CN113388580B - 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途 - Google Patents

一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113388580B
CN113388580B CN202110665982.6A CN202110665982A CN113388580B CN 113388580 B CN113388580 B CN 113388580B CN 202110665982 A CN202110665982 A CN 202110665982A CN 113388580 B CN113388580 B CN 113388580B
Authority
CN
China
Prior art keywords
differentiation
stage
induction
fbs
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110665982.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113388580A (zh
Inventor
秦川
白琳
李珂雅
吕颖
黄艺滢
石桂英
雷雪裴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Original Assignee
Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Laboratory Animal Science of CAMS filed Critical Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Priority to CN202110665982.6A priority Critical patent/CN113388580B/zh
Publication of CN113388580A publication Critical patent/CN113388580A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113388580B publication Critical patent/CN113388580B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途，本发明首次将脂肪干细胞诱导分化为能分泌多巴胺、产生动作电位的功能性多巴胺能神经元，本发明所述的方法可成功将脂肪干细胞诱导分化为多巴胺能神经元后进行颅内注射，直接替代丢失的多巴胺能神经元以治疗帕金森疾病，有效避免干细胞移植入机体后的成瘤性和过度生长，安全性较高。

Description

一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及 用途
技术领域
本发明属于干细胞及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及其在帕金森疾病治疗中的用途。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又称震颤麻痹，是一种神经退行性疾病，也是常见的神经系统病变之一，以运动症状如静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态障碍和非运动症状包括抑郁、焦虑和认知障碍等为临床特征。PD的病程在10年以上，患病率随着年龄的增长而逐渐增加，患者多死于继发性感染或跌倒损伤，是中枢神经系统最具致残性的疾病之一。PD发生的一个关键因素是黑质致密部(Substantia nigra pars compacta，SNc)多巴胺能神经元变性坏死，导致多巴胺(Dopamine，DA)的分泌减少。
目前，PD的治疗主要以缓解症状为主，没有根治的方法，而干细胞移植治疗由于其极有可能改变疾病的进程，而成为目前公认的治疗PD最有前景的一种治疗手段，当前已经进入PD研究领域的前沿。干细胞移植治疗PD旨在通过移植具备多向分化潜能和自我更新能力的干细胞替代已变性坏死的神经元分泌DA，从而重建PD患者体内的多巴胺能神经元的功能，以改善患者的临床症状。PD的发病机制较为清楚，解剖定位明确，分化为特定的细胞类型，可以有效避免干细胞移植入机体后的成瘤性和过度生长。
干细胞移植治疗中常用的干细胞来源包括间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)、胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESCs)、脂肪干细胞(Adipose-derivedstem cells，ADSCs)等，其中，脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，因其在体内的储量丰富，获取方便，不存在伦理道德问题，具有稳定的多向分化和免疫抑制潜能，具有较低的免疫原性，且安全性更高，使得ADSCs可用于异体干细胞移植治疗中。
目前，ADSCs朝向神经方向诱导分化的方法主要有以下四种：神经诱导培养基培养法、细胞共培养法、基因转染法和电刺激法，关于这四种方法的研究进展如下：
(1)神经诱导培养基培养法
是采用直接诱导分化或分步诱导分化法，即ADSCs先转分化为神经干细胞(Neuralstem cells，NSCs)，再朝向神经细胞分化。在培养基中添加生长因子运用得较为广泛，也有添加激素类蛋白、小分子化合物等。最近，Marei团队将人脂肪组织来源的间充质干细胞培养至第3代时采用维甲酸(Retinoic acid，RA)进行诱导分化，到第6天时，细胞形态开始朝向神经方向变化(Maden,M.Retinoic acid in the development,regeneration andmaintenance of the nervous system[J].Nat Rev Neurosci,2007,8(10):755-765.)。
(2)细胞共培养法
是通过共培养促进ADSCs向神经方向分化，Razavi等研究者首先将人ADSCs诱导成神经营养因子分泌细胞，再将其制成细胞微胶囊与人ADSCs诱导成的神经球以1：1的比例共培养，最终诱导成的细胞朝向神经元分化(Razavi S,Razavi MR,Kheirollahi-KouhestaniM,et al.Co-culture with neurotrophic factor secreting cells induced fromadipose-derived stem cells:promotes neurogenic differentiation[J].BiochemBiophys Res Commun,2013,440,381-387.)。Bahmani团队将小鼠ES细胞与小鼠ADSCs进行非接触共培养48h后，再进行神经诱导2周，神经特定标记物的表达量多于未共培养ADSCs，诱导得到的小鼠ADSCs表达多种多能性标记物PCNA基因、SOX2基因、OCT4基因(Bahmani L,Taha MF,Javeri A.Coculture with embryonic stem cells improves neuraldifferentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].Neuroscience,2014,272:229-239.)。
(3)基因转染方法
除了在神经培养基中添加各类细胞因子、激素、小分子化合物，或是ADSCs与有分泌功能的细胞共培养促进其向神经方向分化外，相关科研人员还采用基因转染技术，将BDNF和神经营养因子-3(Neurotrophin-3)经由慢病毒转入SD大鼠的ADSCs中，再经由神经培养基诱导，其表达的NSE基因量有所增加(Ji W,Zhang X,Ji L,et al.Effects of brainderived neurotrophic factor and neurotrophin 3on the neuronal differentiationof rat adipose derived stem cells[J].Mol Med Rep,2015,12(4):4981-4988.)。
(4)电刺激方法
Yang等研究者则将不同强度电刺激作用于SD大鼠的ADSCs，最终筛选出最适宜脂肪干细胞神经分化的电刺激强度(1V/cm)，在此电刺激强度下，脂肪干细胞增殖活力增强，且能促进脂肪干细胞向神经方向的分化。而后结合基因转染技术，将Nurr-1基因转入ADSCs，发现电刺激联合Nurr-1基因转染作用于脂肪干细胞后能进一步提高其向神经方向分化的能力(Yang Y,Ma T,Ge J,et al.Facilitated Neural Differentiation ofAdipose Tissue-Derived Stem Cells by Electrical Stimulation and Nurr-1 GeneTransduction[J].Cell Transplantation,2016,25(6):1177-1191.)。
然而尽管ADSCs朝向神经方向的诱导方式各样，方法众多，但大多实验只是处于体外诱导阶段，且诱导后的细胞只是记录了形态变化和一些选择性的神经元特异性或神经胶质细胞特异性标记物的表达，缺乏真正细胞功能的检测，如膜电位和/或特定细胞群体(如多巴胺能神经元)的分泌功能，也缺乏一些体内实验数据的支持。探索一种更为有效的诱导方法，制备出具有功能的神经元或者神经胶质细胞，无论是从补给丢失的神经元或神经胶质细胞，从根本上治疗神经退行性疾病，还是避免干细胞移植入机体后的成瘤性和过度生长均具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明为了解决现有技术存在的上述问题，提供了一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途，所述诱导方法诱导时间短，诱导得到的功能性多巴胺能神经元可有效治疗帕金森疾病，且能有效避免干细胞移植入机体后的成瘤性和过度生长，安全性较高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)提供人脂肪干细胞并在完全培养基中进行培养；
(2)第一阶段诱导分化，用添加刺猬因子、细胞生长因子、BMP抑制剂、ALK5抑制剂和GSK-3抑制剂的DMEM培养基培养步骤(1)得到的细胞；
(3)第二阶段诱导分化，第7天，用添加神经营养因子、抗氧化剂和PKA激活剂的DMEM培养基培养步骤(2)得到的细胞，诱导分化得到功能性多巴胺能神经元。
进一步，步骤(1)中所述的脂肪干细胞可采用本领域已知的任意一种常规方法来获得，在本发明的实施例中，所述脂肪干细胞来源于临床吸脂的女性患者的脂肪组织，将所述脂肪干细胞以每孔2×105细胞的密度接种于6孔板上，在完全培养基中培养24h后，再依次进行步骤(2)和步骤(3)所述的第一阶段诱导分化和第二阶段诱导分化过程。
进一步，可采用本领域已知的适用于干细胞培养的任意一种常规培养基来培养获得脂肪干细胞，在本发明的实施例中，所述完全培养基为高糖型DMEM完全培养基。
进一步，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化共3-6天，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化共3-18天；
优选地，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化共6天，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化共6天。
进一步，步骤(2)中所述的刺猬因子为SHH，细胞生长因子为FGF8b、bFGF，BMP抑制剂为LDN193189，ALK5抑制剂为SB431542，GSK-3抑制剂为CHIR99021；
优选地，步骤(2)中所述的DMEM培养基还添加有FBS、B27；
更优选地，所述添加的各成分的浓度分别为：(1-20)％FBS、(1-50)×B27、(50-150)ng/mL FGF8b、(200-300)ng/mL SHH、(25-75)ng/mL bFGF、(150-250)nM LDN193189、(450-550)nM SB431542和(1-5)mM CHIR99021；
最优选地，所述添加的各成分的浓度分别为：1％FBS、1×B27、100ng/mL FGF8b、250ng/mL SHH、50ng/mL bFGF、200nM LDN193189、500nM SB431542和3mM CHIR99021。
进一步，步骤(3)中所述的神经营养因子为GDNF、BDNF，抗氧化剂为抗坏血酸，PKA激活剂为dbcAMP；
优选地，步骤(3)中所述的DMEM培养基还添加有FBS、B27；
更优选地，所述添加的各成分的浓度分别为：(1-20)％FBS、(1-50)×B27、(5-15)ng/mL GDNF、(25-75)μM抗坏血酸、(15-25)ng/mL BDNF和(450-550)μM dbcAMP；
最优选地，所述添加的各成分的浓度分别为：1％FBS、1×B27、10ng/mL GDNF、50μM抗坏血酸、20ng/mL BDNF和500μM dbcAMP。
进一步，步骤(2)和步骤(3)中所述的培养基每1-3天换液一次；
优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述的培养基每3天换液一次。
本文中所述的“多巴胺能神经元(Dopaminergic neuron，DA神经元)”，是一类含有并释放多巴胺作为神经递质的神经元，在哺乳动物各脑区的含量不同，其中，尾核、壳核内含量最高，其次是黑质和苍白球，在中枢神经系统内，其胞体主要位于中脑，由此发出的神经纤维有三条通路：(1)黑质纹状体系统，起于中脑黑质，止于纹状体，主要是尾核和壳核及中央杏仁核；(2)中脑边缘系统，起于中脑脚间核背侧，轴索上行达伏隔核和嗅结节；(3)结节漏斗系统，起于丘脑下部，发出短轴索下行，终止于正中隆起，所涉及的生理功能较为广泛且重要，多巴胺能神经元的损伤与帕金森疾病的发病密切相关。
本文中所述的“脂肪干细胞(ADSCs)”，是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，它是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞，可以分化为成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且来源广泛，体外储备量大，适宜自体移植。
本发明的第二方面提供了一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的诱导分化剂。
进一步，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂和第二阶段诱导分化剂；
优选地，所述第一阶段诱导分化剂的组成为：刺猬因子、细胞生长因子、BMP抑制剂、ALK5抑制剂、GSK-3抑制剂；
更优选地，所述的刺猬因子为SHH，细胞生长因子为FGF8b、bFGF，BMP抑制剂为LDN193189，ALK5抑制剂为SB431542，GSK-3抑制剂为CHIR99021；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂还包含FBS、B27；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂各组分的浓度为：(1-20)％FBS、(1-50)×B27、(50-150)ng/mL FGF8b、(200-300)ng/mL SHH、(25-75)ng/mL bFGF、(150-250)nMLDN193189、(450-550)nM SB431542和(1-5)mM CHIR99021；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂各组分的浓度为：1％FBS、1×B27、100ng/mLFGF8b、250ng/mL SHH、50ng/mL bFGF、200nM LDN193189、500nM SB431542和3mMCHIR99021；
优选地，所述第二阶段诱导分化剂的组成为：神经营养因子、抗氧化剂、PKA激活剂；
更优选地，所述的神经营养因子为GDNF、BDNF，抗氧化剂为抗坏血酸，PKA激活剂为dbcAMP；
最优选地，所述第二阶段诱导分化剂还包含FBS、B27；
最优选地，所述第二阶段诱导分化剂各组分的浓度为：(1-20)％FBS、(1-50)×B27、(5-15)ng/mL GDNF、(25-75)μM抗坏血酸、(15-25)ng/mL BDNF和(450-550)μM dbcAMP；
最优选地，所述第二阶段诱导分化剂各组分的浓度为：1％FBS、1×B27、10ng/mLGDNF、50μM抗坏血酸、20ng/mL BDNF和500μM dbcAMP。
进一步，在本发明中，所述的成分和/或组分的浓度均为终浓度。
本发明的第三方面提供了一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的诱导分化培养基。
进一步，所述诱导分化培养基包括基础培养基和添加剂；
优选地，所述基础培养基为DMEM培养基；
更优选地，所述添加剂为本发明第二方面所述的诱导分化剂。
本发明的第四方面提供了一种脂肪干细胞来源的功能性多巴胺能神经元细胞群体。
进一步，所述细胞群体为采用本发明第一方面所述的方法诱导分化得到的；
优选地，所述细胞群体表达神经干细胞标记物NESTIN、神经元特异核蛋白NeuN、中脑标记物LMX1A、多巴胺能神经元标记物TH、特异表达于中脑的转录因子PITX3，并能分泌多巴胺、产生动作电位。
本发明的第五方面提供了一种用于预防和/或治疗帕金森疾病的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第四方面所述的细胞群体；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述药物组合物中本发明第四方面所述的细胞群体的数量为2×105-1×107个。
进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
进一步，所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。
进一步，所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
进一步，所述药物组合物中的活性成分(本发明第四方面所述的细胞群体)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。
本文中所述的“预防和/或治疗”，是指预防、逆转、缓和、抑制该术语所适用的失调或病症或者这种失调或病症的一种或多种症状的进展，治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即便基础病理生理学不受影响，如通过施用药剂治疗受试者的神经系统病状如多发性硬化和与氧化应激相关的其他疾病如肾脏疾病，尽管这种药剂不治疗该病状的病因，例如，本文中所使用“预防和/或治疗帕金森疾病”包括以下一种或多种：
(1)预防帕金森疾病的发生；
(2)抑制帕金森疾病的发展；
(3)治愈帕金森疾病；
(4)缓解帕金森疾病患者的相关症状；
(5)减轻帕金森疾病的严重程度；
(6)防止帕金森疾病的复发。
本发明的第六方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第二方面所述的诱导分化剂在制备诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的诱导分化培养基中的应用；
(2)本发明第二方面所述的诱导分化剂在诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元中的应用；
(3)本发明第三方面所述的诱导分化培养基在诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元中的应用；
(4)本发明第四方面所述的细胞群体在制备预防和/或治疗帕金森疾病的药物中的应用；
(5)本发明第五方面所述的药物组合物在预防和/或治疗帕金森疾病中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明首次采用本发明提供的诱导分化方法将脂肪干细胞(ADSCs)诱导为具有功能性的多巴胺能神经元，所述诱导分化的得到的功能性多巴胺能神经元能够分泌多巴胺、产生动作电位；
(2)本发明提供的诱导脂肪干细胞(ADSCs)分化为功能性多巴胺能神经元的方法具有诱导时间短、诱导效率高等优点，仅需12天即可诱导产生多巴胺能神经元；
(3)采用本发明提供的诱导分化方法诱导产生的多巴胺能神经元可进行颅内注射，直接替代丢失的多巴胺能神经元以治疗帕金森疾病，在本发明中，分别采用了帕金森疾病大鼠模型和食蟹猴动物模型进行了验证，结果均表明采用本发明提供的诱导分化方法诱导产生的多巴胺能神经元具有有效治疗帕金森疾病的效果；
(4)经安全性评价实验证明了采用本发明提供的诱导分化方法诱导产生的多巴胺能神经元具有安全性，在帕金森疾病的治疗中具有较好的临床应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是三种不同的方法(N1、N2、N3)进行细胞诱导实验的流程图；
图2是三种不同的诱导方法(N1、N2、N3)诱导得到的细胞形态变化的结果图；
图3是本发明所述的诱导方法在分别诱导6d和12d时得到的细胞神经元标记物的表达结果图，其中，A图：6d，NESTIN，B图：6d，NEUN，C图：12d，LMX1A，D图：12d，TH；
图4是本发明所述的诱导方法在分别诱导不同天数后得到的细胞神经相关基因的相对表达量的结果图，其中，A图：NESTIN，B图：NURR1，C图：EN1，D图：TH，E图：PITX3；
图5是本发明所述的诱导方法诱导得到的细胞的分泌功能及细胞膜电位测定的结果图，其中，A图：ELISA的标准曲线，B图：通过ELISA测定的诱导0d、6d、12d、24d细胞的多巴胺分泌量，C图：通过HPLC测定诱导12d细胞多巴胺、二羟基苯乙酸、5-羟色胺、去甲肾上腺素的分泌量，D图：诱导6d和12d细胞静息膜电位，E图：诱导12d细胞钠离子内流；
图6是采用动物模型对本发明所述的诱导方法诱导得到的功能性多巴胺能神经元的治疗效果进行验证的实验流程图；
图7是本发明所述的诱导方法诱导得到的功能性多巴胺能神经元对帕金森病大鼠模型治疗效果的结果图，其中，A图：0.9％NaCl，B图：ADSC d0，C图：ADSC d6，D图：ADSC d12，E图：ADSC d24，F图：ADSC d24、iPSC d18、iPSC d25；
图8是ADSC d12对帕金森病大鼠模型治疗效果的结果图，其中，A图：大鼠抓力，B图：大鼠抓力，C图：总活动路程，D图：总运动时间，E图：跨区域次数；
图9是本发明所述的诱导方法诱导得到的功能性多巴胺能神经元对帕金森病食蟹猴模型治疗效果的结果图，其中，A图：PD评分结果，B图：PD评分结果，C图：总运动距离折线图，D图：运动距离折线图，E图：总运动距离柱状图，F图：血小板水平，其中，A图和B图中的数字代表食蟹猴编号，标红的是移植的诱导12d的ADSC细胞；
图10是本发明所述的诱导方法诱导得到的功能性多巴胺能神经元安全性评价的结构图，其中，A图：皮下注射A549和ADSC d12细胞，注射A549细胞的NSG小鼠皮下成瘤，B图：皮下注射A549、ADSC d12细胞观察不同天数肿瘤体积变化，C图：A549皮下瘤体HE染色，核分裂象明显，D图：皮下注射A549、ADSC d12细胞的NSG小鼠剖离后肿瘤重量差别，E图：静脉注射ADSC d12细胞后各脏器的情况，F图：小鼠体重变化；
图11是对细胞移植后的大鼠和食蟹猴进行病理学分析的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的不同方法的比较1、实验对象
人脂肪组织取自女性临床吸脂患者，平均年龄35岁，均于术前签署知情同意书；食蟹猴脂肪组织来源于3-5周岁的雄性食蟹猴；食蟹猴购自于北京协尔鑫生物资源研究所有限责任公司，饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所北方资源中心普通环境；实验方案通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物管理和使用委员会(IACUC)的审批，IACUC号为:BL18004；实验动物饲养繁育和实验过程中在不影响实验要求和实验结果的基础上严格按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。
2、实验材料
高糖型DMEM完全培养基、胎牛血清(FBS)、血清替代物(KSR)、B27购自于Gibco(美国)；Neurobasal培养基、Purmorphamine、EGF购自于Stemcell(加拿大)；MEM非必需氨基酸购自于Life technologies(美国)；丙酮酸钠、β-巯基乙醇、抗坏血酸(AA)、维A酸(RA)购自于Sigma(美国)；LDN193189、SB431542、CHIR99021购自于Stemgent(美国)；FGF-8b购自于北京义翘神州科技有限公司；Y-27632购自于Selleck(美国)；GDNF、BDNF、dbcAMP、bFGF购自于PeproTech(美国)；SHH购自于Miltenyi(德国)。
3、采用三种不同的方法(N1、N2、N3)进行细胞诱导实验
将ADSCs以每孔2×105细胞的密度接种于6孔板上，培养24h后，完全培养基更换为分化培养基，第一种神经元分化培养基(N1)包含8％KSR的DMEM，添加有0.1mM MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、0.1mMβ-巯基乙醇、200nM LDN193189、500nM SB431542、2μMpurmorphamine、100ng/mL FGF8b、3μM CHIR99021、30μM Y-27632；第二种神经元分化培养基(N2)包含DMEM，其中添加1％FBS、1×B27、100ng/mL FGF8b、250ng/mL SHH、50ng/mLbFGF、200nM LDN193189、500nM SB431542和3mM CHIR99021；Neurobasal培养基添加1×B27、100ng/mL维A酸、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF为第三种神经元分化培养基(N3)，每3天进行一次培养基的更换，第7天时，将N1和N3培养基改为含有Neurobasal培养基，添加1×B27、10ng/mL GDNF、50μM抗坏血酸、20ng/mL BDNF和500μM dbcAMP的神经分化培养基；将N2培养基改为添加有1％FBS、1×B27、10ng/mL GDNF、50μM抗坏血酸、20ng/mL BDNF和500μMdbcAMP的DMEM，细胞在神经分化培养基中培养至第24天后进行后续实验。
4、实验结果
三种不同的方法(N1、N2、N3)进行细胞诱导实验的流程图见图1，实验结果显示，N2产生的细胞具有神经元样形态且细胞生长良好，诱导12天的形态最为接近神经元形态；对比发现细胞经N1诱导后虽然也能产生具有神经元样形态的细胞，但前期死亡细胞较多，不利于后续的扩增移植；而N3诱导后的细胞几乎没有形态学上的变化(见图2)，这些结果表明本发明所述的诱导方法(N2)具有较好的诱导效果。
实施例2本发明所述的诱导方法诱导得到的细胞神经标记物表达的检测
本实施例分别检测了采用本发明所述的诱导方法在诱导不同天数后得到的细胞表达神经干细胞标记物的情况。
1、实验方法
通过免疫荧光染色技术分别检测采用本发明所述的诱导方法在诱导6d和12d时得到的细胞表达神经干细胞标记物的情况，所述标记物包括神经干细胞标记物NESTIN、神经元特异核蛋白NeuN、中脑标记物LMX1A、多巴胺能神经元标记物TH，进一步检测了采用本发明所述的诱导方法在诱导0d、3d、6d、9d、12d、18d和24d时得到的细胞神经相关基因的相对表达量，所述神经相关基因包括NESTIN、NURR1、EN1、TH、PITX3。
2、实验结果
免疫荧光结果显示，细胞在诱导6d时表达神经干细胞标记物NESTIN和神经元特异核蛋白NeuN(见图3A-B)，随着诱导时间增加，在诱导12d时细胞表达中脑标记物LMX1A，最终细胞表达多巴胺能神经元标记物TH(见图3C和D)；神经相关基因的表达量也随着诱导时间增加而增加(见图4A-E)，其中PITX3是一个特异表达于中脑的转录因子，通过激活一系类的多巴胺能神经元内特异分子促进其发育成熟，它在诱导12d时表达最高(见图4E)，TH是多巴胺能神经元标记物，在诱导12d时表达最高(见图4D)，这些结果均表明了通过本发明所述的诱导方法诱导得到的细胞为多巴胺能神经元。
实施例3本发明所述的诱导方法诱导得到的细胞分泌功能及细胞膜电位的测定
本实施例分别对未诱导的细胞，诱导6d的细胞，诱导12d的细胞进行了功能测试。
1、实验方法
(1)酶联免疫吸附试验(ELISA)和高效液相色谱(HPLC)
在分化的第0、6、12、24天，用汉克平衡盐溶液(HBSS)中的56mM KCl代替培养基(ELISA为6孔板，每孔1mL；HPLC为25cm2培养瓶，每孔1.5mL)，在37℃下孵育15min，收集培养液，4℃条件下，15000rpm，离心30min以清除细胞碎片，样品立即在液氮中淬灭，保存于-80℃，ELISA按照DAELISA试剂盒说明书(Elabscience)进行操作。对于HPLC分析，使用真空与制冷蒸汽疏水阀(Savant RVT 4104；Thermo Fisher Scientific)相连(Savant SDP 121P；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)的设备将样品冻干并浓缩，将冷冻干燥后的样品在10mM高氯酸中重悬，采用双通道Coulochem III型电化学检测器(5300；ESAInc.，Chelmsford，MA)检测单胺类物质，缓冲液包括50mmol/L柠檬酸、50mmol/L乙酸钠、0.1mmol/L EDTA-2钠和0.5mmol/L辛烷磺酸钠，pH＝4.1。色谱条件包含流动相(缓冲液体积：甲醇体积＝87.2:12.8)，并使用反相C18色谱柱分离单胺，流速为0.800mL/min，通过将曲线下的面积与已知的标准稀释度进行比较，确定单胺类物质浓度。
(2)电生理记录
细胞在常规人工脑脊液(124mM NaCl、2.5mM KCl、1.3mM MgCl2、2.5mM CaCl2、1mMNaH2PO4、26.2mM NaHCO3、20mM葡萄糖、pH 7.4、95％O2和5％CO2，～310mOsm)中孵育，流速为2mL/min，将拉制好的玻璃电极尾端浸入电极内液中(135mM KMeSO4、5mM KCl、5mM HEPES、0.25mM EGTA游离酸、2mM Mg-ATP、0.5mM GTP，10mM磷酸肌酸-Tris，pH 7.3，～290mOsm)，将电极安装在电极夹持器上，然后利用微型操纵器使其缓慢下降，在快接近细胞时给少许正压。选择轮廓清晰，胞体较亮，折光性好的细胞，当电极接触到细胞表面时撤去正压，并施加适当负压，使电极尖端与细胞表面形成高阻封接。待封接稳定后再次给予负压使细胞破膜形成全细胞记录模式。撤去负压，将放大器设置到whole cell模式进行膜片钳电生理记录。若细胞的静息电位大于-50mV，则表明细胞状态良好，可继续记录。根据实验需求，使用事先编辑好的Protocol或采用Gap free模式进行记录。记录电流时，切换到电流钳模式，静息膜电位监测超过5min，动作电位持续监测5min，如无阈值变化，则开始灌注内液，所有试剂均购自Sigma-Aldrich。
2、实验结果
实验结果显示，诱导12d的细胞多巴胺分泌量最高，未诱导的ADSCs细胞韧性较大，无法成功Patch上，而随着诱导时间的增加，6d和12d细胞均能成功封接，测得的静息膜电位在12d时与多巴胺能神经元一致，且检测到了膜内外钠离子通道的变化(见图5A-E)，表明了在12d时脂肪干细胞成功诱导为了能够分泌多巴胺、产生动作电位的功能性多巴胺能神经元。
实施例4本发明所述的诱导方法诱导得到的功能性多巴胺能神经元治疗帕金森病动物模型的效果
本实施例分别采用了帕金森病大鼠模型、帕金森病食蟹猴模型对本发明所述的诱导方法诱导得到的功能性多巴胺能神经元的治疗效果进行了验证。
1、实验方法
(1)6-OHDA诱导构建帕金森病大鼠模型
采用5％异氟醚联合吸氧(1-1.5L/min)在诱导箱内快速诱导麻醉大鼠，然后将动物保持在具有1-2％异氟醚的麻醉条件下，将动物安置在带有加热垫的立体定向装置上，以使体温保持在37℃。无菌条件下，在大鼠颅骨顶叶区做一个1.5cm的矢状切口，根据Paxinosand Watson大鼠脑立体定位图谱，定位左侧内侧前脑束(MFB)注射坐标：①齿棒(TB)＝-2.3mm,前后(AP)＝-4.4mm,内外侧(ML)＝1.2mm,背腹(DV)＝-7.8mm,剂量＝2.5uL；②齿棒(TB)＝+3.4mm,前后(AP)＝-4.0mm,内外侧(ML)＝0.8mm,背腹(DV)＝-8.0mm,剂量＝2uL。生理盐水加入0.02％抗坏血酸(Sigma)溶解6-OHDA(Sigma)工作溶液，浓度为2.5μg/μL。钻开颅骨，用10μL微注射器(Hamilton、Sigma)以1μL/min的速度注入6-OHDA，以选择性损毁多巴胺能神经元，每次注射后留置针10min，以防止拔针时液体回流，然后以1.0mm/min的速度缓慢抽回，仔细止血、消毒，缝合皮肤，将动物放回饲养笼待麻醉苏醒后自由饮食。
(2)MPTP诱导构建帕金森病食蟹猴模型
在进行手术前，食蟹猴接受了3个月的训练。食蟹猴注射阿托品(0.05mg/kg)20min后行舒泰(4mg/kg)肌注麻醉，将MPTP-HCl(0.2mg/mL)每天(上午9:00)以0.2mg/kg缓慢注入下肢静脉，用Bennazzouz帕金森病临床行为评价量表评价动物模型，当评分达到8分或8分以上，停用MPTP，观察评价7d确定模型，造模后2月评分达到稳定。
(3)帕金森食蟹猴模型的行为学评价
主要采用PD Bennazzouz临床评价量表和视频追踪系统检测动物行为学变化进行模型评价。
将动物移至标准灵长类行为笼中适应环境至少20min，在基线与MPTP造模后直至8周观察动物在行为笼中的行为变化。结合Bennazzouz临床评分量表，对动物笼内表现出的临床症状进行双盲评分。其评价的指标包括如下7个帕金森病体征：震颤(0-3)；运动减慢(0-3)；姿势变化(0-3)；发声变化(0-2)；呆滞(0-2)；强直(每个上肢0-3)；上肢运动(摄食水果的能力，每个上肢0-3)，总分最小0分为正常行为。
ViewPoint灵长类动物运动轨迹跟踪系统可自动跟踪、监测和量化录像中动物的随意运动距离，以及精细描绘动物在笼内运动的路径轨迹。所有动物30min行为学录像均采用相同的测试参数，每次测试均执行一次。在测试运动行为之前需要描绘出动物检测区域，然后规定动物在此区域内作为跟踪中心点，同时通过控制制定程序“开始”和“停止”时间来自动采集随意运动量数据。
(4)细胞移植
将5μL培养基中的hADSC(2×105细胞)分别以2.5μL立体定向注入大鼠左侧纹状体(AP+0.2mm，ML 3.0mm，DV-5.0mm/DV-6.0mm)；对于食蟹猴的自体移植，根据图谱将160μL细胞悬液(2×106细胞/每位点/20μL)立体定向注射至双侧纹状体中，以1mL/min的速率输送细胞，注射完成后，留针10min，以防止回流。
2、实验结果
图6为实验验证的流程图，帕金森病大鼠模型的实验结果显示，人ADSCs采用本发明所述的诱导方法得到的细胞进行移植后能有效地减少帕金森病大鼠模型的旋转次数，且该效果能维持到32周(见图7A-F)，抓力改善，旷场实验中总活动路程、总运动时间、跨区域次数显著增加(见图8A-E)；
帕金森病食蟹猴模型的实验结果显示，食蟹猴帕金森病模型经细胞移植治疗后PD评分显著改善(见图9A和B)，食蟹猴单位时间运动距离增加、总运动距离增加，血生化血常规检测结果显示血小板水平恢复至造模前水平(见图9C-F)，疾病评分显著改善；
以上结果表明了ADSCs采用本发明所述的诱导方法得到的细胞进行移植后，对帕金森病大鼠和帕金森病食蟹猴均具有较好的治疗作用。
实施例5本发明所述的诱导方法产生的功能性多巴胺能神经元的安全性评价
本实施例采用了免疫缺陷的NSG小鼠进行了安全性的评价。
1、实验方法
本实施例共采用了30只NSG小鼠进行了为期2个月的安全性研究。其中，6只小鼠单侧背侧肩胛区注射hADSCs，6只小鼠左右侧背侧肩胛区分别注射A549和诱导12天的hADSCs(1×106个细胞/每只，皮下注射)，hADSCs、A549和诱导12天的hADSCs再分别通过尾静脉注射至15只小鼠(1×106个细胞/每只)，其余小鼠被分配到未治疗组，在静脉注射肿瘤生长模型中进行临床症状、体重和组织病理学检查，对于皮下移植肿瘤模型，每3天用游标卡尺测量肿瘤的短径和长径，并使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(V)＝(L×S2)/2，其中，L是肿瘤的长径，S是肿瘤的短径，当长径达到12mm时，将肿瘤组织分离、称重、固定并进行H&E染色。
2、实验结果
实验结果显示，将细胞接种到免疫缺陷的NSG小鼠体内，4周之后未形成肿瘤，小鼠各组织未见病理学改变(见图10A-F)，表明了本发明所述的诱导方法诱导得到的多巴胺能神经元短期无致瘤性；
长期成瘤性评价中，对细胞移植后32周的大鼠进行了病理学分析的结果显示，大鼠各组织无病理学改变，细胞移植后18个月，食蟹猴各组织无病理学改变(见图11)，表明了本发明所述的诱导方法诱导得到的多巴胺能神经元长期无致瘤性，后续的临床应用是安全可控的。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (20)

1.一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 提供人脂肪干细胞并在完全培养基中进行培养；
(2) 第一阶段诱导分化，用添加刺猬因子、细胞生长因子、BMP抑制剂、ALK5抑制剂和GSK-3抑制剂的DMEM培养基培养步骤(1)得到的细胞；
(3) 第二阶段诱导分化，第7天，用添加神经营养因子、抗氧化剂和PKA激活剂的DMEM培养基培养步骤(2)得到的细胞，诱导分化得到功能性多巴胺能神经元；
步骤(2)中所述的刺猬因子为SHH，细胞生长因子为FGF8b、bFGF，BMP抑制剂为LDN193189，ALK5抑制剂为SB431542，GSK-3抑制剂为CHIR99021；
步骤(2)中所述的DMEM培养基还添加有FBS、B27；
步骤(2)中所述的DMEM培养基中添加的各成分的浓度分别为：(1-20)% FBS、1×B27、(50-150) ng/mL FGF8b、(200-300) ng/mL SHH、(25-75) ng/mL bFGF、(150-250) nMLDN193189、(450-550) nM SB431542和(1-5) mM CHIR99021；
步骤(3)中所述的神经营养因子为GDNF、BDNF，抗氧化剂为抗坏血酸，PKA激活剂为dbcAMP；
步骤(3)中所述的DMEM培养基还添加有FBS、B27；
步骤(3)中所述的DMEM培养基中添加的各成分的浓度分别为：(1-20)% FBS、1×B27、(5-15) ng/mL GDNF、(25-75) μM抗坏血酸、(15-25) ng/mL BDNF和(450-550) μM dbcAMP。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的DMEM培养基中添加的各成分的浓度分别为：1% FBS、1×B27、100 ng/mL FGF8b、250 ng/mL SHH、50 ng/mL bFGF、200 nM LDN193189、500 nM SB431542和3 mM CHIR99021。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的DMEM培养基中添加的各成分的浓度分别为：1% FBS、1×B27、10 ng/mL GDNF、50 μM抗坏血酸、20 ng/mL BDNF和500μM dbcAMP。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化共3-6天，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化共3-18天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化共6天，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化共6天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述的培养基每1-3天换液一次。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述的培养基每3天换液一次。
8.一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的诱导分化剂，其特征在于，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂和第二阶段诱导分化剂；
所述第一阶段诱导分化剂的组成为：刺猬因子、细胞生长因子、BMP抑制剂、ALK5抑制剂、GSK-3抑制剂；
所述的刺猬因子为SHH，细胞生长因子为FGF8b、bFGF，BMP抑制剂为LDN193189，ALK5抑制剂为SB431542，GSK-3抑制剂为CHIR99021；
所述第一阶段诱导分化剂还包含FBS、B27；
所述第一阶段诱导分化剂各组分的浓度为：(1-20)% FBS、1×B27、(50-150) ng/mLFGF8b、(200-300) ng/mL SHH、(25-75) ng/mL bFGF、(150-250) nM LDN193189、(450-550)nM SB431542和(1-5) mM CHIR99021；
所述第二阶段诱导分化剂的组成为：神经营养因子、抗氧化剂、PKA激活剂；
所述的神经营养因子为GDNF、BDNF，抗氧化剂为抗坏血酸，PKA激活剂为dbcAMP；
所述第二阶段诱导分化剂还包含FBS、B27；
所述第二阶段诱导分化剂各组分的浓度为：(1-20)% FBS、1×B27、(5-15) ng/mLGDNF、(25-75) μM抗坏血酸、(15-25) ng/mL BDNF和(450-550) μM dbcAMP。
9.根据权利要求8所述的诱导分化剂，其特征在于，所述第一阶段诱导分化剂各组分的浓度为：1% FBS、1×B27、100 ng/mL FGF8b、250 ng/mL SHH、50 ng/mL bFGF、200 nMLDN193189、500 nM SB431542和3 mM CHIR99021。
10.根据权利要求8所述的诱导分化剂，其特征在于，所述第二阶段诱导分化剂各组分的浓度为：1% FBS、1×B27、10 ng/mL GDNF、50 μM抗坏血酸、20 ng/mL BDNF和500 μMdbcAMP。
11.一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基包括基础培养基和添加剂；
所述基础培养基为DMEM培养基；
所述添加剂为权利要求8-10任一项所述的诱导分化剂。
12.一种脂肪干细胞来源的功能性多巴胺能神经元细胞群体，其特征在于，所述细胞群体为采用权利要求1-7任一项所述的方法诱导分化得到的。
13.根据权利要求12所述的细胞群体，其特征在于，所述细胞群体表达神经干细胞标记物NESTIN、神经元特异核蛋白NeuN、中脑标记物LMX1A、多巴胺能神经元标记物TH、特异表达于中脑的转录因子PITX3，并能分泌多巴胺、产生动作电位。
14.一种用于预防和/或治疗帕金森疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求12或13所述的细胞群体。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
16.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中权利要求12或13所述的细胞群体的数量为2×105-1×107个。
17.权利要求8-10任一项所述的诱导分化剂在制备诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的诱导分化培养基中的应用。
18.权利要求8-10任一项所述的诱导分化剂在诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元中的应用。
19.权利要求11所述的诱导分化培养基在诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元中的应用。
20.权利要求12或13所述的细胞群体在制备预防和/或治疗帕金森疾病的药物中的应用。
CN202110665982.6A 2021-06-16 2021-06-16 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途 Active CN113388580B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110665982.6A CN113388580B (zh) 2021-06-16 2021-06-16 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110665982.6A CN113388580B (zh) 2021-06-16 2021-06-16 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113388580A CN113388580A (zh) 2021-09-14
CN113388580B true CN113388580B (zh) 2022-02-18

Family

ID=77621289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110665982.6A Active CN113388580B (zh) 2021-06-16 2021-06-16 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113388580B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115896024B (zh) * 2022-11-30 2023-06-13 苏州大学附属第二医院 一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003080801A2 (en) * 2002-03-19 2003-10-02 Advanced Research & Technology Transfer Adipose stromal stem cells for tissue and vascular modification
CN103031335A (zh) * 2011-10-09 2013-04-10 李川源 直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法及应用
WO2013067362A1 (en) * 2011-11-04 2013-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
CN103275935B (zh) * 2012-12-12 2015-09-23 中国医学科学院医学生物学研究所 SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法
KR102201417B1 (ko) * 2018-05-02 2021-01-11 (주) 에스바이오메딕스 도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물
CN111690605A (zh) * 2020-07-20 2020-09-22 青岛赛珥生物医学科技有限公司 一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113388580A (zh) 2021-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5871865B2 (ja) 神経前駆細胞又は神経幹細胞の神経細胞への分化及び増殖の誘導方法、分化及び増殖誘導用組成物、及び薬学的製剤
Choi et al. Transplantation of cultured bone marrow stromal cells to improve peripheral nerve regeneration
Liao et al. Exogenous neural stem cell transplantation for cerebral ischemia
Garbayo et al. Neuroprotective properties of marrow‐isolated adult multilineage‐inducible cells in rat hippocampus following global cerebral ischemia are enhanced when complexed to biomimetic microcarriers
Wang et al. The differentiation of rat adipose-derived stem cells into OEC-like cells on collagen scaffolds by co-culturing with OECs
Pan et al. Tissue engineering with peripheral blood-derived mesenchymal stem cells promotes the regeneration of injured peripheral nerves
ES2550456T3 (es) Uso de una composición que contiene células madre mesenquimatosas derivadas de sangre de cordón umbilical humano para inducir diferenciación y proliferación de células precursoras neurales o células madre neurales a células neurales
Wang et al. Long-term survival, axonal growth-promotion, and myelination of Schwann cells grafted into contused spinal cord in adult rats
Kuroda et al. Mesenchymal stem cells and umbilical cord as sources for schwann cell differentiation: their potential in peripheral nerve repair
US20110076256A1 (en) Human Neural Stem Cell and Pharmaceutical Composition for the Treatment of Central or Peripheral Nervous System Disorders or Injuries Using Same
CN105018429B (zh) 脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞及其制备方法和应用
Aleksandrova et al. Behavior of human neural progenitor cells transplanted to rat brain
KR20080026786A (ko) 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용세포치료제
CN113388580B (zh) 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途
CN116103231A (zh) 预调节间质干细胞及其制备与应用
KR20090055691A (ko) 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물
CN107429233B (zh) 神经系统细胞的制造方法
Hamidabadi et al. Promoting motor functions in a spinal cord injury model of rats using transplantation of differentiated human olfactory stem cells: A step towards future therapy
Yao et al. Tacrolimus-induced neurotrophic differentiation of adipose-derived stem cells as novel therapeutic method for peripheral nerve injury
JP2006006333A (ja) 神経分化誘導方法
Cho et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells efficiently induce behavioral recovery in a Parkinsonian rat model
Tang et al. Intranigral ventral mesencephalic grafts and nigrostriatal injections of glial cell line-derived neurotrophic factor restore dopamine release in the striatum of 6-hydroxydopamine-lesioned rats
Wang et al. Research progress of endogenous neural stem cells in spinal cord injury
Yu et al. Repair of peripheral nerve sensory impairments via the transplantation of bone marrow neural tissue-committed stem cell-derived sensory neurons
Barzilay et al. Adult stem cells for neuronal repair

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant