CN111690605A - 一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法 - Google Patents

一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111690605A
CN111690605A CN202010697291.XA CN202010697291A CN111690605A CN 111690605 A CN111690605 A CN 111690605A CN 202010697291 A CN202010697291 A CN 202010697291A CN 111690605 A CN111690605 A CN 111690605A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
adipose
stem cells
derived stem
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010697291.XA
Other languages
English (en)
Inventor
徐子卓
宫岩
陈坤
王卓凡
姜辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Saier Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Qingdao Saier Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Saier Biomedical Technology Co ltd filed Critical Qingdao Saier Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN202010697291.XA priority Critical patent/CN111690605A/zh
Publication of CN111690605A publication Critical patent/CN111690605A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，属于生物医疗技术领域，通过对脂肪干细胞的分离、脂肪干细胞的传代培养、诱导培养转化得到多巴胺能神经元，实现了利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够安全、有效的获得批量稳定的多巴胺能神经元，具有较高的分化率，通过免疫荧光及细胞计数实验表明，多巴胺能神经元转化率为90.4±0.76，生存率为98.9±0.55，使用多巴胺ELISA试剂盒检测转化后的多巴胺能神经元分泌多巴胺的数量平均为450pg/ml，因此，证实本发明所提供的脂肪干细胞提取及转化步骤具有温和、稳定的特点，提取的细胞适用于大批量应用。

Description

一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法。
背景技术
帕金森(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病，其以黑质中多巴胺能神经元(dopaminergic neurons)的消失及路易小体的积聚为主要医学特征，以肌强直、动作迟缓、运动障碍、静止性震颤、睡眠行为异常等为临床表现。在我国，65岁以上中老年帕金森患病率为1.7％，随着老龄化现象逐年加重，帕金森患者的诊断与治疗应引起巨大关注。目前，帕金森的主要治疗方案为促多巴胺释放和缓解运动功能，通过药物治疗可在一定程度上缓解症状，但长期服用产生药物耐受，药物效果逐渐失效；同时随着病情进一步进展，药物剂量逐渐增加，出现严重的药物副作用。因此，开发新型安全有效的帕金森治疗方法是急需解决的重要问题。
干细胞治疗在神经退行性疾病上具有广大应用前景，先前大量动物实验，证实干细胞及诱导的多巴胺能神经元等在阿尔茨海默症及帕金森的治疗中均显示出一定的治疗效果。其中，帕金森由于患者黑质等分泌多巴胺的神经元衰老或凋亡，使神经系统中多巴胺分泌减少或无法正常分泌多巴胺，导致帕金森病的发生。临床上的治疗方案一个是药物治疗，患者通过摄入多巴胺替代品缓解临床表现，而这种方法疗效有限，随病情进展，药物效果减弱或失效，且随着用药剂量的加大，副作用明显加大，导致人体不能耐受，病人疾病治疗失效；另一种治疗方法是脑深部电极刺激(DBS)，俗称脑起搏器，在深部电极的刺激下，促使黑质细胞产生多巴胺，然而这种DBS刺激方案因个体差异而不同，选择这种治疗方式时病人筛选具有严格的适应症，控制器的调试较复杂，易导致细胞开关反应过激出现副作用，且病情变化时固定参数不能适应病人病情的变化的需要，有时治疗效果有限，另外DBS应用一段时间后效果逐渐减弱或消失，同时得不到有效治疗。目前，国内外研究通过使用胎脑神经干细胞、胚胎神经干细胞、iPSCs细胞等进行移植来治疗帕金森病，虽得到一定的初步结果，但由于伦理问题难以通过，利用基因编辑技术等获得的诱导性细胞具有致瘤性，且此方法存在技术复杂、成本过高、实验不易控制，批次间纯度不一等问题，众议较多，限制了以上干细胞方法的应用，难以进一步发展。
发明内容
本发明提供一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞后，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够实现脂肪干细胞培养及转化，能够稳定分离、扩增脂肪干细胞，且能高效的实现脂肪干细胞转化为能够分泌多巴胺的多巴胺能神经元，可以广泛应用于老年痴呆症的治疗。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法包括：
采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；
采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；
采用25ml的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的50ml无菌离心管中，之后采用等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中保持230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；
振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于5分钟；
之后丢掉顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用100μm分子筛进行筛选之后，再次采用离心机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于10分钟；
之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟之后，加入脂肪干细胞培养液并调整细胞浓度至1.5x105～2.5x105/cm2，培养48小时以使细胞融合度达到85％～90％之间；
当细胞融合度达到85％～90％之间后，采用吸管吸出培养瓶内的培养基，加入PBS/生理盐水洗涤细胞一次，之后加入1～2ml胰蛋白酶替代物消化2～3分钟，在显微镜下观察到细胞变圆后加入4ml培养基终止消化，之后轻轻吹吸若干次以使培养细胞从培养瓶的底部脱落；
将脱落形成的细胞悬液吸入15ml离心管中，采用280r/min的离心机进行离心分离10分钟后，舍弃上次清液，并加入2ml培养基进行吹吸混匀，吹吸混匀后平均分配到3个新的培养瓶中；
在新的培养瓶中补加适量培养基之后轻轻晃动培养瓶，待细胞均匀分布之后放入37℃的5％二氧化碳培养箱中进行培养以使脂肪干细胞发生传代；
将发生传代反应到第三至第五代的脂肪干细胞放置在明胶包被的6孔培养板中进行诱导分化培养，培养密度为20000个/孔，培养一天之后采用生理盐水进行清洗一遍；
清洗完毕之后将生长培养基替换为含有低糖DMEM、1％FBS、0.6％B27、250ng/mlSHH、100ng/ml FGF8、50ng/ml bFGF和100g/ml L-谷氨酰胺的诱导培养基继续进行诱导分化培养；
诱导分化培养至第八天时，采用生理盐水进行清洗之后将生长培养基替换为DMEM低糖、50ng/ml BDNF、100g/ml L-谷氨酰胺的转化培养基，并将细胞温育培养4天，诱导分化后得到多巴胺能神经元。
可选的，所述采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗之前，所述方法还包括：
提取1～2ml的自体脂肪组织样品进行传染病和微生物检测，检测合格之后采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗。
本发明的有益效果如下：
本发明实施例提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法通过对脂肪干细胞的分离、脂肪干细胞的传代培养、诱导培养转化得到多巴胺能神经元，实现了利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够安全、有效的获得批量稳定的多巴胺能神经元，具有较高的分化率，通过免疫荧光及细胞计数实验表明，采用本发明的方法在原代细胞培养第5天，原代神经细胞生存率约为82％，多巴胺能神经元转化率为90.4±0.76，生存率为98.9±0.55，使用多巴胺ELISA试剂盒检测转化后的多巴胺能神经元分泌多巴胺的数量平均为450pg/ml，因此，本发明实施例的方法培养过程中原代细胞初期存活率高，证实本发明所提供的脂肪干细胞提取及转化步骤具有温和、稳定的特点，提取的细胞适用于大批量应用，而且，本发明的方法获得的多巴胺能神经元大量分泌多巴胺，表示转化步骤具有效率高、批次间差异小。
具体实施方式
下面将对本发明实施例的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法进行详细的说明。
脂肪干细胞是存在于人体脂肪组织中，具有多能分化能力的细胞，大量实验证实，在一定诱导环境中，脂肪细胞可分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等，移植后具有良好的替代、修复及治疗作用，且无致瘤性，不与自体发生免疫排斥。本项目是经过我公司研发团队经创造性的研发后，创新性的使用自体脂肪干细胞，经过细胞因子诱导成为可分泌多巴胺的神经元细胞，可以提供给医疗机构治疗帕金森病人。此项目避免了伦理问题和异体细胞移植的不安全性，分离纯化后的脂肪干细胞经转化，可获得纯度较为一致的、非基因编辑的、安全稳定且适用于大批量培养的多巴胺能神经元，适用于帕金森病人的个体化治疗，可以为临床治疗帕金森提供一种稳定可行的方法。
本发明提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法包括：
(1)采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；
其中，获得自体脂肪组织样品之后，需要对自体脂肪组织样品进行传染病和微生物检测，可以提取1～2ml的自体脂肪组织样品进行传染病和微生物检测，检测合格之后采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗一边后续培养和分化使用。
(2)采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；
(3)采用25ml的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的50ml无菌离心管中，之后采用等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中保持230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；
(4)振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于5分钟；
(5)之后丢掉顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用100μm分子筛进行筛选之后，再次采用离心机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于10分钟；
(6)之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟之后，加入脂肪干细胞培养液并调整细胞浓度至1.5x105～2.5x105/cm2，培养48小时以使细胞融合度达到85％～90％之间；
(7)当细胞融合度达到85％～90％之间后，采用吸管吸出培养瓶内的培养基，加入PBS/生理盐水洗涤细胞一次，之后加入1～2ml胰蛋白酶替代物消化2～3分钟，在显微镜下观察到细胞变圆后加入4ml培养基终止消化，之后轻轻吹吸若干次以使培养细胞从培养瓶的底部脱落；
(8)将脱落形成的细胞悬液吸入15ml离心管中，采用280r/min的离心机进行离心分离10分钟后，舍弃上次清液，并加入2ml培养基进行吹吸混匀，吹吸混匀后平均分配到3个新的培养瓶中；
(9)在新的培养瓶中补加适量培养基之后轻轻晃动培养瓶，待细胞均匀分布之后放入37℃的5％二氧化碳培养箱中进行培养以使脂肪干细胞发生传代；
(10)将发生传代反应到第三至第五代的脂肪干细胞放置在明胶包被的6孔培养板中进行诱导分化培养，培养密度为20000个/孔，培养一天之后采用生理盐水进行清洗一遍；
(11)清洗完毕之后将生长培养基替换为含有低糖DMEM、1％FBS、0.6％B27、250ng/ml SHH、100ng/ml FGF8、50ng/ml bFGF和100g/ml L-谷氨酰胺的诱导培养基继续进行诱导分化培养；
本发明实施例提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，在明胶包被的6孔培养板中培养第三至第五代ADSC，诱导分化的第二天用生理盐水清洗一遍后，加入含有低糖DMEM、1％FBS、0.6％B27、250ng/ml SHH、100ng/ml FGF8、50ng/ml bFGF和100g/ml L-谷氨酰胺的诱导培养基，使得本发明实施例的培养方法能够稳定诱导脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，并使其保持较高分化率，并且可以保证分化后的多巴胺能神经元的安全性。
(12)诱导分化培养至第八天时，采用生理盐水进行清洗之后将生长培养基替换为DMEM低糖、50ng/ml BDNF、100g/ml L-谷氨酰胺的转化培养基，并将细胞温育培养4天，诱导分化后得到多巴胺能神经元。
其中，诱导分化结束之后，采用细胞免疫荧光法检测多巴胺能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞及hoechst染色以确定脂肪干细胞转化率，利用台盼蓝染色计算活细胞数。最后，使用多巴胺ELISA试剂盒检测细胞上清中多巴胺的含量。
本发明实施例采用自体脂肪干细胞通过诱导培养制备分泌多巴胺能神经元细胞，避免使用胎儿脑组织、胚胎组织以及基因编辑的iPSCs细胞，避免了伦理问题和细胞致瘤性。
本发明实施例提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法通过对脂肪干细胞的分离、脂肪干细胞的传代培养、诱导培养转化得到多巴胺能神经元，实现了利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够安全、有效的获得批量稳定的多巴胺能神经元，具有较高的分化率，通过免疫荧光及细胞计数实验表明，采用本发明的方法在原代细胞培养第5天，原代神经细胞生存率约为82％，多巴胺能神经元转化率为90.4±0.76，生存率为98.9±0.55，使用多巴胺ELISA试剂盒检测转化后的多巴胺能神经元分泌多巴胺的数量平均为450pg/ml，因此，本发明实施例的方法培养过程中原代细胞初期存活率高，证实本发明所提供的脂肪干细胞提取及转化步骤具有温和、稳定的特点，提取的细胞适用于大批量应用，而且，本发明的方法获得的多巴胺能神经元大量分泌多巴胺，表示转化步骤具有效率高、批次间差异小。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；
采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；
采用25ml的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的50ml无菌离心管中，之后采用等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中保持230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；
振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于5分钟；
之后丢掉顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用100μm分子筛进行筛选之后，再次采用离心机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于10分钟；
之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟之后，加入脂肪干细胞培养液并调整细胞浓度至1.5x105～2.5x105/cm2，培养48小时以使细胞融合度达到85％～90％之间；
当细胞融合度达到85％～90％之间后，采用吸管吸出培养瓶内的培养基，加入PBS/生理盐水洗涤细胞一次，之后加入1～2ml胰蛋白酶替代物消化2～3分钟，在显微镜下观察到细胞变圆后加入4ml培养基终止消化，之后轻轻吹吸若干次以使培养细胞从培养瓶的底部脱落；
将脱落形成的细胞悬液吸入15ml离心管中，采用280r/min的离心机进行离心分离10分钟后，舍弃上次清液，并加入2ml培养基进行吹吸混匀，吹吸混匀后平均分配到3个新的培养瓶中；
在新的培养瓶中补加适量培养基之后轻轻晃动培养瓶，待细胞均匀分布之后放入37℃的5％二氧化碳培养箱中进行培养以使脂肪干细胞发生传代；
将发生传代反应到第三至第五代的脂肪干细胞放置在明胶包被的6孔培养板中进行诱导分化培养，培养密度为20000个/孔，培养一天之后采用生理盐水进行清洗一遍；
清洗完毕之后将生长培养基替换为含有低糖DMEM、1％FBS、0.6％B27、250ng/ml SHH、100ng/ml FGF8、50ng/ml bFGF和100g/ml L-谷氨酰胺的诱导培养基继续进行诱导分化培养；
诱导分化培养至第八天时，采用生理盐水进行清洗之后将生长培养基替换为DMEM低糖、50ng/ml BDNF、100g/ml L-谷氨酰胺的转化培养基，并将细胞温育培养4天，诱导分化后得到多巴胺能神经元。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗之前，所述方法还包括：
提取1～2ml的自体脂肪组织样品进行传染病和微生物检测，检测合格之后采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗。
CN202010697291.XA 2020-07-20 2020-07-20 一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法 Pending CN111690605A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010697291.XA CN111690605A (zh) 2020-07-20 2020-07-20 一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010697291.XA CN111690605A (zh) 2020-07-20 2020-07-20 一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111690605A true CN111690605A (zh) 2020-09-22

Family

ID=72486299

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010697291.XA Pending CN111690605A (zh) 2020-07-20 2020-07-20 一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111690605A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113388580A (zh) * 2021-06-16 2021-09-14 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080176328A1 (en) * 2007-01-19 2008-07-24 Seoul National University Industry Foundation Method of inducing differentiation of mesenchymal stem cells into neurons
CN105567636A (zh) * 2016-03-14 2016-05-11 厚朴生物科技（苏州）有限公司 一种人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法及其应用
CN110257332A (zh) * 2019-07-08 2019-09-20 广东省赛莱拉干细胞研究院 一种诱导间充质干细胞分化成为多巴胺能神经元的培养基以及方法
CN111304167A (zh) * 2018-12-12 2020-06-19 上海泉眼生物科技有限公司 人源脂肪干细胞来源的神经元前体细胞及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080176328A1 (en) * 2007-01-19 2008-07-24 Seoul National University Industry Foundation Method of inducing differentiation of mesenchymal stem cells into neurons
CN105567636A (zh) * 2016-03-14 2016-05-11 厚朴生物科技（苏州）有限公司 一种人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法及其应用
CN111304167A (zh) * 2018-12-12 2020-06-19 上海泉眼生物科技有限公司 人源脂肪干细胞来源的神经元前体细胞及其制备方法和应用
CN110257332A (zh) * 2019-07-08 2019-09-20 广东省赛莱拉干细胞研究院 一种诱导间充质干细胞分化成为多巴胺能神经元的培养基以及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SOHEILIFAR, MH等: "Generation of Dopamine-Secreting Cells from Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells In Vitro", 《REJUVENATION RESEARCH》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113388580A (zh) * 2021-06-16 2021-09-14 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108004207B (zh) 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法
CN107858329B (zh) 从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法和使用的试液
CN102066555A (zh) 用于治疗糖尿病的源自人脂肪组织的胰岛素生产性间充质干细胞
CN108865986B (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN108315297A (zh) 一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法
CN109797132A (zh) 一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法
CN111826348A (zh) 一种人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞体外高效制备方法和应用
CN111690605A (zh) 一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法
CN106854638A (zh) 一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
CN111500578A (zh) 调控ADSCs成骨分化及组织再生Circ RNA-FTO及其应用
CN112195151B (zh) 一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法
CN102827812A (zh) 诱导型神经干细胞的制备方法及应用
CN105695409B (zh) 一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法
WO2023179001A1 (zh) 骨髓间充质干细胞外泌体在治疗帕金森病中的应用
CN108034634B (zh) 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法
CN106834259A (zh) 一种人脂肪组织消化酶及其制备方法
WO2022148500A2 (zh) 多聚嘧啶序列结合蛋白在制备脊髓损伤的修复药物中的应用
CN113388580B (zh) 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途
CN117157389A (zh) 毛囊间充质干细胞的制备方法以及应用
EP4092106A1 (en) Inducer for inducing mesenchymal stem cells to differentiate into islet cells
CN101845416A (zh) 老年性痴呆治疗用脂肪源干细胞
CN112175902A (zh) 一种脂肪干细胞的分离方法
CN106434550A (zh) 一种改良的PPCs细胞培养方法
CN111228311A (zh) 保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法
CN110742906A (zh) 一种间充质干细胞旁分泌因子在制备疼痛药中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination