CN112175902A - 一种脂肪干细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种脂肪干细胞的分离方法，所述分离方法包括将脂肪组织与浓度为0.05～0.3％(m/v)的胶原酶混合后，再进行超声处理。本发明的分离方法减少酶对细胞的损伤，有效提高获得的脂肪干细胞的活性；每单位体积分离获得的有活性的脂肪干细胞数量较现有方法提高30％；较现有方法减少50％的酶用量，使发生超敏反应的可能性降低，有效降低了分离细胞所需成本；较现有方法减少酶与细胞作用时间的2/3，对细胞活性影响小，有效的减少胶原酶可能造成的细胞损伤和对人体的潜在风险。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种脂肪干细胞的分离方法。
背景技术
目前，随着干细胞应用技术的不断发展，临床对干细胞治疗的需求也是日益增长。脂肪干细胞是从脂肪组织中提取的一种间充质干细胞，具有多向分化能力，合成多种生长因子的能力，促进组织再生与修复的能力，已被证实在多种疾病的治疗上有良好的临床效果。脂肪干细胞的巨大应用前景，要求其能达到快速分离、保持高细胞活性，对脂肪干细胞的分离方法提出了新的要求，需要开发一种更快速高效的分离方法。
现有的分离技术主要为酶消化法，通过胶原酶消化处理抽取的脂肪组织，使细胞间连结解离，细胞可以脱落下来，通过离心方式使密度较大的脂肪干细胞和密度较小的脂肪细胞分层，收集下层的脂肪干细胞。此方法虽然产量较高，但存在的主要问题有：耗时长，即便是技术熟悉的人员操作，也需要1.5小时才能完成分离；为提高效率需要较高浓度的胶原酶，而高浓度胶原酶会增加其残留的比率，增加发生过敏等不良反应的概率，从而增加了异种蛋白对人体产生危害的风险，且胶原酶浓度较高增加了分离成本；效率不稳定：该方法对细胞分离效率和获得细胞质量的一个重要影响步骤为胶原酶消化的是否适度，消化时间过短，消化不充分，则细胞获得率低；消化时间过长，消化过度，则细胞活性低。是否达到适度消化，仍是依赖于操作人员经验，需要较长的学习曲线才能达到较好的操作效果。其他分离方法还包括通过机械力(直接离心法、震荡离心法、旋涡离心法、吸附柱法等)方式使脂肪干细胞从细胞外基质上脱落后收集细胞，这些方法虽然耗时较短，但产量低，效率低，无法推广应用。因此，目前仍缺乏安全、高效的干细胞分离方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脂肪干细胞的分离方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种脂肪干细胞的分离方法，所述分离方法包括将脂肪组织与浓度为0.05～0.3％(m/v)的胶原酶混合后，再进行超声处理。
优选地，所述脂肪组织选自动物脂肪组织或人脂肪组织。
优选地，所述胶原酶选自单一类型的胶原酶或混合型的胶原酶。
优选地，所述单一类型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的任一种；所述混合型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的几种类型的组合。
优选地，所述脂肪组织与胶原酶的体积比为1:1～1:1.5。
优选地，所述超声处理的功率选自50～200W。
优选地，所述超声处理的时间为30～150秒。
优选地，所述分离方法还包括以下步骤：
1)将超声处理后的混合液置于摇床中继续消化，直至消化成均匀混悬液；
2)将消化后获得的混悬液离心，弃上层脂肪细胞和中间的液体，保留底层的脂肪干细胞团；
3)用磷酸缓冲盐溶液或生理盐水洗涤脂肪干细胞团，洗涤后重悬即获得脂肪干细胞单细胞悬液。
优选地，步骤1)中，所述摇床的温度为35～37℃，继续消化时间为20～30分钟。
本发明还提供所述的分离方法获得的脂肪干细胞在制备治疗促进急慢性创面愈合、治疗皮肤老化、促进皮肤再生、治疗关节退行性变或血管病变产品中的用途。
如上所述，本发明的脂肪干细胞分离方法，具有以下有益效果：
1)应用本方法分离脂肪干细胞所需时间仅为40-47分钟，相比较现有方法所需的77-110分钟，缩短了脂肪干细胞分离47-56％的耗时。
2)减少酶对细胞的损伤，有效提高获得的脂肪干细胞的活性；应用本申请的技术每单位体积分离获得的有活性的脂肪干细胞数量较现有方法提高30％；较现有方法减少50％的酶用量，使发生超敏反应的可能性降低，有效降低了分离细胞所需成本；较现有方法减少酶与细胞作用时间的2/3，对细胞活性影响小，有效的减少胶原酶可能造成的细胞损伤和对人体的潜在风险。
3)增加分离效率的稳定性，达到更高效、更安全、更稳定的效果，获得的脂肪干细胞具有良好细胞增殖能力和三向分化能力，保持干细胞的生物学功能。
附图说明
图1显示为本发明的分离方法与现有方法用时比较。
图2显示为本发明的分离方法与现有方法获得的细胞产量比较。
图3显示为本发明的分离方法与现有方法获得的细胞增殖速率比较。
图4显示为本发明的分离方法与现有方法获得的细胞三向分化能力比较。
图5显示为本发明的分离方法与现有方法获得的细胞形态学比较。
具体实施方式
本发明提供一种脂肪干细胞的分离方法，所述分离方法包括将脂肪组织与浓度为0.05～0.3％(m/v)的胶原酶混合后，再进行超声处理。
所述脂肪组织并无特殊限定，例如可以选自动物脂肪组织或人脂肪组织。所述动物可以为啮齿类动物。所述脂肪组织的获取方法可以采用现有技术，例如抽脂术。
在一种实施方式中，所述脂肪组织获得后用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水冲洗。为便于脂肪组织的保存和使用，还可以将冲洗后的脂肪组织进行分装。例如，按照5ml/管分装于50ml离心管中。
所述胶原酶选自单一类型的胶原酶或混合型的胶原酶。所述单一类型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的任一种。在一较佳实施例中，所述单一类型的胶原酶选自Ⅳ型胶原酶。
所述混合型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的几种类型的组合。在一种实施方式中，所述混合胶原酶由I型胶原酶、II型胶原酶和IV型胶原酶组成。
胶原酶的浓度选自以下任一范围：0.05～0.08％(m/v)、0.08～0.12％(m/v)、0.12～0.15％(m/v)、0.15～0.18％(m/v)、0.18～0.3％(m/v)。混合型胶原酶中，胶原酶的浓度是指所有类型的胶原酶的总浓度。
所述脂肪组织与胶原酶的混合体积比为1:0.8～1:2.0。例如可以选自以下任一范围：1:0.8～1:1，1:1～1:1.2，1:1.2～1:1.4，1:1.4～1:1.5，1:1.5～1:2.0。
超声处理的功率和时间以不影响待分离的脂肪干细胞的结构和功能为标准。在一种实施方式中，所述超声处理的功率选自50～200W。例如可以选自以下任一范围：50～80W、80～110W、110～140W、140～170W、170～200W。超声处理的功率若过大，会损伤待分离的脂肪干细胞结构；超声处理的功率若过小，则起不到促进消化作用。利用超声一方面可以介导空化断裂脂肪组织中粗大的细胞外胶原纤维连接，另一方面，通过在液体中产生震荡机械力，有效使松解的组织相互分离，快速的使成团块状的脂肪组织分离为均匀细小的少量细胞聚集的颗粒，可有效提高酶处理时组织和液体接触面积，提高酶消化效率，缩短酶消化处理时间，更高效分离脂肪干细胞。
按照上述功率，所述超声处理的时间为30～150秒。实际的超声时间根据细胞的状态确定，例如可以选自以下任一范围：30～60秒、60～90秒、90～120秒、120～150秒。
所述超声处理可以在常温或者35～38℃条件下进行。在一较佳实施方式中，所述超声处理35～38℃条件下进行。35～38℃一方面有利于酶发挥作用，另一方面可以减少细胞在常温下的时间，使细胞处于生理温度下，减小对细胞的损伤。
在一种实施方式中，所述分离方法还包括以下步骤：
1)将超声处理后的混合液置于摇床中继续消化，直至消化成均匀混悬液；
2)将消化后获得的混悬液离心，弃上层脂肪细胞和中间的液体，保留底层的脂肪干细胞团；
3)用磷酸缓冲盐溶液或生理盐水洗涤脂肪干细胞团，洗涤后重悬即获得脂肪干细胞单细胞悬液。
在一种实施方式中，步骤1)中，所述摇床的温度以及转速为适宜酶发挥作用的条件。例如37℃恒温、80-150转/分钟的摇速，消化20～30分钟。
在一种实施方式中，步骤3)中可根据实际使用的目的选择合适的试剂重悬脂肪干细胞。例如可以选择生理盐水。
在一种实施方式中，所述分离方法包括以下步骤：
1)冲洗脂肪组织用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水；
2)按体积比1：1将配置好的0.1％胶原酶溶液与脂肪组织混合；
3)先以50-200W功率超声处理30-150秒，放入37℃恒温摇床以80-150转/分钟的摇速摇匀，消化20-30分钟，消化成均匀混悬液。
4)将所得混悬液离心，弃上层脂肪细胞和中间的液体后，留取底层的脂肪干细胞团。
5)向脂肪干细胞团中加入磷酸缓冲盐溶液或生理盐水，反复吹打重悬细胞，使之成为均匀的单细胞悬液，充分洗涤，再离心，弃去上层液体，保留底部脂肪干细胞团；再重复本洗涤步骤2次。
6)充分洗涤后，根据需要浓度，加入适量生理盐水，反复吹打细胞，使之成为脂肪干细胞单细胞悬液。
获得的脂肪干细胞单细胞悬液可以直接用于临床治疗，例如脂肪移植，也可以按照常规的脂肪干细胞培养方法培养、传代、冻存。
在一种实施方式中，整个分离过程均在无菌条件下进行。
本申请的脂肪干细胞在制备治疗促进急慢性创面愈合、治疗皮肤老化、促进皮肤再生、治疗关节退行性变、血管病变产品中的用途。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1脂肪干细胞的分离
按照以下两种方法进行脂肪干细胞的分离：
超声结合酶消化法(本申请的方法)：
1)无菌条件下，获取抽脂术所得脂肪组织。将脂肪组织用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水冲洗后，按照5ml/管分装于50ml离心管中。
2)配置0.1％胶原酶(将0.05g胶原酶溶于50ml磷酸盐缓冲溶液或生理盐水中)；按体积比1：1将配置好的0.1％胶原酶溶液加入装有脂肪的离心管中。
3)先以50-200W功率超声处理30-150秒，将离心管放入37℃恒温摇床以80-150转/分钟的摇速摇匀，消化20-30分钟，直至消化成均匀混悬液状态。
4)将所得混悬液以1500转/分钟的速度离心5分钟，弃上层脂肪细胞和中间的液体后，留取底层的脂肪干细胞团。
5)向装有脂肪干细胞团的离心管中加入10ml磷酸缓冲盐溶液或生理盐水，反复吹打重悬细胞，使之成为均匀的单细胞悬液，充分洗涤，再以1500转/分钟的速度离心5分钟，弃去上层液体，保留底部脂肪干细胞团；再重复本洗涤步骤2次。
6)充分洗涤后，加入适量生理盐水，反复吹打细胞，使之成为脂肪干细胞单细胞悬液。
以上方法总耗时40-47分钟。
酶消化法(对比方法)：
1)无菌条件下，获取抽脂术所得脂肪组织。将脂肪组织用磷酸缓冲盐溶液或生理盐水冲洗后，分装于离心管中。
2)按照1：1的比例加入2％的胶原酶，放入37℃恒温摇床以80-150转/分钟的摇速消化60-90分钟，直至消化成均匀混悬液状态。
3)将消化好的混悬液以1500转/分钟的速度离心5分钟，弃上层脂肪细胞和中间的液体后，留取底层的脂肪干细胞团。
4)向装有脂肪干细胞团的离心管中加入10ml磷酸缓冲盐溶液或生理盐水，反复吹打重悬细胞，使之成为均匀的单细胞悬液，充分洗涤，再以1500转/分钟的速度离心5分钟，弃去上层液体，保留底部脂肪干细胞团；再重复本洗涤步骤2次。
5)充分洗涤后，加入适量生理盐水，反复吹打细胞，使之成为脂肪干细胞单细胞悬液。
酶消化法总耗时约77-110分钟，耗时显著长于超声结合酶消化法(图1)。
实施例2活细胞产量比较
采用台盼蓝染色方法，统计实施例1中的两种分离方法每毫升脂肪组织活细胞产量，可见本申请的方法细胞产量显著高于酶消化法(图2)。
实施例3增殖速率比较
取两种方法获得的脂肪干细胞，调整细胞密度，使细胞浓度为5×104/ml。将混匀的细胞悬液接种至96孔板，每孔200μl，每组设置三副孔。同时设置培养基阴性对照和细胞阳性对照。放入孵箱培养24h，待细胞贴壁后，吸弃上清，PBS轻轻冲洗一遍，吸掉上清，加入DMEM培养基CCK-8溶液，避光孵育4h，酶标仪检测OD450nm的光密度值。以未加细胞的培养基孔为基准进行调零。
根据检测的OD450nm值描绘生长曲线，比较两种分离方法的增殖速率，结果如图3所示，可见超声结合酶消化法具有较好的增殖速率。
实施例4三向分化能力比较
三向分化能力分别按照以下步骤实施。
成脂分化
1)将脂肪干细胞于37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用0.25％Trypsin-0.04％EDTA进行消化。
2)将消化下来的脂肪干细胞按照2×104cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2mL完全培养基，将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。每隔3天换液，直到细胞融合度达到100％
3)小心地将间质干细胞完全培养基吸走，使用成脂诱导分化培养基诱导，诱导21天后进行油红O染色，于倒置显微镜下观察细胞成脂状况。
成骨分化
1)将脂肪干细胞于37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用0.25％Trypsin-0.04％EDTA进行消化。
2)将消化下来的脂肪干细胞按照2×104cells/cm2的细胞密度接种在0.1％明胶包被的六孔板中，每孔加入2mL完全培养基，将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内完全培养基吸走，使用成骨诱导分化培养基诱导。
3)诱导3周后，对细胞进行茜素红染色，于倒置显微镜下观察细胞的成骨情况。
成软骨分化
1)进行成软骨诱导分化实验之前，需要对消化后的脂肪干细胞进行计数，将3-4×105个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4min。
2)吸去上清。加入0.5mL预混液(含地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸)，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗脂肪间质干细胞，室温下150g离心5min。重复清洗2次。
3)将细胞用完全培养基重悬，室温下150g离心5min。
4)拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
5)培养24小时后，轻轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。使用成软骨诱导分化培养基诱导。
6)持续诱导21天后，对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片，最后进行阿利辛蓝染色。于正置显微镜下观察细胞的成软骨情况。
结果如图4所示，两种方法中超声结合酶消化法在分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞方面具有良好的三向分化能力。
实施例5细胞形态学比较
将用两种方法分离的脂肪干细胞分别于37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用0.25％Trypsin-0.04％EDTA进行消化、传代。经传代3次后，观察两种方法分离的细胞形态。
结果如图5所示，超声结合酶消化法分离获得的细胞经过3次传代后，具有良好的细胞形态。
对比两种方法后可见，本发明在缩短时间、提高产量、提高安全性的前提下，其功能学也具有良好的表现。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种脂肪干细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括将脂肪组织与质量体积比为0.05～0.3％的胶原酶混合后，再进行超声处理。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述脂肪组织选自动物脂肪组织或人脂肪组织。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述胶原酶选自单一类型的胶原酶或混合型的胶原酶。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述单一类型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的任一种；所述混合型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的几种类型的组合。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述脂肪组织与胶原酶的体积比为1:0.8～1:2.0。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述超声处理的功率选自50～200W。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述超声处理的时间为30～150秒。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述分离方法还包括以下步骤：
1)将超声处理后的混合液置于摇床中继续消化，至消化成均匀混悬液；
2)将消化后获得的混悬液离心，弃上层脂肪细胞和中间的液体，保留底层的脂肪干细胞团；
3)用磷酸缓冲盐溶液或生理盐水洗涤脂肪干细胞团，洗涤后重悬即获得脂肪干细胞单细胞悬液。
9.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，步骤1)中，所述摇床的温度为35～37℃，继续消化时间为20～30分钟。
10.权利要求1-9任一所述的分离方法获得的脂肪干细胞在制备治疗促进急慢性创面愈合、治疗皮肤老化、促进皮肤再生、治疗关节退行性变或血管病变产品中的用途。
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