CN115896024B - 一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用 - Google Patents
一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用。所述诱导分化方法包括：采用诱导试剂对所述干细胞进行诱导分化，从而获得多巴胺能神经元；其中，所述诱导试剂包括生长因子及小分子化合物，所述小分子化合物包括SB431542、LDN193189、SAG、RA、cAMP、LAA中的任意两种以上的组合。本发明将多巴胺能神经元诱导方法中的部分生长因子替换为小分子化合物，大大降低了成本，并且小分子化合物较生长因子稳定性好，保证了培养条件的一致性以及分化效率的稳定；同时本发明提供的诱导分化方法具有成本低、周期短、分化效果好的优点。
Description
技术领域
本发明属于神经生物学技术领域，具体涉及一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用。
背景技术
神经元是不可再生细胞。利用体细胞重编程获得诱导多能干细胞(inducedpluripotent stemcells，iPSCs)，并诱导分化为目标靶细胞，是生命科学领域的前沿技术，有很好的科学研究与临床应用价值。将人源iPSCs诱导分化为神经元，使获得大量高纯度的人源性神经元变为可能。iPSCs技术在科学研究与临床应用方面均有重要意义。在科学研究方面，人源iPSCs诱导分化的多巴胺能(DA)神经元，克服了传统细胞系来源帕金森病(PD)模型的不足，更加真实地还原了PD患者脑内情况，使研究结果更加真实可靠。在临床应用方面，iPSCs及分化的细胞显示出对多种疾病具有临床疗效。iPSCs技术在疾病治疗中的运用，率先在PD患者、视网膜黄斑变性患者和扩张性心肌病患者中开展。目前利用iPSCs技术治疗PD已在日本展开临床研究，将iPSCs来源多巴胺能祖细胞(DAP)移植入PD患者脑内，并进入临床观察阶段。干细胞技术为难治性疾病带来了治疗的希望。而干细胞治疗的临床研究尚属初期，仍存在多种不足，比如iPSCs诱导分化DA神经元周期长、成本高、分化效率不稳定等，是目前急需克服的技术问题。
目前多巴胺能神经元的分化方法，涉及众多生长因子。由于生长因子价格昂贵、保存时间短，因此目前的分化方法费用较高，且对生长因子的储存、稳定性，与生长批次要求很高，其活性下降也是造成分化效率不稳定的原因之一；而市场上商品化的DA神经元诱导试剂盒(比如：Gibco公司、Stem cell公司)价格昂贵，且同样存在诱导周期长(2月)、分化效率不稳定等缺点，难以推广运用于临床。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种多巴胺能神经元的诱导分化方法，其包括：
采用诱导试剂对干细胞进行诱导分化，从而获得多巴胺能神经元；
其中，所述诱导试剂包括生长因子及小分子化合物，所述小分子化合物包括SB431542、LDN193189、SAG、RA、cAMP、LAA中的任意两种以上的组合；所述生长因子包括BDNF、FGF8b、GDNF、TGF-β3的任意一种或两种以上的组合。
在一些较为具体的实施方案中，采用包含诱导试剂的培养基对所述诱导多能干细胞进行诱导分化，其中所述培养基中还包括辅助试剂，所述辅助试剂包括laminin及Y-27632。
本发明实施例还提供了前述的多巴胺能神经元的诱导分化方法于制备治疗帕金森病的多巴胺能神经元的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明将现有多巴胺能神经元诱导方法中的部分生长因子替换为小分子化合物，大大降低了成本，并且小分子化合物较生长因子保质期长、稳定性好，保证了培养条件的一致性，以及分化效率的稳定；同时缩短了多巴胺能神经元的分化周期；
(2)本发明提供的诱导分化方法具有成本低，周期短、分化效果好的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A-图1C是本发明实施例1-3中DA神经元的分化效果图；
图2A-图2B是本发明对比例1与实施例2神经元中的分化效果图；
图3A-图3B是本发明对比例2与实施例2神经元中的分化效果图；
图4A-图4B是本发明对比例3与实施例2神经元中的分化效果图；
图5A-图5B是本发明对比例4与实施例2神经元中的分化效果图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，本发明将传统方法中部分生长因子替换为小分子化合物。小分子化合物价格较生长因子大大降低，且稳定性增高。以小分子化合物为主的诱导方法，将成本降低一半，且分化效率更稳定。申请人还对分化过程进行改进，使分化时间大大缩短。以E9细胞系为例，分化时间缩短为15-17天，且分化效率高。此为目前文献报道中最短的分化周期。下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种多巴胺能神经元的诱导分化方法包括：
采用诱导试剂对干细胞进行诱导分化，从而获得多巴胺能神经元(记为“DA神经元”)；
其中，所述诱导试剂包括生长因子及小分子化合物，所述小分子化合物包括SB431542、LDN193189、SAG、RA、cAMP、LAA中的任意两种以上的组合；所述生长因子包括BDNF、FGF8b、GDNF、TGF-β3的任意一种或两种以上的组合。
进一步地，所述RA用于神经干细胞的诱导，提高诱导效率与诱导速度。
在本发明中的诱导方案里，首次提出SMAD信号通路三重抑制的方法：在第一阶段(SMAD信号通路双重抑制)中加入第三种SMAD信号通路抑制剂RA，能够使NSCs的诱导更完全，且有利于后续神经元亚型的诱导分化。不同脑区(前部、后部、背腹部等)神经元亚型的分化，取决于FGF8，SHH，RA等形态发生因子加入的时间点和作用天数。本发明中使用小分子化合物SAG替代SHH。在双重SMAD信号通路抑制剂(SB431542和LDN193189)联合RA诱导NSCs后，撤掉SB431542，结束三重抑制剂的NSCs诱导进程，同时加入SAG，利用SAG联合RA的方案诱导中脑区域神经元亚型。在SAG联合RA作用5天后，撤掉RA并加入FGF8，利用SAG联合FGF8方案诱导多巴胺能神经元。在这一阶段，培养基中同时包含BDNF、L-AA等神经营养因子和辅助因子。作用3天后，利用BDNF、GDNF、TGF-β3、L-AA、cAMP联合作用，促进多巴胺能神经元的成熟。
在一些优选实施方案中，采用包含诱导试剂的培养基对所述诱导多能干细胞进行诱导分化，其中所述培养基中还包括辅助试剂，所述辅助试剂包括laminin及Y-27632。
进一步地，所述laminin及Y-27632在获得NSCs后全程加入能够抑制细胞凋亡、促进神经元贴壁。
在一些优选实施方案中，所述干细胞包括人类胚胎干细胞(hESCs)和/或诱导多能干细胞(iPSCs)。
例如，所述干细胞包括E9细胞系、健康人iPSCs细胞株(a-5-4-4)或者PD病人携带LRRK2 G2019S的iPSCs细胞株。
在一些优选实施方案中，所述多巴胺能神经元的诱导分化方法具体包括：
(1)采用包含RA、LDN193189、SB431542的培养基对所述干细胞进行诱导分化3-6天；
(2)采用包含LDN193189、RA、SAG、laminin、Y-27632的培养基对步骤(1)所获产物进行诱导分化4-5天；
(3)采用包含BDNF、LAA、SAG、FGF8b、laminin、Y-27632的培养基对步骤(2)所获产物进行诱导分化3-8天；
(4)采用包含BDNF、GDNF、TGF-β3、LAA、cAMP、laminin、Y-27632的培养基对步骤(3)所获产物进行诱导分化5-12天，从而获得所述多巴胺能神经元。
在一些优选实施方案中，所述多巴胺能神经元的诱导分化方法具体包括：
(1)采用包含SB431542、LDN193189、RA的第一培养基对所述诱导多能干细胞于37℃进行第一阶段诱导分化3-6天，获得第一阶段诱导分化产物；
(2)采用包含LDN193189、RA、SAG、Y-27632、laminin的第二培养基对所述第一阶段诱导分化产物于37℃进行第二阶段诱导分化2天，获得第二阶段诱导分化产物；
(3)采用包含LDN193189、RA、SAG、Y-27632、laminin的第三培养基对所述第二阶段诱导分化产物于37℃进行第三阶段诱导分化1-2天，获得第三阶段诱导分化产物；
(4)采用包含LDN193189、RA、SAG、Y-27632、laminin的第四培养基对所述第三阶段诱导分化产物于37℃进行第四阶段诱导分化1天，获得第四阶段诱导分化产物；
(5)采用包含BDNF、LAA、SAG、FGF8b、Y-27632、laminin的第五培养基对所述第四阶段诱导分化产物于37℃进行第五阶段诱导分化1天，获得第五阶段诱导分化产物；
(6)采用包含BDNF、LAA、SAG、FGF8b、Y-27632、laminin的第六培养基对所述第五阶段诱导分化产物于37℃进行第六阶段诱导分化2-7天，获得第六阶段诱导分化产物；
(7)采用包含BDNF、GDNF、TGF-β3、LAA、cAMP、Y-27632、laminin的第七培养基对所述第六阶段诱导分化产物于37℃进行第七阶段诱导分化5-12天，获得所述多巴胺能神经元。
在一些优选实施方案中，所述第一培养基包括如下组分：杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12(DMEM/F12)，谷氨酰胺衍生物(glutamax)1X，非必须氨基酸(NEAA)1X，丙酮酸钠(sodium pyruvate)1X，青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin)1X，β-巯基乙醇(β-Mercatoethanol)1X，SB431542 10nM，LDN193189 100-250nM，维甲酸(RA)1μM。
在一些优选实施方案中，所述第二培养基包括如下组分：所述第二培养基包括如下组分：杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12(DMEM/F12)，谷氨酰胺衍生物(glutamax)1X，非必须氨基酸(NEAA)1X，丙酮酸钠(sodium pyruvate)1X，青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin)1X，β-巯基乙醇(β-Mercatoethanol)1X，25％的N2添加剂1X，LDN193189100-250nM，维甲酸(RA)1μM，SAG 250nM-1μM，Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
在一些优选实施方案中，所述第三培养基包括如下组分：杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12(DMEM/F12)，谷氨酰胺衍生物(glutamax)1X，非必须氨基酸(NEAA)1X，丙酮酸钠(sodium pyruvate)1X，青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin)1X，β-巯基乙醇(β-Mercatoethanol)1X，50％的N2添加剂1X，LDN193189 100-250nM，维甲酸(RA)1μM，SAG250nM-1μM，Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml；
在一些优选实施方案中，所述第四培养基包括如下组分：杜氏改良EAGLE培养基/营养混合物F-12(DMEM/F12)，谷氨酰胺衍生物(glutamax)1X，非必须氨基酸(NEAA)1X，丙酮酸钠(sodium pyruvate)1X，青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin)1X，β-巯基乙醇(β-Mercatoethanol)1X，75％的N2添加剂1X，LDN193189 100-250nM，RA 1μM，SAG250nM-1μM，Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
在一些优选实施方案中，所述第五培养基包括如下组分：神经元基础培养基(neural basalmedium)，谷氨酰胺衍生物(glutamax)1X，非必须氨基酸(NEAA)1X，丙酮酸钠(sodiumpyruvate)1X，青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin)1X，β-巯基乙醇(β-Mercatoethanol)1X，75％的N2添加剂1X，脑源性神经营养因子(BDNF)10-20ng/ml，抗坏血栓(ascorbicacid)200μM，SAG 250nM-1μM，FGF8b 100ng/ml，Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
在一些优选实施方案中，所述第六培养基包括如下组分：神经元基础培养基(neural basalmedium)，谷氨酰胺衍生物(glutamax)1X，非必须氨基酸(NEAA)1X，丙酮酸钠(sodiumpyruvate)1X，青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin)1X，β-巯基乙醇(β-Mercatoethanol)1X，N2添加剂1X，脑源性神经营养因子(BDNF)10ng/ml，抗坏血栓(LAA，ascorbic acid)200μM，SAG 1μM，FGF8b 100ng/ml，Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
在一些优选实施方案中，所述第七培养基包括如下组分：神经元基础培养基(neural basalmedium)，谷氨酰胺衍生物(glutamax)1X，非必须氨基酸(NEAA)1X，丙酮酸钠(sodiumpyruvate)1X，青霉素/链霉素(Penicillin-Streptomycin)1X，β-巯基乙醇(β-Mercatoethanol)1X，N2 1X，脑源性神经营养因子(BDNF)10-20ng/ml，GDNF 10-20ng/ml，TGF-β3 1ng/ml，抗坏血栓(LAA，ascorbic acid)200μM，cAMP 0.5-1mM，Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
在一些优选实施方案中，所述多巴胺能神经元的分化效率在60％以上。
进一步地，所述多巴胺能神经元的分化效率在80％以上。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的多巴胺能神经元的诱导分化方法于制备治疗帕金森病、视网膜黄斑变性或扩张性心肌病的药物中的用途。
本发明将现有多巴胺能神经元诱导方法中的部分生长因子替换为小分子化合物，大大降低了成本，并且小分子化合物较生长因子稳定性好，保证了培养条件的一致性，以及分化效率的稳定。
本发明通过对诱导过程的改进与优化，多巴胺能神经元分化周期也较现有报道缩短，现有技术中DA神经元分化周期为30-60天，GIBCO公司供应的DA神经元诱导分化试剂盒，诱导周期在60天以上。本发明缩短了DA神经元的分化周期，以E9细胞系为例，分化周期为15-17天，大大低于文献报道，以及市场上供应的DA神经元诱导分化方案。
下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1
1、培养E9细胞系，挑选无分化的克隆进行DA神经元诱导分化。
2、第0-2天：开始第一阶段诱导分化。培养基(basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X；诱导试剂：SB43154210nM，LDN 250nM，RA 1μM。
3、第3-4天：开始第二阶段诱导分化。培养基(1/4N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，25％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
4、第5-6天：开始第三段诱导分化。培养基(1/2N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，50％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin1μg/ml。
5、第7天：开始第四阶段诱导分化。培养基(3/4N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，75％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin1μg/ml。
6、第8天：开始第五阶段诱导分化。培养基(3/4N2 neural basal medium)：neuralbasalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin1X，β-Mercatoethanol 1X，75％的1X N2；诱导试剂：BDNF 10ng/ml，抗坏血栓(LAA，ascorbic acid)200μM，SAG 1μM，FGF8b 100ng/ml；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
7、第9-11天：开始第六阶段诱导分化。培养基(N2 neural basal medium)：neuralbasalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin1X，β-Mercatoethanol 1X，N2 1X。诱导试剂：BDNF 10ng/ml，L-AA 200μM，SAG 1μM，FGF8b100ng/ml,。辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
8、第12-19天：开始第七阶段诱导分化。培养基(N2 neural basal medium)：neural basalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，N2 1X。诱导试剂：BDNF 10ng/ml，GDNF 10ng/ml，TGF-β3 1ng/ml，L-AA 200μM，cAMP 0.5mM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml；从而制得多巴胺能神经元。本实施例中DA神经元的分化效果如图1A所示，多巴胺能神经元的分化效率在85％以上。
实施例2
1、培养健康人来源的iPSCs细胞株(a-5-4-4)，挑选无分化的克隆进行DA神经元诱导分化。
2、第0-2天：开始第一阶段诱导分化。培养基(basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X；诱导试剂：SB43154210nM，LDN 250nM，RA 1μM。
3、第3-4天：开始第二阶段诱导分化。培养基(1/4N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，25％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
4、第5-6天：开始第三段诱导分化。培养基(1/2N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，50％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin1μg/ml。
5、第7天：开始第四阶段诱导分化。培养基(3/4N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，75％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin1μg/ml。
6、第8天：开始第五阶段诱导分化。培养基(3/4N2 neural basal medium)：neuralbasalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin1X，β-Mercatoethanol 1X，75％的1X N2；诱导试剂：BDNF 10ng/ml，抗坏血栓(LAA，ascorbic acid)200μM，SAG 1μM，FGF8b 100ng/ml；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
7、第9-11天：开始第六阶段诱导分化。培养基(N2 neural basal medium)：neuralbasalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin1X，β-Mercatoethanol 1X，N2 1X。诱导试剂：BDNF 10ng/ml，L-AA 200μM，SAG 1μM，FGF8b100ng/ml,。辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
8、第12-19天：开始第七阶段诱导分化。培养基(N2 neural basal medium)：neural basalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，N2 1X。诱导试剂：BDNF 10ng/ml，GDNF 10ng/ml，TGF-β3 1ng/ml，L-AA 200μM，cAMP 0.5mM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml；从而制得多巴胺能神经元。本实施例中DA神经元的分化效果如图1B所示，多巴胺能神经元的分化效率在80％以上。
实施例3
1、培养携带LRRK2 G2019S的iPSCs细胞株(B04)，挑选无分化的克隆进行DA神经元诱导分化。
2、第0-5天：开始第一阶段诱导分化。培养基(basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X；诱导试剂：SB43154210nM，LDN 250nM，RA 1μM。
3、第6-7天：开始第二阶段诱导分化。培养基(1/4N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，25％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
4、第8-9天：开始第三段诱导分化。培养基(1/2N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，50％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin1μg/ml。
5、第10天：开始第四阶段诱导分化。培养基(3/4N2 basal medium)：DMEM/F12，glutamax1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，75％的1X N2；诱导试剂：LDN 250nM，RA 1μM，SAG 1μM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin1μg/ml。
6、第11天：开始第五阶段诱导分化。培养基(3/4N2 neural basal medium)：neural basalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，75％的1X N2；诱导试剂：BDNF 10ng/ml，抗坏血栓(ascorbic acid)200μM，SAG 1μM，FGF8b 100ng/ml；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
7、第12-17天：开始第六阶段诱导分化。培养基(N2 neural basal medium)：neural basalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，N2 1X。诱导试剂：BDNF 10ng/ml，L-AA 200μM，SAG 1μM，FGF8b 100ng/ml,。辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml。
8、第18-25天：开始第七阶段诱导分化。培养基(N2 neural basal medium)：neural basalmedium，glutamax 1X，NEAA 1X，sodium pyruvate 1X，Penicillin-Streptomycin 1X，β-Mercatoethanol 1X，N2 1X。诱导试剂：BDNF 10ng/ml，GDNF 10ng/ml，TGF-β3 1ng/ml，L-AA 200μM，cAMP 0.5mM；辅助试剂：Y-27632 10μM，laminin 1μg/ml；从而制得多巴胺能神经元。本实施例中DA神经元的分化效果如图1C所示，多巴胺能神经元的分化效率在80％以上。
对比例1
方法同实施例2，不同之处在于诱导分化中不使用LDN193189，对比例1与实施例2中分化效果图分别如图2A、图2B所示，其中，图2A未使用LDN193189进行DA神经元分化，第6天光镜示图，细胞大部分未分化且趋于凋亡；图2B使用LDN193189进行DA神经元分化，第6天光镜示图，显示出神经干细胞外形。
对比例2
方法同实施例2，不同之处在于诱导分化中不使用SAG，对比例2与实施例2中分化效果图分别如图3A、图3B所示，其中，图3A未使用SAG进行DA神经元分化，第8天光镜示图，细胞形态不佳、趋于凋亡；图3B使用SAG进行DA神经元分化，第8天光镜示图，部分细胞显示出神经元胞体及突触形态。
对比例3
方法同实施例2，不同之处在于诱导分化中不使用RA，对比例3与实施例2中分化效果图分别如图4A、图4B所示，其中，图4A未使用RA进行DA神经元分化，第3天光镜示图，iPSCs克隆边缘无明显变化；图4B使用RA进行DA神经元分化，第3天光镜示图，iPSCs克隆边缘显著改变，部分呈类神经干细胞形态。
对比例4
方法同实施例2，不同之处在于诱导分化中不使用辅助试剂，对比例4与实施例2中分化效果图分别如图5A、图5B所示，其中，图5A中DA神经元分化过程中未使用辅助试剂，在DA神经元成熟阶段，神经元贴壁效果显著减弱，神经元数目及活性显著降低；图5B中DA神经元分化过程中使用辅助试剂，在DA神经元成熟阶段，神经元贴壁效果好，神经元轴突显著延长、神经元数目及活性显著增加。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种多巴胺能神经元的诱导分化方法，其特征在于包括：
（1）采用包含SB431542、LDN193189、维甲酸的第一培养基对干细胞于37℃进行第一阶段诱导分化3-6天，获得第一阶段诱导分化产物；其中，所述第一培养基包括如下组分：杜氏改良Eagle 培养基/营养混合物 F-12，谷氨酰胺衍生物1X，非必须氨基酸1X，丙酮酸钠1X，青霉素/链霉素1X，β-巯基乙醇1X，SB431542 10 nM，LDN193189 100-250nM，维甲酸 1μM；
（2）采用包含LDN193189、维甲酸、Smo受体激动剂、Y-27632、laminin的第二培养基对所述第一阶段诱导分化产物于37℃进行第二阶段诱导分化2天，获得第二阶段诱导分化产物；其中，所述第二培养基包括如下组分：杜氏改良Eagle 培养基/营养混合物 F-12，谷氨酰胺衍生物1X，非必须氨基酸1X，丙酮酸钠1X，青霉素/链霉素1X，β-巯基乙醇1X，25%的N2添加剂1X，LDN193189 100-250nM，维甲酸 1μM，Smo受体激动剂 250nM-1μM，Y-27632 10 μM，laminin 1μg/ml；
（3）采用包含LDN193189、维甲酸、Smo受体激动剂、Y-27632、laminin的第三培养基对所述第二阶段诱导分化产物于37℃进行第三阶段诱导分化1-2天，获得第三阶段诱导分化产物；其中，所述第三培养基包括如下组分：杜氏改良Eagle 培养基/营养混合物 F-12，谷氨酰胺衍生物1X，非必须氨基酸1X，丙酮酸钠1X，青霉素/链霉素1X，β-巯基乙醇1X，50%的N2添加剂 1X，LDN193189 100-250nM，维甲酸 1μM，Smo受体激动剂 250nM-1μM，Y-27632 10 μM，laminin 1μg/ml；
（4）采用包含LDN193189、维甲酸、Smo受体激动剂、Y-27632、laminin的第四培养基对所述第三阶段诱导分化产物于37℃进行第四阶段诱导分化1天，获得第四阶段诱导分化产物；其中，所述第四培养基包括如下组分：杜氏改良EAGLE 培养基/营养混合物 F-12，谷氨酰胺衍生物1X，非必须氨基酸1X，丙酮酸钠1X，青霉素/链霉素1X，β-巯基乙醇1X，75%的N2添加剂1X，LDN193189 100-250nM，维甲酸 1μM，Smo受体激动剂 250nM-1μM，Y-27632 10 μM，laminin 1μg/ml；
（5）采用包含BDNF、L-抗坏血酸、Smo受体激动剂、FGF8b、Y-27632、laminin的第五培养基对所述第四阶段诱导分化产物于37℃进行第五阶段诱导分化1天，获得第五阶段诱导分化产物；其中，所述第五培养基包括如下组分：神经元基础培养基，谷氨酰胺衍生物1X，非必须氨基酸1X，丙酮酸钠1X，青霉素/链霉素1X，β-巯基乙醇1X，75%的N2添加剂 1X，BDNF 10-20ng/ml，L-抗坏血酸 200μM，Smo受体激动剂 250nM-1μM，FGF8b 100ng/ml，Y-27632 10 μM，laminin 1μg/ml；
（6）采用包含BDNF、L-抗坏血酸、Smo受体激动剂、FGF8b、Y-27632、laminin的第六培养基对所述第五阶段诱导分化产物于37℃进行第六阶段诱导分化2-7天，获得第六阶段诱导分化产物；其中，所述第六培养基包括如下组分：神经元基础培养基，谷氨酰胺衍生物1X，非必须氨基酸1X，丙酮酸钠1X，青霉素/链霉素1X，β-巯基乙醇1X，N2添加剂 1X，BDNF 10ng/ml，L-抗坏血酸 200μM，Smo受体激动剂 1μM，FGF8b 100ng/ml，Y-27632 10 μM，laminin 1μg/ml；
（7）采用包含BDNF、GDNF、TGF-β3、L-抗坏血酸、cAMP、Y-27632、laminin的第七培养基对所述第六阶段诱导分化产物于37℃进行第七阶段诱导分化5-12天，获得所述多巴胺能神经元；其中，所述第七培养基包括如下组分：神经元基础培养基，谷氨酰胺衍生物1X，非必须氨基酸1X，丙酮酸钠1X，青霉素/链霉素1X，β-巯基乙醇1X，N2添加剂 1X，BDNF 10-20ng/ml，GDNF 10-20ng/ml，TGF-β3 1ng/ml，L-抗坏血酸 200μM，cAMP 0.5-1mM，Y-27632 10 μM，laminin 1μg/ml。
2.根据权利要求1所述的诱导分化方法，其特征在于：所述laminin及Y-27632能够抑制细胞凋亡、促进神经元贴壁。
3.根据权利要求1所述的诱导分化方法，其特征在于：所述干细胞选自人类胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞。
4.根据权利要求1所述的诱导分化方法，其特征在于：所述多巴胺能神经元的分化效率在60%以上。
5.根据权利要求4所述的诱导分化方法，其特征在于：所述多巴胺能神经元的分化效率在80%以上。
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