CN103275935B - SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法 - Google Patents

Abstract

SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法，属于生物医学方法。本发明通过PCR分别获得Lmx1a基因和嵌合NTN基因的编码序列，经同源重组在HEK-293细胞中分别包装重组腺病毒Ad-Lmx1a和Ad-NTN。再将Ad-Lmx1a感染rASCs，用SHH/FGF-8等细胞因子将rASCs诱导至待命状态，再感染Ad-NTN，加入B27，N2 supplement，bFGF等诱导剂。本发明显著提高rASCs向神经元细胞分化的潜能，相关转录因子能应用于帕金森氏病的未来细胞替代治疗中。

Description

SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法

技术领域

    本发明属于生物医学，特别是诱导干细胞替代缺损的神经元细胞以治疗帕金森氏病的方法。

背景技术

神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases，ND）是一类以神经元退行性病变或神经元细胞凋亡，而导致机体表现为神经系统疾病为主要特征的疾病。帕金森氏病（Parkinson’s Disease，PD）是神经退行性疾病的常见病之一，以中脑黑质纹状体多巴胺能神经元变性坏死，多巴胺（Dopamine，DA）合成减少为特征的常见的缓慢进展的神经系统退行性疾病，临床上表现为静止性震颤，肌肉僵直、运动迟缓与体位不稳等症状。PD主要发生于老年期，患病率仅次于糖尿病、冠心病、脑血管病。研究发现，脑力劳动人群是帕金森氏病的易感人群，且PD发病率逐年上升，药物治疗的副作用限制了帕金森氏病的长期治疗。这些治疗手段大多都局限于缓解症状，未能根本上恢复病灶部位的正常功能。因此，希望能研制一种安全、能恢复黑质纹状体系统功能而达到缓解其症状的治疗方法。

细胞治疗是目前再生医学研究的热点, 在损伤修复治疗中具有广阔前景。由于胚胎干细胞研究受伦理因素和其他因素的限制。因此，具有组织修复特性、自我更新及增殖分化特性的间充质干细胞的应用为临床组织缺陷性疾病和神经退行性疾病的细胞替代治疗和基因治疗开拓了新途径。干细胞治疗帕金森氏病研究的重点在于能否找到真正可替代缺损神经元细胞并与黑质纹状体系统整合的细胞源。研究表明，考虑到临床应用的可行性，将成体干细胞诱导为可替代缺损细胞的神经元细胞是干细胞治疗帕金森氏病研究的一个重要途径。

干细胞治疗疾病涉及到多个环节，选择合适的材料至关重要。LIM homeobox转录因子 （LMX1a）是多巴胺神经元发育形成过程中的关键内源性决定因子。NTN（Neurturin）能够特异地作用于中脑多巴胺能神经元，对多巴胺能神经元具有明显的营养和保护作用，在维持多巴胺能神经元细胞存活上起重要的调节作用。

发明内容

本发明目的是通过Lmx1a进行内源性调控，NTN营养支持保护和外源性诱导因子SHH相结合，诱导恒河猴来源的脂肪间充质干细胞（Rhesus adipose stem cells，rASCs）分化为神经元细胞。

本发明通过以下途径实现，包括：：

    （1）Lmx1a基因克隆和嵌合NTN基因克隆及重组质粒的构建

（a)Lmx1a基因克隆及重组质粒

以Lmx1a whole transcript cDNA（NM_138396）为模板，引物为：

P1 up：5-‘GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3’，

P1 down：5’-CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3’，

    通过PCR扩增获得带SalI和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle-CMV中，通过Sal I和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a；

(b)嵌合NTN基因克隆及重组质粒

人工合成含NGF信号肽和pro肽的基因；

通过PCR搭桥将NTN的成熟肽基因与NGF信号肽基因和pro肽基因连接获得嵌合基因NGF/NTN，引物为：

Ｐ2 up：５′ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣ３′，

P2 down：５′ＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣ３′

回收纯化NGF/NTN的PCR产物，同时对纯化产物NGF/NTN和穿梭质粒pShuttleCMV进行双酶切，将NGF/NTN克隆至穿梭质粒pShuttleCMV启动子的下游，得重组穿梭质粒pShuttleCMV-NGF-NTN，将其转化至DH5α感受态，筛选阳性克隆；NTN营养支持保护

    （2）重组腺病毒的构建与包装

将步骤（1）重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a和pShuttleCMV-NGF-NTN先后用PmeI线形化和CIAP进行5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒，筛选阳性克隆；

筛选出的pAdEasy-1重组质粒经过鉴定后转化XL-10(Gold),扩增、提取质粒，使质粒浓度达到0.1μg/μL，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒Ad-NGF/NTN和Ad-Lmx1a，诱导10天，细胞病变，脱落形成串珠状，漂浮于上清液中。

（3）rASCs向DA能神经元诱导

（a）诱导前一天，取rASCs第二代细胞，接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM；

（b）当细胞汇合率达95%时，以最佳MOI加入Ad-Lmx1a感染rASCs，感染后换液为诱导液I进行预诱导，诱导3天后换液为含2%FBS的L-DMEM，再以最佳MOI加入Ad-NGF/NTN感染rASCs。

（c）24h并确认rASCs都表达Lmx1a和NTN蛋白后，换液为诱导液II，每隔3天半量换液， 每三天半量换液一次，直至21天，细胞发出细长的突触，相互连接最后交联形成网络状，神经元形态的细胞数量大量增多。

    进一步，所述方法的步骤（3）培养rASCs第二代细胞：

氯胺酮麻醉恒河猴, 无菌条件下取6kg成年恒河猴大网膜脂肪组织1~2g。 PBS中洗涤去除残存的血迹，分离血管和纤维成分, 0.1% I型胶原酶,37℃消化1h；

消化完成后,加入与I型胶原酶等体积的含10%新生小牛犊血清的L-DMEM培养液终止消化,过滤,1500 r/min离心3 min, 弃上清, 吸取底部沉淀用于rASCs培养；

以1×10⁶接种于T-25培养瓶中，37℃，5%CO₂条件下细胞培养中培养4天，至单层贴壁细胞贴壁率接近90%时，0.25%胰蛋白酶消化，1:2传代，之后随细胞扩增至90%时，按1:2持续体外传代培养。

本发明通过PCR技术分别获得Lmx1a基因和嵌合NTN基因的编码序列，经同源重组，在HEK-293细胞中分别包装出重组腺病毒Ad-Lmx1a和Ad-NTN，体外活性实验证实：合成并包装的Ad-NTN表达的NTN能够促进鸡胚背根神经节生长，还能促进胎鼠多巴胺能神经元存活。在上述工作后，本发明将Ad-Lmx1a感染rASCs，并确认细胞表达Lmx1a后，利用SHH/FGF-8等细胞因子将rASCs诱导至待命（standby）状态，3天后再感染Ad-NTN，确认表达Lmx1a和NTN蛋白后，再加入B27，N2 supplement，bFGF等诱导剂进一步诱导，每三天半量换液一次，直至21天。通过RT-PCR和免疫荧光实验检测，诱导后的细胞表达nestin、β-tubulin III、microtubule-associated protein 2 (MAP-2)、neuron-specific enolase (NSE) 和TH。并通过体外DA分泌活性检测实验，证明诱导后的细胞能够分泌少量多巴胺，具有一定生理活性。

    野生型NTN的基因分别由编码信号肽(signal peptide)、pro肽（pro-peptide）和成熟肽(mature peptide) 组成。但研究指出，野生型NTN不能在体外动物细胞中加工和分泌。本发明结合“Neurturin 嵌合神经营养因子重组腺病毒的构建及体外活性测定”（王文举，孙茂盛，严敏，李鸿钧；中国生物工程杂志，2010， 30( 9) : 7-12）所公开的方法，将NGF的信号肽和pro肽与NTN的成熟肽进行连接，形成一个嵌合基因，即保留其成熟肽，更换信号肽以促进NTN的成熟和分泌。由于NGF的pro肽中的两个结构域能够帮助NTN前体加工成为具有生物学活性的蛋白的功能，所以翻译得到的嵌合NTN前体能够对自身进行加工和成熟，形成具有生物学活性的NTN分泌到胞外。

本发明的实验结果表明：

SHH介导Lmx1a调控NTN修饰的rASCs在相应外源性蛋白共同作用下能够显著提高rASCs向神经元细胞分化的潜能，相关分子机制可能涉及SHH/Lmx1a信号通路和一系列的转录因子级联反应，相关转录因子能够应用于帕金森氏病的未来细胞替代治疗中。尽管诱导方案还需深入探索，但本发明为进一步开展的脂肪干细胞诱导后移植治疗帕金森氏病动物实验打下了良好的基础。

附图说明

 图1是Lmx1a基因克隆及其重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a筛选结果 (A) Lane1, DNA marker DL, 2000; Lane2, Lmx1a PCR产物(1149bp) ; (B) Lane1, DNA marker DL, 5000; Lane2, Sal I and EcoR V酶切分析重组质粒pShuttleCMV-Lmx1a。

 图2是NGF/NTN基因克隆及其重组穿梭质粒pShuttleCMV- NGF/NTN筛选结果。(A) Lane1, NGF/NTN PCR产物(671bp)，Lane2, DNA marker DL, 5000 ; (B) Lane1, Sal I and Hind III酶切分析重组质粒pShuttleCMV-NGF/NTN， Lane2, DNA marker DL, 2000。

图3是重组腺病毒质粒pAdEasy-Lmx1a和pAdEasy-NGF/NTN的筛选。1 、2 是重组腺病毒质粒经 Pac I 酶切，分别产生3.0 kb和 4.5kb的片段; 3, DNA marker DL,15000。

图4是重组腺病毒在HEK-293中的包装产生的细胞病变（200×）及透射电镜观察重组腺病毒负染结果。（A）对照细胞（B）病变细胞（C）重组腺病毒负染结果。

 图5是rASCs形态学特征及增值指数（PI）测定：(A) rASCs 在显微镜下的细胞形态 (B,C) rASCs 中BrdU免疫荧光和免疫组化显色. Scale bar: 100 μm。

图6 是rASCs特异性标志分子流式检测及免疫荧光显色结果(A)及rASCs成骨成脂诱导结果。(a1,a2)油红O染色鉴定成脂诱导结果；(b1,b2)ALP染色鉴定成骨诱导结果；(c1,c2)茜素红染色鉴定成骨诱导结果。

 图7是Ad-Lmx1a和Ad-NGF/NTN感染rASCs后蛋白及活性检测（A）免疫印迹检测Lmx1a在rASCs中的表达；（B）免疫印迹检测NTN在rASCs中的表达;(C) 鸡胚背根神经节活性检测对照；（D）鸡胚背根神经节活性检测组；（E-F）免疫荧光检测Lmx1a在rASCs中的表达情况；（G-H）免疫荧光检测NTN在rASCs中的表达情况。

图8是rASCs向DA能神经元诱导的诱导液组分图，其中浓度均为工作浓度。

图9是诱导后rASCs形态变化图。

图10是多巴胺能神经元特异性蛋白质Real-Time PCR检测结果。

图11是免疫荧光检测诱导rASCs特异性神经元蛋白表达（A）Lmx1a、NTN、β-tubulin III、Nefm、nestin、MAP-2、NSE和TH免疫荧光结果。

图12是免疫荧光检测诱导rASCs特异性神经元蛋白表达（B）nestin, β-tubulin III, MAP-2, TH, and NSE 在诱导后rASCs中的表达效率。

图13是ELISA检测诱导rASCs多巴胺释放情况。

以下结合附图对本发明做进一步说明，。

具体实施方法

1、Lmx1a基因和嵌合NTN基因克隆及重组质粒的构建

以Lmx1a whole transcript cDNA（NM_138396）为模板，引物为：

P1 up：5’-GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3’，

P1 down：5’-CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3’，

通过PCR扩增获得了带SalI和EcoRV酶切位点的DNA片段，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测分析，扩增的条带与理论分子量吻合，结果见图1A。将扩增片段插入pShuttle-CMV中，重组克隆通过SalI和EcoRV双酶切鉴定，结果见图1B。重组克隆进行测序，测序结果与理论结果一致。

以上Lmx1a whole transcript cDNA（NM_138396）为GeneCopoeiaTM公司生产。

将NTN成熟肽基因通过PCR搭桥方式与人工合成的NGF信号肽和pro肽的基因相连，引物为：

Ｐ2 up：５′ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣ３′，

P2 down：５′ＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣ３′，

所获得的嵌合NTN基因结果见图2A。将扩增获得的嵌合NGF/NTN的PCR产物进行胶回收纯化，同时对纯化产物NGF/NTN和穿梭质粒pShuttleCMV进行双酶切，将NGF/NTN克隆至穿梭质粒CMV启动子的下游。连接产物转化至DH5α感受态，筛选阳性克隆，重组克隆通过Sal I和HindIII双酶切鉴定，结果见图2B。

2. 重组腺病毒的构建与包装

将重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a和pShuttleCMV-NGF-NTN先后用PmeI线形化和CIAP进行5’去磷酸化，产物最后经纯化后和腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183。涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段，结果见图3。

筛选出的重组质粒经过鉴定后转化XL-10(Gold),大量扩增后提取质粒，使质粒浓度达到0.1μg/μL。将质粒进行线性化后转染AD-293细胞，使重组腺病毒质粒能够在HEK-293细胞中包装重组腺病毒。8天后开始观察细胞病变。细胞在整个视野下，局部出现细胞变圆、肿胀和聚集形成串珠状，且在之后的2-3天内，病变速度加快，细胞病变从局部迅速向整体扩散，最终多数的细胞已经脱落形成串珠状，漂浮于上清液中，见图4。

3、感染Ad-Lmx1a和Ad-NGF/NTN的rASCs向DA能神经元分化及鉴定

（1）重组腺病毒外源插入基因Lmx1a和 NTN在rASCs中表达、分泌及活性检测

将两株重组腺病毒Ad-NGF/NTN和Ad-Lmx1a分别感染rASCs，并且用Ad-Control感染rASCs作为对照，48小时后通过western Blot和免疫荧光检测。RIPA分别裂解感染Ad-NTN和Ad-Lmx1a的rASCs，收集裂解上清，通过WB检测到大小约为12KD 的NTN蛋白条带和大小约为36KD的Lmx1a蛋白条带（图7A,B）。免疫荧光结果提示，所构建重组腺病毒在感染rASCs后能够表达分别插入的NTN和Lmx1a。Lmx1a定位于rASCs的胞核（图7F），NTN定位于rASCs的胞质中（图7H），对照细胞中不能检测到相应蛋白的表达（图7E,G）。通过鸡胚背根神经节培养实验检测，在培养48小时后，加入NTN条件上清的神经节周围长出了大量的神经突起和细长神经纤维，形态呈散发状（图7D）。而将感染了Ad-Control的无血清培养基以相同的条件培养鸡胚背根神经节，培养相同时间后，和作用孔同时观察，未出现明显的神经纤维长出（图7C）。

（2）rASCs向DA能神经元诱导方案的确定及形态观察

大鼠胚胎移植培养实验证明SHH 和成纤维细胞生长因子8 ( FGF8)共同作用是DA能神经元生成的充分必要条件，SHH和FGF-8能够启动SHH/Lmx1a/Msx1信号通路。因此，在诱导方案实验后，我们确立了通过SHH/Lmx1a信号通路调控，NTN营养保护的将rASCs向DA能神经元诱导分化的诱导策略，具体诱导方案如下：

（a）诱导前一天，取rASCs第二代细胞接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM。

（b）当细胞汇合率达95%时，以最佳MOI加入Ad-Lmx1a感染rASCs，感染后换液为诱导液I进行预诱导，诱导3天后换液为L-DMEM（含2%FBS），再以最佳MOI加入Ad-NGF/NTN感染rASCs。

（c）24h并确认rASCs都表达Lmx1a和NTN蛋白后后，换液为诱导液II，每隔3天半量换液，如图8，诱导液组分如下，浓度均为工作浓度。

在该诱导方案下，感染最佳MOI的Ad-Lmx1a后rASCs生长状态良好，将溶液更换为诱导液I后，细胞贴壁率维持在85%，部分细胞细胞开始出现突触。感染Ad-NGF/NTN后细胞状态出现少数细胞漂起， 3天后将诱导液换液为Neural Basal正式诱导液II（含2%B27，1.7 μM SHH, 100 ng/mLFGF-8,30 ng/mLbFGF, and 1% N2 supplement，20 μM β-NADP）则发出细长的突触，相互连接最后交联形成网络状，且神经元形态的细胞数量大量增多，结果见图9。

（3）多巴胺能神经元特异性相关基因Real Time PCR鉴定

以实时定量PCR检测多巴胺能神经元特异性基因的引物，通过Real-time PCR检测多巴胺能神经元特异性基因Nurr1，β-tubulin III，Nefm，nestin，MAP-2， NSE和TH。以上引物为本领域公知不做赘述。

Real Time PCR结果如图10表明，以β-actin为内参，在RNA转录水平上，诱导细胞和对照细胞相比，多巴胺能神经元特异性基因β-tubulin III，Nefm，nestin，MAP-2与TH 在转录水平有明显差异，Nurr1与NSE差异不明显。说明rASCs在转录水平上向多巴胺能神经元进行调控和分化。

（4）诱导后细胞中多巴胺能神经元特异性蛋白的检测

我们将重组腺病毒Ad-Lmx1a和Ad-NGF/NTN先后同时感染rASC，诱导7天后进行免疫荧光，分别用不同来源的抗体特异地标记Lmx1a和NTN。在进行荧光标记的时候，我们用红色荧光基团Cy3标记Lmx1a，再用绿色荧光基团Dylight488标记NTN。在激光共聚焦显微镜下观察发现：感染诱导后可以观察到Lmx1a（红）和NTN（绿色）的表达，标记Lmx1a的红色荧光主要分布在细胞核，而标记NTN的绿色荧光均匀地分布在整个细胞的胞质中。通过本实验确认：先后同时感染Ad-Lmx1a和Ad-NTN在诱导后7天时可以检测到两种蛋白的表达，并且同一细胞可同时检测到两种蛋白的表达，且表达部位不同，两种重组腺病毒确实可同时感染一个细胞。与对照细胞相比，在诱导后21天时，诱导组细胞特异性表达β-tubulin III、Nefm、nestin、MAP-2、NSE和TH蛋白，但TH表达效率较低，随着诱导时间的增加，各神经元特异性蛋白表达量逐渐增加，结果如图11、12所示。

传导电信号或分泌神经递质是判定诱导分化后的神经元样细胞具有活性的标准，也是证明诱导细胞为神经元细胞最强有力的证据。本发明利用多巴胺检测试剂盒，测定诱导后的rASCs是否会释放神经递质多巴胺。具体方法为诱导21天时，去除诱导培养液，每孔加入1ml HBSS，在孔内维持24h，次日收集HBSS上清用作Dopamine检测，操作方法参见Dopamine ELISA Kit (IBL International GmbH) 操作说明。结果显示，在以上诱导方案下，诱导后的Lmx1a和NTN转导的rASCs比未转导Lmx1a和NTN的rASCs多分泌2.5倍的多巴胺，约为200pg/10⁵ 细胞，而Ad-LacZ感染后的未诱导的rASCs中不能检测到多巴胺的释放，结果见图13。

4、恒河猴脂肪间充质干细胞的培养和多向分化潜能鉴定

氯胺酮麻醉恒河猴, 无菌条件下取约6kg成年恒河猴大网膜脂肪组织1~2g，PBS洗涤三次去除残存的血迹，分离可见的血管和纤维成分,0.1%I型胶原酶, 37℃消化1h。消化完成后, 加入与I型胶原酶等体积的含10%新生小牛犊血清的L-DMEM培养液终止消化, 过滤, 1500 r/min离心3 min, 弃上清, 吸取底部沉淀用于rASCs培养。以1×10⁶接种于T-25培养瓶中，37℃，5%CO2条件下细胞培养中培养、至4天单层贴壁细胞贴壁率接近90%时，0.25%胰蛋白酶消化，1:2传代。以后随细胞扩增至90%时，按1:2持续体外传代培养。培养的脂肪干细胞大部分于24 h内即贴壁，在倒置显微镜下观察，贴壁细胞呈梭形，胞浆丰富、核大、核仁明显，可见细胞呈克隆样生长。传代后，于倒置显微镜下可见成纤维样细胞形态，细胞呈平行排列生长或旋涡状生长，在形态上与骨髓来源的MSCs类似。通过BrdU检测，rASCs增殖指数为45%（图5）。

通过流式细胞仪(BD)检测rASCs 的CD105，CD29，CD49d，CD45，CD34，HLA-DR的表达情况，rASCs强表达CD-29，表达率约为97.6%。弱表达CD-49d和CD-34，不表达CD-45和HLA-DR。免疫荧光结果与流式结果基本一致，结果见图6A。为了对rASCs的多能性进一步鉴定，我们将rASCs向成脂细胞和成骨细胞两种细胞诱导分化。成脂诱导至16天时，细胞内出现大量脂滴，呈戒环样分散于胞质中，而对照细胞在16天时未出现脂滴，仅为苏木素染色阳性（图6B）。在成骨诱导10天后，细胞开始聚集生长，14天时分别聚集成团生长，在诱导21天后对细胞进行茜素红染色和ALP染色鉴定为阳性，对照细胞没有明显染色（图6B）。

  〈110〉中国医学科学院医学生物学研究所

  〈120〉SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法

  〈160〉4

  〈170〉Patent Version 1

 

  〈210〉1

  〈211〉31

  〈212〉DNA

  〈213〉人工序列

  〈220〉

  〈221〉misc-feature

  〈222〉（1）…（31）

  〈223〉克隆Lmx1a基因上游引物序列

 

  〈400〉1

       GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG

  〈210〉2

  〈211〉31

  〈212〉DNA

  〈213〉人工序列

  〈220〉

  〈221〉misc-feature

  〈222〉（1）…（31）

  〈223〉克隆Lmx1a基因的下游引物序列

 

  〈400〉2

       CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG

 

 

  〈210〉3

  〈211〉31

  〈212〉DNA

  〈213〉人工序列

  〈220〉

  〈221〉misc-feature

  〈222〉（1）…（31）

〈223〉嵌合NTN成熟肽与NGF信号肽和pro肽的上游引物序列

 

〈400〉3

GGAAGCTTACCATGTCCATGTTGTTCTACAC

 

         

  〈210〉4

  〈211〉31

  〈212〉DNA

  〈213〉人工序列

  〈220〉

  〈221〉misc-feature

  〈222〉（1）…（31）

〈223〉嵌合NTN成熟肽与NGF信号肽和pro肽的下游引物序列

 

〈400〉4 

TTGATATCTTACACGCAGGCGCACTC

 

Claims (1)

1.SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法，包括：

 （1）Lmx1a基因克隆和嵌合NGF/NTN基因克隆及重组质粒的构建；

 以Lmx1a whole transcript cDNA为模板，引物为：

P1 up：5-‘GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3’，

P1 down：5’-CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3’，

通过PCR扩增获得带SalI和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle-CMV中，通过Sal I和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a；

人工合成含NGF信号肽和pro肽的基因，通过PCR搭桥将NTN的成熟肽基因与NGF信号肽基因和pro肽基因连接获得嵌合基因NGF/NTN，引物为：

Ｐ2 up：５′ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣ３′，

P2 down：５′ＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣ３′

回收纯化NGF/NTN的PCR产物，同时对纯化产物NGF/NTN和穿梭质粒pShuttleCMV进行双酶切，将NGF/NTN克隆至穿梭质粒pShuttleCMV启动子的下游，得重组穿梭质粒pShuttleCMV-NGF-NTN，将其转化至DH5α感受态，筛选阳性克隆；

其特征是： 

（2）重组腺病毒的构建与包装：

将步骤（1）重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a和pShuttleCMV-NGF-NTN先后用PmeI线形化和CIAP进行5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒，筛选阳性克隆；筛选出的pAdEasy-1重组质粒经过鉴定后转化XL-10-Gold,扩增、提取质粒，使质粒浓度达到0.1μg/μL，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒Ad-NGF/NTN和Ad-Lmx1a，诱导10天，细胞病变，脱落形成串珠状，漂浮于上清液中；

（3）rASCs向DA能神经元诱导

（a）诱导前一天，取rASCs第二代细胞，接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM；

（b）当细胞汇合率达95%时，将培养基换液为含2%FBS的L-DMEM，以最佳MOI加入Ad-Lmx1a感染rASCs，感染后换液为诱导液I进行预诱导；诱导液I成分为含6mM的β-巯基乙醇、20μM的NADP、10%FBS的L-DMEM；诱导3天后换液为L-DMEM，含2%FBS，再以最佳MOI加入Ad-NGF/NTN感染rASCs；

（c）24h后，即确认rASCs都表达Lmx1a和NTN蛋白后，换液为诱导液II；诱导液II成分为含20μM的NADP、1.7μM的SHH、20ng/ml的bFGF、100ng/ml的FGF-8、1%的N2 supplement、2%的B27、2%FBS的Neural Basal medium；每三天用新鲜诱导液换液一半，直至21天，细胞发出细长的突触，相互连接最后交联形成网络状，神经元形态的细胞数量大量增多。