条件下彻底清洗，去除皮下组织，将包皮处理成4mm×4mm片状，用中性蛋白酶消化，4℃过夜后吸弃上清，D-Hanks液洗后，仔细分离表皮和真皮层，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA，37℃、5％CO₂条件下孵育15min，用含血清培养基终止消化，过800目筛，离心(1000r/min)6min；弃上清，用人表皮干细胞培养基重新悬浮细胞，吹打成单细胞悬液，苔盼蓝染色，以7.5×10⁸/L的密度接种于预先铺有人胎盘Ⅳ型胶原的培养瓶内(人胎盘Ⅳ型胶原为0.1％的醋酸溶液)，37℃、5％CO₂孵育箱中孵育10～15min后，吸出培养液及未贴壁细胞，吸弃未贴壁细胞成分，D-Hank’s液洗2次，加入适量新鲜表皮干细胞培养基培养，12h后换液以除去未贴壁细胞，以后2～3d换液1次。待细胞融合达到70％～80％时，以1:3比例传代。

在一个实施例中，成体表皮干细胞培养基的制备步骤包括：用去离子水配制DMEM/F12(1:1)，添加体积分数为10％的FBS，0.05mM CaCl₂，10μg/L EGF，25mg/L牛垂体提取物，1.8×10^-4mol/L腺嘌呤，100kU/L青霉素，100mg/L链霉素，过滤除菌，4℃保存。

在一个实施例中，得上述实施例分离得到的成体表皮干细胞进行免疫细胞化学染色，取第2代人表皮干细胞爬片，用0.01M pH＝6.8的PBS溶液洗涤2次，将爬片置于预冷的甲醇、丙酮混合液(体积比1:1)中，室温固定30min，再次用0.01M pH＝6.8的PBS溶液PBS洗涤2次，采用二步免疫组化检测法分别行细胞K19和β1整合素免疫细胞化学染色。同时用PBS代替一抗作空白对照。结果如图2所示，K19和β1免疫细胞化学染色均在细胞胞浆内出现，且呈棕黄色着色的阳性表达，说明分离得到了成体表皮干细胞。

3、胚胎干细胞的基因改造

哺乳动物Sirtuins蛋白家族包含7个成员(SIRT1～7)，它们均含有一个由约275个氨基酸组成的保守的核心催化结构域，依赖NAD+作为辅酶，发挥去乙酰化酶或ADP-核糖基转移酶的活性，参与许多重要生命过程的调控；其中，SIRT3和SIRT5均位于位于细胞的线粒体中，具有去乙酰化酶的活性，主要发挥生热和代谢功能。SIRT4也位于细胞的线粒体中，具有ADP核糖转移活性，发挥胰岛素分泌和代谢功能。

在本发明实施例中，用磷酸钙转染法将携带有SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒载体分别转染到至293T细胞内，包装生产携带目的基因的逆转录病毒上清液。收集病毒上清液感染胚胎干细胞，根据细胞感染GFP情况，初步判断包装生产逆转录病毒感染胚胎干细胞的效率，以收获得以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。将293T细胞(货号CL-0005，规格：1×10⁶cells/T25培养瓶，武汉普诺赛)传代至10cm的细胞培养皿中，当细胞生长密度达到100％时，以每培养皿4.0×10⁶cells进行分盘至6孔板中，备用。

在一个实施例1中，分别构建携带SIRT3和GFP基因的逆转录病毒载体(第一病毒载体)，携带SIRT4和GFP基因的逆转录病毒载体(第二病毒载体)，SIRT5和GFP基因的逆转录病毒载体(第三病毒载体)，以及携带Sox2和GFP基因的逆转录病毒载体(第四病毒载体)；分别将第一病毒载体、第二病毒载体、第三病毒载体和第四病毒载体转染293T细胞培养液(浓度不低于1×10⁶cells/mL)，得到第一病毒液、第二病毒液、第三病毒液和第四病毒液；将第一病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第一逆转录病毒液；再将第一逆转录病毒液和第二病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第二逆转录病毒液；将第二逆转录病毒液和第三病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；将第三逆转录病毒液和第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。

在一个实施例2中，分别构建携带SIRT3、SIRT4和GFP基因的逆转录病毒载体(第五病毒载体)，SIRT5和GFP基因的逆转录病毒载体(第三病毒载体)以及携带Sox2和GFP基因的逆转录病毒载体(第四病毒载体)；将第三病毒载体、第四病毒载体和第五病毒载体分别转染293T细胞培养液(浓度不低于1×10⁶cells/mL)，得到第三病毒液、第四病毒液和第五病毒液；将第三病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；将第三逆转录病毒液和第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第四逆转录病毒液；将第四病毒逆转录病毒液和第五病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。

在一个对比例1中，分别构建携带SIRT3、SIRT4、SIRT5和GFP基因的逆转录病毒载体(第六病毒载体)，以及携带Sox2和GFP基因的逆转录病毒载体(第四病毒载体)；将第四病毒载体和第六病毒载体分别转染293T细胞培养液(浓度不低于1×10⁶cells/mL)，得到第四病毒液和第六病毒液；将第四病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第四逆转录病毒液；将第四逆转录病毒液和第六病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。

在实施例1中，第一病毒载体的构建方法包括：

取健康小猪新鲜心脏组织，用Trizol试剂，按说明书步骤提取总RNA，测定其纯度并根据cDNA试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)的操作说明将其反转录为cDNA。

以cDNA为模板，PCR扩增包含SIRT3编码区的序列，根据GenBank上发表的猪SIRT3基因序列(GeneID：10012597)设计引物。引物序列为：上游引物SIRT3-F：cccaagcttatggcgctgtggtgtcgttcatc(Hind III酶切位点，SEQ ID NO.1)；下游引物SIRT3-R：cgcgga tccgccctcctatttgtcccaaccatc(BamH I酶切位点，下划线，SEQ ID NO.2)，扩增片段长度为1005bp。本试验所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。凝胶电泳后采用胶回收试剂Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0进行回收纯化，纯化产物进行测序鉴定。

PCR反应体系包括：以20μL为例KOD-FX 0.4μL，2×KOD-FX Buffer 10μL，2mM dNTP3.2μL，引物s1、s2各0.6μL，cDNA 1μL，dd H₂O补至20μL。PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共29个循环；68℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，切胶回收，纯化。

将PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体经BamH I和HindⅢ双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下，与上述PCR纯化产物于4℃条件下连接反应12h，将连接产物转化到DH5α中，细菌转化及克隆筛选，少量提取载体，酶切鉴定(质粒采用BamHⅠ和Hind III做双酶切鉴定)，DNA测序鉴定，即为PMX-IRES-SIRT3-GFP。

在实施例1中，第二病毒载体、第三病毒载体、第四病毒载体的构建方法均与第一病毒载体的构建方法相同。其中，SIRT4和SIRT5亦回收自小猪心脏组织，通过NCBI网站检测目的基因Sirt4的CDS区(GeneID:100125349)序列设计引物：SIRT4-F:cccaagcttcgggatccatgaagatgagctttgcgttgac(Hind III酶切位点，下划线，SEQ ID NO.3)和SIRT4-R:gcgcgg atccccgctcgagtcagcatgggtctatcaaaggcag(BamH I酶切位点，下划线，SEQ ID NO.4)，长度为900bp。Sirt5基因序列(GenID:100125966)的CDS区，设计引物，上游(SIRT5-F)：cccaagcttaacctgatgccacctctctgg,SEQ ID NO.5；下游(SIRT5-R)：cgcggatcccgggacgactaagagacaggtt，SEQ ID NO.6，进行pcr扩增，产物长度为947bp。通过NCBI网站检测目的基因Sox2的CDS区(GeneID:100714747)设计引物可做其保守序列的，Sox2-F：cccaagctt(HindIII酶切位点)tgcacaatgaaggagcaccc，SEQ ID NO.7；Sox2-R：cgcggatcc(BamHI酶切位点)ccgttcatgtaggtctgcga，SEQ ID NO.8，产物长度为355bp。

在实施例2中，第五病毒载体的构建方法包括：通过重叠延伸技术扩增得到SIRT3和SIRT4的融合目的片段，再将该融合目的片段与经BamH I和HindⅢ双酶切后PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用下，于4℃条件下连接反应12h，将连接产物转化到DH5α中，细菌转化及克隆筛选，质粒少量提取，酶切鉴定(载体采用BamHⅠ和HindIII做双酶切鉴定)，DNA测序鉴定，即为PMX-IRES-SIRT3/4-GFP。具体步骤包括：

引物设计：SIRT3-F：cccaagcttatggcgctgtggtgtcgttcatc(引入Hind III酶切位点，下划线)；SIRT3-R’：gccctcctatttgtcccaaccatc,如SEQ ID NO.9所示；

SIRT4-F’：cgggatccatgaagatgagctttgcgttgac,如SEQ ID NO.10所示；

SIRT4-R：gcgggatccccgctcgagtcagcatgggtctatcaaaggcag(引BamH I酶切位点入，下划线)。

分别获得SIRT3目的片段和SIRT4目的片段。根据

GXLDNAPolymerase说明书进行SIRT3和SIRT4目的片段进行PCR扩增。PCR反应体系：模板0.5μL，引物(SIRT3包括SIRT3-F和SIRT3-R，SIRT4包括SIRT4-F和SIRT4-R)各0.2μL，5×PrimeSTARGXLBuffer10μL，dNTP Mixture 4μL，PrimeSTARGXL DNA Polymerase 1μL，用ddH₂O补充至50μL。反应条件：98℃预变性4min；98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃再延伸5min。取PCR产物通过1％琼脂糖凝胶进行电泳，并根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行目的基因的回收。

将SIRT3目的片段和SIRT4目的片段通过接头(GGGGSGGGGSGGGGS，如SEQ IDNO.12)DNA序列(如)GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC，如SEQ IDNO.11)进行连接，得到融合目的片段。连接体系：SIRT3 20μL，SIRT4 20μL，T4 DNA Ligase5μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 5μL。混匀后16℃金属浴过夜。取融合目的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳后回收。以融合目的片段的胶回收物为模板、以SIRT3-F和SIRT4-R为引物进行融合目的片段SIRT3-SIRT4(以下简称SIRT3/4)的PCR扩增，体系如同上。反应条件：98℃预变性4min；98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min 30s，共30个循环；68℃再延伸5min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收。

将PCR胶回收产物SIRT3/4经BamHI和HindIII双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体进行连接，在T4 DNA连接酶作用下，与上述PCR纯化产物于4℃条件下连接反应12h，将连接产物转化到DH5α中，细菌转化及克隆筛选，质粒少量提取，酶切鉴定(质粒采用BamHI和HindIII做双酶切鉴定)，DNA测序鉴定，即为PMX-IRES-SIRT3/4-GFP。

在对比例1中，第六病毒载体的构建方法包括，通过上述方法得到融合目的片段SIRT3/4，在分别以SIRT3-F和SIRT4-R为引物进行融合目的片段SIRT3-SIRT4(以下简称SIRT3/4)的PCR扩增，体系和扩增条件如同上，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收，得到带有酶切位点序列的SIRT3/4；再将琼脂糖凝胶DNA回收产物多肽接头(Gly-4Ser)-3DNA序列进行连接。连接体系：SIRT3/4 20μL，SIRT5 20μL，T4 DNA Ligase 5μL，10×T4DNA Ligase Buffer 5μL。混匀后16℃金属浴过夜。取连接产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后回收。

以胶回收产物为模板、以SIRT3-F和SIRT5-R为引物进行融合目的片段SIRT3-SIRT4-SIRT5(以下简称SIRT3/4/5)的PCR扩增，体系如同上。反应条件：98℃预变性4min；98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min 30s，共30个循环；68℃再延伸5min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收。

将PCR胶回收产物SIRT3/4/5经BamH I和Hind III双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体进行连接，在T4 DNA连接酶作用下，与上述PCR纯化产物于4℃条件下连接反应12h，将连接产物转化到DH5α中，细菌转化及克隆筛选，质粒少量提取，酶切鉴定(质粒采用BamHⅠ和HindIII做双酶切鉴定)，DNA测序鉴定，即为PMX-IRES-SIRT3/4/5-GFP。

上述实施例1、2和对比例1中制得的第一病毒载体(PMX-IRES-SIRT3-GFP)、第二病毒载体(PMX-IRES-SIRT4-GFP)、第三病毒载体PMX-IRES-SIRT5-GFP、第四病毒载体(PMX-IRES-Sox2-GFP)、第五病毒载体(PMX-IRES-SIRT3/4-GFP)和第六病毒载体(PMX-IRES-SIRT3/4/5-GFP)的1％琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。

如图4所示，包装生产逆转录病毒质粒转染48小时荧光显微镜下观察明暗视野下293T细胞，可见暗视野下293T细胞发出绿色荧光，表明293T细胞成功的包装生产携带GFP基因的逆转录病毒。感染UMC逆转录病毒感染胚胎干细胞72小时，荧光显微镜下观察可见对照组胚胎干细胞发出绿色荧光达100％左右，说明成功的感染了胚胎干细胞。

本发明实施例利用第一逆转录病毒将SIRT3和GFP转染到293T细胞内，利用第二逆转录病毒将SIRT4和GFP转染到293T细胞内，利用第三逆转录病毒将SIRT5和GFP转染到293T细胞内，利用第四逆转录病毒将Sox2和GFP转染到293T细胞内，包装生产携带目的基因的逆转录病毒上清液来感染体细胞。质粒转染后48小时荧光显微镜下观察对照组293T细胞，可见细胞发出绿色荧光，表明GFP基因己被转然到293T细胞，GFP基因在293T细胞能够稳定的表达。

采用RNeasy Mini试剂盒分离纯化实施例1、2和对比例1分别得到SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞中的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度，设计引物：SIRT3-F’:atggcgctgtggtgtcgttcatc，SEQ ID NO.13，SIRT3-R’:gccctcctatttgtcccaaccatc；SIRT4-F’:cgggatccatgaagatgagctttgcgttgac，SIRT4-R’:ccgctcgagtcagcatgggtctatcaaaggcag，SEQ ID NO.14；

SIRT5-F’:aacctgatgccacctctctgg，SEQ ID NO.15，

SIRT5-R’:cgggacgactaagagacaggtt，SEQ ID NO.16；

Sox2-F2:tgcacaatgaaggagcaccc，SEQ ID NO.17，

Sox2-R2:ccgttcatgtaggtctgcga，SEQ ID NO.18；

进行RT-PCR扩增，并设计并合成内参照β-actin引物，Sense：tgagcgcaagtactctgtgtggat，Antisense：actcatcgtactcctgcttgctga，扩增产物的片段长度为95bp。参照OneStep RT-PCR试剂盒实验操作说明进行RT-PCR，以空白组为对照，采用2^-△△CT法分别计算SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2的mRNA的相对表达量。结果如图5所示。由图5可知，实施例1、2得到的基因改造胚胎干细胞中SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2的mRNA的相对表达量均显著高于对比例1，并且对比例1得到的基因改造胚胎干细胞中Sox2几乎无表达。

4、胚胎干细胞向诱导多能干细胞分化

进一步的，本发明实施例将经过上述基因改造的胚胎干细胞接种到饲养层细胞液中培养，来促使基因改造的胚胎干细胞编程为诱导多能干细胞。

在一个实施例1中，将饲养层细胞到Transwell板中，培养24h后应用DMEM/F12培养基清洗培养皿中的饲养层细胞，并将培养皿中细胞培养基更换为DFBS培养基，并添加维生素C和丙戊酸；

取实施例1制得的经过基因改造的胚胎干细胞的悬浮液转移至10cm培养皿中吸除培养液，添加DFBS培养基(Defined Fetal Bovine Serum，Thomas Scientific)，置于37℃、5％CO₂培养箱培养5天，每天更换DFBS培养基；第6天将经基因改造的胚胎干细胞转移至Transwell皿中(膜直径75mm，孔径0.4μm，Costar)，1×10⁴/每皿密度，将Transwell皿置于Transwell板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养18天，每天更换DFBS培养基；第19天，更换培养基为KSR培养基(Invitrogen公司)培养至第30天后，分离其中的诱导多能干细胞的克隆，并对该克隆进行传代培养，必要时对该诱导多能干细胞进行冻存。

在一个诱导多能干细胞克隆的分离实施例中，将上述培养第30天的培养液置于紫外照射30min，显微镜下用圆头吸管切割、剥离选好的诱导多能干细胞克隆，用断口吸管吸入选好的细胞克隆，并将其转移到铺有饲养层细胞的12孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，每天更换KSR培养液。

在一个诱导多能干细胞传代培养的实施例中，将复苏饲养层细胞，更换培养基为KSR培养基后置于37℃、5％CO₂培养箱过夜培养24h后。吸弃KSR培养基，用DMEM/F12清洗诱导多能干细胞克隆，用新中性蛋白酶液消化诱导多能干细胞克隆2～5min，所述中性蛋白酶液包含0.lg中性蛋白酶(纯度99％，上海跃腾生物技术有限公司)和100mL DMEM/F12溶液，镜下观察如细胞克隆出现金边应终止消化。用1mL移液枪头将细胞克隆从孔板表面刮起，刮完后用巴氏吸管轻轻吹打，帮助细胞从板底表面脱落。将细胞团悬液收集到离心试管内，1058rpm，室温下离心5min，弃上清液。添加新鲜KSR培养基，轻轻吹打重悬细胞团块(注意细胞团块不能吹的太散)。根据细胞生长密度按比例传代，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，每天更换KSR培养基。

在一个诱导多能干细胞冻存的实施例中，应用DMEM/F 12清洗诱导多能干细胞一遍，加入Dispase液，置于37℃、5％CO₂培养箱消化3min。用移液枪头将诱导多能干细胞克隆从孔板表面刮起，收集到离心管中，1200rpm室温下离心5min，弃上清液。逐滴加入诱导多能干细胞冻存液(C0210，碧云天)，轻轻振荡混匀，按1mL/每冻存管分装(注意标明细胞名称、代数、冻存时间)，将冻存管放入程序降温盒中，在-800C冰箱过夜，第二天转移到液氮罐中长期保存。

在一个实施例2中，其将实施例2基因改造的胚胎干细胞分化得到诱导多能干细胞的步骤与实施例1相同。

在一个对比例1中，其将对比例1基因改造的胚胎干细胞分化得到诱导多能干细胞的步骤与实施例1相同。

在一个对比例2中，其将实施例1得到的基因改造的胚胎干细胞进行无饲养层培养，以分化都得诱导多能干细胞。具体包括：前向六孔板中添加新鲜配置的BD Matrigel基质胶液(0.lg粉状Matrigel+100m1DMEM/F 12)，置于37℃、5％CO₂氧化碳培养箱包被板底30min。吸弃实施例1得到的基因改造的胚胎干细胞中的培养基，用DMEM/F 12清洗诱导多能干细胞克隆，Dispase消化细胞2-5min，用移液枪头刮起孔板表面细胞克隆，收集到离心试管内，离心弃上清液。添加新鲜mTeSR^TM1培养基(货号:85850，北京诺为生物)重悬细胞团块。吸弃BD Matrigel基质胶液，将重悬的诱导多能干细胞团块按比例接种到包被Matrigel的六孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，每天甲换mTesrl培养基。

5、诱导多能干细胞的鉴定

将要做碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色及免疫荧光的诱导多能干细胞(实施例1、2和对比例1、2提供)传代至4孔板中，细胞融合至40％～50％时，用PBS洗3次，加入适当4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3次。加入足量工作浓度的AP染液室温避光15min，PBS清洗1次后加入1ml PBS，镜下观察染色结果。免疫荧光：将固定好的细胞，用含3％胎牛血清白蛋白(sigma)和0.3％Triton-100通透2h，PBS洗3次，每次5min。用封闭液释稀一抗溶液(一抗溶液包含八聚体结合转录因子4(OCT4)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60))1∶200稀释，4℃杂交过夜；PBS洗3次后，二抗(1∶500稀释)室温杂交2h，PBS洗3次，每次5min。最后1mg/L DAPI室温核染10min，PBS洗3次后加入适当PBS，聚焦显微镜下观察。本实验所用抗体均购自美国Abcam公司。

结果如图6、7所示，除对比例1外，实施例1、2和对比例2提供的细胞克隆经AP染色和SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的免疫荧光染色均为阳性。由此说明，实施例1、2和对比例2提供的细胞克隆为诱导多能干细胞，并且采用对比例1中方法对胚胎干细胞进行基因改造，即使采用饲养层细胞对其共培养和刺激分化，也无法得到诱导多嫩干细胞。

6、诱导多能干细胞的外泌体分泌、提取和鉴定

实施例1中，将其获得的诱导多能干细胞，用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基，37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养。作如下分组:(1)5μM 6,7,8,9-四氢-5H-嘧啶并[4,5-B]吲哚-4-醇(CAS:82703-36-4,纯度：98％,上海毕得医药科技股份有限公司)处理诱导多能干细胞24h，检测细胞培养液中外泌体量。低温超高速离心法提取外泌体，操作步骤如下：300g离心10min，去除残余细胞，2 000g离心10min去除死细胞，10000g离心30min去除细胞碎片；0.22μm滤膜过滤后取上清，经100000g离心70min，PBS洗涤1次后重悬，再次100000g离心70min，所得沉淀即为外泌体。用无菌PBS重悬后，-80℃低温保存备用。

实施例2和对比例2中，采用与实施例1相同的方法，采用6,7,8,9-四氢-5H-嘧啶并[4,5-B]吲哚-4-醇处理对应实施例2和对比例2分别得到的诱导多能干细胞，从而得到对应的外泌体。

对比例3中，采用与实施例1相同的方法，利用5μM莫能菌素处理实施例1得到的诱导多能干细胞，结果并未从其细胞处理液汇总分离提取得到外泌体。

如图8所示，分别对实施例1、2和对比例2分离得到的外泌体进行电镜鉴定并拍照，采用纳米粒径分析法(NTA)检测外泌体的粒径分布为125±36nm，并通过WB试验检测外泌体中的标志蛋白CD9和CD63为阳性表达。

将实施例1、2和对比例2分离得到的外泌体沉淀用牛血清稀释配制成1mg/L的溶液作为供试品溶液，采取固相夹心ELISA法检测SIRT3、SIRT4、SIRT5和SOX2的表达量，具体采用相关ELISA试剂盒(SIRT3-ELISA试剂盒，货号CEH4451，CRK Pharma；SIRT4-ELISA试剂盒，货号BJ-E2494，上海邦景；SIRT5-ELISA试剂盒，货号BJ-E2493，上海邦景；SOX2-ELISA试剂盒，货号ZC-34341，茁彩生物)，并根据其说明书严格执行检测步骤，检测该供试品溶液中SIRT3、SIRT4、SIRT5和SOX2的浓度，根据该浓度计算其在外泌体上的质量百分比。结果如图8所示，实施例1和2提供的外泌体中SIRT3、SIRT4、SIRT5和SOX2的表达量均显著高于对比例2。由此说明，采用6,7,8,9-四氢-5H-嘧啶并[4,5-B]吲哚-4-醇处理诱导多能干细胞不仅有利于外面体的分泌，还能促进其SIRT3、SIRT4、SIRT5和SOX2的表达。

7、抗衰老动物试验

(1)试验动物

雄性SD小鼠若干，体重25±2g，清洁级，购买于西安交通大学医学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK(陕)2012-003。

供试品制备：分别称取实施例1、2和对比例2提供的外泌体沉淀200mg，用1L含有5wt％FBS和5wt％DMEM/F12的DMSO分散后作为供试品，4℃冷藏保存待用。

(2)动物分组、造模及给药处理

SD小鼠随机分为分别为空白组、衰老模型组、实施例1组、实施例2组、对比例2组和VC组，每组10只。所有动物实验均按照实验动物机构指南进行。药物给药剂量根据临床常用剂量，按照人和动物间体表面积折算的等效剂量比值进行换算，动物适应性饲养一周后，除空白组外，各组每日腹腔注射D-半乳糖(120mg/kg)造模，空白组每日腹腔注射生理盐水，同时实施例1组、实施例2组和对比例2组分别灌胃280mg/kg的实施例1制得的供试品溶液，VC组灌胃100mg/kg的VC注射液(双鹤药业)，空白对照组及衰老模型组灌胃等容积生理盐水，连续给药六周。

(3)各组小鼠的行为活动观察、体重和脏器指数测定

给药6周后，衰老模型组小鼠随着造模后体质量增加缓慢，食欲差、皮肤松弛、活动量明显减少等现象，提示衰老模型组小鼠出现衰老症状，实施例1组和实施例2组小鼠体重不断增加，小鼠皮肤状态及活动量有所改善；而对比例2组的小鼠体重和行为情况与衰老模型组相当。

(4)血清及肝脏生化指标检测

末次给药后禁食不禁水12h后，眼球取血，3500r/min离心20min后，分离血清。取小鼠部分肝脏加冰浴过的生理盐水制备10％的肝组织匀浆2mL，12000r/min低温离心10min，分离上清液，将其与血清混合得到样品液。采用试剂盒测定样品液中SOD、MDA、GSH-Px、CAT含量(SOD试剂盒，货号E-BC-K019-S；MDA试剂盒，货号E-BC-K025-S，GSH-Px试剂盒，货号E-BC-K096-S、CAT试剂盒，货号E-BC-K031-S，均购自武汉伊莱瑞特)。结果如图9所示，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠的肝脏中SOD、CAT、GSH-Px活性极显著降低，MDA含量极显著增加(P<0.01)，说明造模成功。

与衰老模型组相比，实施例1和2提供的以外泌体为基础制得的供试品可显著提高小鼠肝脏中SOD、CAT、GSH-Px含量，降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)，而对比例2则对小鼠肝脏中SOD、CAT、GSH-Px含量的改善效果有限。衰老机体产生大量自由基诱导脂质过氧化产物MDA的生成，而同时机体中重要的抗氧化酶含量下降，因此清除自由基抑制机体氧化反应可改善衰老。由此说明，本发明提供的外泌体能明显抑制血清及肝脏中MDA含量，增加SOD、CAT、GSH-Px含量，表现出较好的抗氧化、保护肝脏、抗衰老的作用。

(5)Western Blot检测肝脏组织中衰老蛋白表达

取-80℃保存的肝脏组织，裂解，12000r/min，4℃离心10min。取上清液蛋白定量，剩余与5×loadingbuffer混合，恒温金属浴100℃变性10min后保存备用。用8％SDS-多聚酰胺凝胶电泳分离，湿法转移蛋白到PVDF膜上。膜用5％脱脂牛奶溶液室温封闭1h，分别加入特异性一抗Sirt3(1:500)、Sirt4(1:500)、Sirt5(1:500)、p53(1:500)、Bax(1:500)、GAPDH(1:2000)孵育(Abcam)，4℃过夜。用TBST洗膜5次后与二抗结合(抗鼠或抗兔1:5000)室温孵育1h后，TBST洗膜5次。发光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0software分析。

如图10所示，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠的肝脏中Sirt3、Sirt4和Sirt5蛋白量极显著降低(P<0.01)，Bax和p53蛋白表达量极显著增加(P<0.01)。与衰老模型组相比，实施例1和2提供的供试品能够显著地提高肝组织Sirt3、Sirt4和Sirt5蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，降低Bax、p53蛋白表达(P<0.01)。由此可知，Sirt3、Sirt4和Sirt5的激活对衰老调节因子p53和Bax有明显的抑制作用，从而减少细胞凋亡，延缓衰老。由此表明本发明提供的外泌体可通过调控衰老蛋白Sirt3、Sirt4、Sirt5和p53含量，抑制促细胞凋亡基因Bax表达量的增多，对抗机体衰老。

综上所述，本发明通过分离得到胚胎干细胞和成体表皮干细胞，对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因改造的胚胎干细胞。将成体表皮干细胞作为饲养层细胞对其进行细胞编程，得到诱导多能干细胞，并利用6,7,8,9-四氢-5H-嘧啶并[4,5-B]吲哚-4-醇对诱导多能干细胞进行处理促进其分泌一种表达CD9、CD63、SIRT3、SIRT4、SIRT5和SOX2的外泌体。将该外泌体应用于D-半乳糖的衰老型小鼠体内时，不仅对小鼠行为和肝脏无毒副作用，而且能够改善小鼠体重，清除小鼠体内自由基抑制机体氧化反应可改善衰老，保护肝脏；通过调控衰老蛋白Sirt3、Sirt4、Sirt5和p53含量，抑制促细胞凋亡基因Bax表达量的增多，对抗机体衰老。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种诱导多能干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

分离来自脐带组织的胚胎干细胞和成体表皮干细胞；

对诱导多能干细胞进行刺激得到外泌体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，“对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造”的步骤包括：

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，“对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造”的步骤包括：

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一病毒载体的构建方法包括：获得SIRT3基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.1所示的SIRT3-F和如SEQ ID NO.2所示的SIRT3-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到第一病毒载体；

所述第二病毒载体的构建方法包括：获得SIRT4基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.3所示的SIRT4-F和如SEQ ID NO.4所示的SIRT4-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到所述第二病毒载体；

所述第三病毒载体的构建方法包括：获得SIRT5基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.5所示的SIRT5-F和如SEQ ID NO.6所示的SIRT5-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到所述第三病毒载体；

所述第四病毒载体的构建方法包括：获得Sox2基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.7所示的SIRT5-F和如SEQ ID NO.8所示的SIRT5-R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamHI和HindⅢ双酶切的PMX-IRES-GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到第四病毒载体。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第五病毒载体的构建方法包括：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述融合目的片段的获得包括：

利用SIRT3-F和如SEQ ID NO.9所示的SIRT3-R’扩增得到SIRT3的目的片段，利用如SEQID NO.10所示的SIRT4-F’和SIRT3-R扩增得到SIRT4的目的片段；

7.根据权利要求1～6任一所述的制备方法，其特征在于，所述成体表皮干细胞培养用培养基的制备步骤包括：用去离子水配制DMEM/F12(1:1)，添加体积分数为10％的FBS，0.05mM CaCl₂，10μg/L EGF，25mg/L牛垂体提取物，1.8×10^-4mol/L腺嘌呤，100kU/L青霉素，100mg/L链霉素，过滤除菌，4℃保存。

8.一种抗衰老制剂，其包含如权利要求1～7任一所述的制备方法制得的诱导多能干细胞分泌的外泌体，用于分散和保持所述外泌体的含有5wt％FBS和5wt％DMEM/F12的DMSO溶液。

9.如权利要求1～7任一所述的制备方法制得的诱导多能干细胞外泌体在制备抗衰老制剂中的应用。