CN112080464B

CN112080464B - 一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法

Info

Publication number: CN112080464B
Application number: CN202010976166.2A
Authority: CN
Inventors: 王国栋; 张树润; 李欣懿
Original assignee: Beijing Zhongke Kunpeng Biotechnology Co ltd; Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Beijing Zhongke Kunpeng Biotechnology Co ltd; Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN112080464A

Abstract

本发明提供了一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法，所述培养基包含以下浓度的组分：10～20v/v％FBS、0.8～1.2mM丙酮酸钠、0.08～0.15mM甘氨酸、0.08～0.15mM L‑丙氨酸、0.08～0.15mM L‑天冬酰胺、0.08～0.15mM L‑天冬氨酸、0.08～0.15mM L‑谷氨酸、0.08～0.15mM L‑脯氨酸、0.08～0.15mM L‑丝氨酸、2～6mM谷氨酰胺。所述方法包括以下步骤：(1)采集新生犬脐带；(2)将步骤(1)获得的脐带进行清洗，剔除脐带动脉及静脉，剪碎；(3)使用消化液进行消化，获得脐带间充质干细胞；(4)使用上述培养基对步骤(3)获得的脐带间充质干细胞进行培养。上述培养方法可获得增殖能力和定向分化能力强的犬间充质干细胞，具有材料易得、操作简单和获得的间充质干细胞纯度高等优点。

Description

一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞家族的重要成员，存在于骨髓、脐带、脂肪、胎盘等多种组织中。MSCs具有高度增殖潜力和多向分化能力，在特定条件下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。MSCs来源广、分离培养操作简单、可以大量培养扩增，是干细胞治疗的理想种子细胞，具有广阔的临床应用前景。

脐带来源的间充干细胞材料易得，不会对动物造成伤害，避免了伦理道德争议。而犬在人们生活中扮演着多重角色，不仅是比较受欢迎的宠物，也可训练成为导盲犬等工作犬，还是重要的临床药物试验的动物模型。目前，犬类上常用的MSCs主要来源于骨髓和脂肪组织，但是通过这两种来源获取干细胞对动物会造成不同程度的伤害，而脐带虽然是动物生产时产生的废弃物，但也是MSCs的来源之一，因此脐带，以犬类脐带为材料制备脐带来源的MSCs将是以后理想的替代物。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法，所述培养基和方法培养获得的间充质干细胞具有增殖能力强的优点，可定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，且操作简单。

具体技术方案为：

一种间充质干细胞培养基，所述培养基包含以下浓度的组分：10～20v/v％FBS、0.8～1.2mM丙酮酸钠、0.08～0.15mM甘氨酸、0.08～0.15mM L-丙氨酸、0.08～0.15mM L-天冬酰胺、0.08～0.15mM L-天冬氨酸、0.08～0.15mM L-谷氨酸、0.08～0.15mM L-脯氨酸、0.08～0.15mM L-丝氨酸、2～6mM谷氨酰胺。

在其中一些实施例中，所述培养基包含以下浓度的组分：10～15v/v％FBS、0.9～1mM丙酮酸钠、0.1～0.12mM甘氨酸、0.1～0.12mM L-丙氨酸、0.1～0.12mM L-天冬酰胺、0.1～0.12mM L-天冬氨酸、0.1～0.12mM L-谷氨酸、0.1～0.12mM L-脯氨酸、0.1～0.12mM L-丝氨酸、2～4mM谷氨酰胺。

在其中一些实施例中，所述培养基包含以下浓度的组分：10v/v％FBS、1mM丙酮酸钠、0.1mM甘氨酸、0.1mM L-丙氨酸、0.1mM L-天冬酰胺、0.1mM L-天冬氨酸、0.1mM L-谷氨酸、0.1mM L-脯氨酸、0.1mM L-丝氨酸、2mM谷氨酰胺。

在其中一些实施例中，所述培养基中还含有抗生素。

在其中一些实施例中，所述培养基的溶剂为低糖DEME培养基。

所述低糖DEME培养基是指葡萄糖浓度为1000mg/L的DEME培养基。

本发明还提供了上述培养基在培养间充质干细胞中的用途。

本发明还提供了一种间充质干细胞的培养方法。

具体技术方案为：

一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)采集新生犬脐带；

(2)将步骤(1)获得的脐带进行清洗，剔除脐带动脉及静脉，剪碎；

(3)使用消化液进行消化，获得脐带间充质干细胞；

(4)使用上述培养基对步骤(3)获得的脐带间充质干细胞进行培养。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：(0～2)：(0～2)混合均匀。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：(0.5～1)：(0.5～1)混合均匀。

在其中一些实施例中，优选所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：1：1混合均匀。该消化液具有消化效果更好和对细胞的损伤更小的优点，可获取大量增殖能力较强的间充质干细胞。

在其中一些实施例中，所述消化液的反应条件为37±1℃消化25～35min。

在其中一些实施例中，优选所述消化液的反应条件为37±1℃消化30min。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)将采集到的新生犬脐带置于犬脐带保存液中；所述犬脐带保存液为含为抗生素的低糖DMEM培养基。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种非常适用于原代分离培养犬类脐带来源的间充质干细胞的方法，所述方法先使用优化的消化液对经过前处理的新生犬脐带进行消化，获得犬脐带来源的间充质干细胞，再使用含合适细胞生长添加剂的培养液进行培养，可获得增殖能力和定向分化能力强的间充质干细胞。所述消化液具有消化效果好和对细胞的损伤较小的优点，可获取大量增殖能力较强的间充质干细胞；所述培养液添加了适合犬类脐带来源的间充质干细胞生长的多种细胞生长添加剂，各细胞生长添加剂之间相互配合，可有效提升间充质干细胞的细胞活力和定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。此外，本发明方法还具有材料易得、操作简单和获得的间充质干细胞纯度高等优点。

附图说明

图1为实施例2实验组中培养获得的间充质干细胞的形态鉴定结果图。

图2为实施例2实验组中培养获得的间充质干细胞的生长曲线图。

图3为实施例2实验组和对照组中培养获得的间充质干细胞的细胞活力检测结果图。

图4为实施例2实验组中培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定结果图。

图5为实施例2实验组和对照组中培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定比较结果图。

图6为实施例2实验组培养获得的间充质干细胞诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的检测结果图。

图7为实施例8中实验组1～5培养获得的间充质干细胞的细胞活力检测结果图。

图8为实施例8中实验组1～5培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定结果图(CD90和CD105)。

图9为实施例8中实验组1～5培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定结果图(CD44和CD34)。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

以下实施例中使用的试剂来源：

低糖DMEM培养基、胎牛血清、双抗(含5000U/ml青霉素和5000U/ml链霉素)、丙酮酸钠(浓度为100mM)、非必须氨基酸(包含甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸，每种氨基酸的浓度是10mM)、谷氨酰胺(浓度为200mM)、0.25w/v％胰酶、0.4％台盼蓝溶液、脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基购于gibco公司；

胶原酶IV、透明质酸酶、DMSO购于sigma公司；

CCK-8试剂购于Dojindo公司；

4％多聚甲醛、细胞免疫荧光通透液、细胞免疫荧光封闭液、DAPI购于碧云天生物技术公司；

CD29、CD44、CD90、CD105、CD34购于abcam公司；

FITC、Cy3购于Abclonal公司；

脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基、脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基购于赛业生物公司；

细胞专用油红O染色液、茜素红染色液、阿利新蓝染色液购于索莱宝公司。

实施例1

本实施例一种间充质干细胞培养基，所述培养基包含以下浓度的组分：10v/v％FBS、1mM丙酮酸钠、0.1mM甘氨酸、0.1mM L-丙氨酸、0.1mM L-天冬酰胺、0.1mM L-天冬氨酸、0.1mM L-谷氨酸、0.1mM L-脯氨酸、0.1mM L-丝氨酸、2mM谷氨酰胺、1v/v％双抗；所述培养基的溶剂为低糖DEME培养基。

上述培养基配置方法如下(以配置100ml培养基为例)：取86ml低糖DMEM培养基、10ml胎牛血清、1ml 100mM丙酮酸钠、1ml非必需氨基酸、1ml 200mM谷氨酰胺、1ml双抗，混合均匀，即得所述培养基。

实施例2

本实施例一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)采集新生犬脐带：幼犬出生后立即剪下一段脐带，于75％酒精中浸泡5s，再于含2％双抗的1×PBS中清洗3次，放入保存液(含2v/v％双抗的低糖DMEM培养基)中置于冰盒中带回，在6h内分离间充质干细胞；

(2)在无菌操作台内将步骤(1)获得的脐带从保存液中取出，含2v/v％双抗的1×PBS中清洗1次，剔除脐带动脉及静脉，用无菌剪剪碎；

(3)使用消化液进行消化，获得脐带间充质干细胞：剪碎的脐带组织置于50ml离心管内，加入约为剪碎的脐带组织体积3倍的消化液，37℃水浴消化30min，期间多次晃动离心管，使脐带组织块充分消化；然后加入实施例1所述的培养基终止消化，依次过100和200目细胞筛，悬液于1000rpm/min条件下离心5min，弃上清，向细胞沉淀中加入1ml实施例1所述的培养基重悬，获得脐带间充质干细胞；所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：1：1混合均匀；

(4)使用实施例1所述的培养基对步骤(3)获得的脐带间充质干细胞进行培养(简称实验组)，同时设置对照组，所述对照组使用的培养基除了不添加丙酮酸钠、非必需氨基酸和谷氨酰胺，其他均与实施例1相同：将步骤(3)获得的脐带间充质干细胞悬液接种至T25培养瓶中，于5％CO₂浓度、37℃培养箱内培养；此后，每隔48h更换新的培养液，直至细胞汇合度为80-90％后进行传代。

上述培养获得的间充质干细胞可进行冻存，在需要的时候进行复苏培养：

冻存：步骤(4)培养获得的间充质干细胞消化离心后加入含10v/v％DMSO和90v/v％FBS的细胞冻存液，混匀后置于冻存盒内，-80℃进行梯度降温冻存，过夜后于液氮中长期冻存。

复苏：将液氮中冻存的间充质干细胞取出，快速于37℃水浴快速解冻，离心重悬后接种于T25培养瓶，然后置于培养箱内进行培养。

上述消化液配置方法如下：

(1)配置0.2w/v％胶原酶IV：称取0.06g胶原酶IV，于30ml低糖DMEM中溶解，0.22uM滤器过滤，-20℃保存，备用；

(2)配置0.1w/v％透明质酸酶：称取0.03g透明质酸酶，于30ml低糖DMEM中溶解，0.22uM滤器过滤，-20℃保存，备用；

(3)将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按照体积比为2：1：1混合均匀，即得所述消化液。

上述细胞冻存液配置方法如下：取100ul DMSO和900ul胎牛血清，混合均匀。

实施例3

本实施例对实施例2中实验组培养获得的间充质干细胞的形态进行鉴定。

1、实验方法

取实施例2实验组中第0代(F0)、第1代(F1)及第3代(F3)犬间充质干细胞，待细胞细胞密度汇合至80％左右，于倒置显微镜下观察拍照。

2、实验结果

结果如图1所示，实验组培养获得的细胞呈长梭形样或成纤维样贴壁生长，并有圆形样细胞悬浮在上面，细胞生长状态良好，折光性强，符合犬间充质干细胞形态。

实施例4

本实施例对实施例2实验组培养获得的间充质干细胞的生长曲线进行绘制。

1、实验方法

(1)取实施例2实验组中第1代(F1)、第3代(F3)及第5代(F5)犬间充质干细胞，待细胞密度汇合至80％左右，1×PBS清洗2次，0.25w/v％胰酶消化3min，使用实施例1所述培养基终止消化，1000rpm离心3min，弃上清，加入1ml实施例1所述培养基重悬细胞；

(2)从细胞悬液中取100ul，与100ul 0.4％台盼蓝溶液混合，计数板计数；

(3)以每孔0.5×10⁴/ml细胞布板24孔培养板，每孔1ml，置于培养箱中培养；

(4)每隔24h抽取3孔细胞，胰酶消化成细胞悬液后计数，每孔计三次，取平均值；

(5)连续计数8天，以时间为横坐标，细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线图。

2、实验结果

绘制得到的细胞生长曲线图如图2所示，由图2可知，获得的犬间充质干细胞生长基本呈S型生长，经历了缓慢生长期、对数生长期、平台期，细胞活力比较强，符合细胞基本生物学特征。

实施例5

本实施例对实施例2实验组和对照组培养获得的间充质干细胞的细胞活力进行测定。

1、实验方法

(1)取实施例2实验组和相应对照组中第1代犬间充质干细胞，待细胞密度汇合至80％左右，1×PBS清洗2次，0.25w/v％胰酶消化3min，使用实施例1所述培养基终止消化，1000rpm离心3min，弃上清，加入1ml实施例1所述培养基重悬细胞；

(3)以每孔3000细胞布板96孔培养板，每孔100ul，置于培养箱中培养48h，每个实验组设置4个重复孔；

(4)向每孔添加10ul CCK-8试剂，继续培养4h；

(5)酶标仪测定450nm处的OD值，绘制细胞活力图。

2、实验结果

绘制得到的细胞活力图如图3所示，实验组所述方法培养获得的犬间充质干细胞的细胞活力明显高于对照组，说明本发明优化的培养液能有效提高培养过程中犬间充质干细胞的细胞活力。

实施例6

本实施例对实施例2实验组培养获得的间充质干细胞力进行免疫荧光鉴定。

1、实验方法

(1)取实施例2实验组中生长状态比较好的第1代犬间充质干细胞，接种于48孔板培养板中培养24h；

(2)弃培养液，1×PBS清洗3次，4％多聚甲醛室温固定30min；

(3)弃固定液，1×PBS清洗3次，细胞免疫荧光通透液(0.1％100×Triton)室温孵育20min；

(4)弃通透液，1×PBS清洗3次，加细胞免疫荧光封闭液，37℃封闭孵育1h；

(5)弃封闭液，1×PBS清洗3次，分别加CD29、CD44、CD90、CD105、CD34表面标记蛋白的一抗(稀释比例1：200)，4℃避光孵育过夜；

(6)回收一抗，1×PBS清洗3次，分别加入对应一抗的FITC及Cy3二抗(稀释比例1：500)，室温避光孵育1h；

(7)回收二抗，1×PBS清洗3次，加入DAPI溶液复染，37℃避光孵育30min；

(8)回收DAPI，1×PBS清洗3次，加入抗荧光淬灭剂，于高内涵分析仪观察染色结果并拍照。

2、实验结果

结果如图4所示，免疫荧光结果显示实验组中培养获得的犬脐带间充质干细胞阳性表达CD29、CD90、CD105，弱阳性表达CD44，阴性表达CD34，符合间充质干细胞表面标记物的表达特性。

本实施例还对实施例2实验组和对照组培养获得的间充质干细胞力进行免疫荧光鉴定比较。

1、实验方法：同上。

2、实验结果：如图5所示，实验组与对照组中获得的犬间充质干细胞，均阳性表达CD90、CD105，弱阳性表达CD44，阴性表达CD34，说明本发明培养液中使用的细胞生长添加剂对犬间充质干细胞的特异性没有显著影响。

实施例7

本实施例对实施例2实验组培养获得的间充质干细胞诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力进行检测。

1、实验方法

A、成脂诱导分化及油红O染色：

(1)取实施例2实验组中第3代犬间充质干细胞，于培养箱中培养直至细胞密度汇合至80％左右，0.25w/v％胰酶消化；

(2)消化下来的细胞以2×10⁴/ml布板于0.1％明胶包被的6孔培养板中，每孔加2ml实施例1所述培养基，于培养箱中培养，每隔48h换液，直至细胞密度汇合至100％；将细胞分为两组：诱导组1(使用脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基继续培养)和对照组1(使用实施例1所述培养基继续培养)；

(3)弃两组细胞的完全培养基，诱导组1加2ml脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液；对照组1加入实施例1所述培养基继续培养；

(4)对照组1细胞长满后即收集细胞进行油红O染色，染色方法同下步骤(9)～(13)；

(5)诱导组1诱导3天，弃A液，加2ml脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液；

(6)诱导组1诱导24h后，弃B液，换回A液进行诱导；

(7)诱导组1的A液和B液交替诱导4次(16天)，继续用B液维持培养5天，B液维持期间，每隔2天换液；

(8)成脂诱导分化结束后，弃去诱导分化液，收集细胞；

(9)1×PBS清洗2次，加ORO Fixative固定液固定30min；

(10)弃固定液，蒸馏水清洗2次，加60％异丙醇浸洗5min；

(11)弃异丙醇，加1ml油红O染料工作液浸染20min(油红O贮存液：蒸馏水＝3：2)；

(12)弃染液，蒸馏水清洗3-5次，直至无多余染液；

(13)加蒸馏水覆盖细胞，显微镜下观察拍照。

B、成骨诱导分化及茜素红染色：

(2)消化下来的细胞以2×10⁴/ml布板于0.1％明胶包被的6孔培养板中，每孔加2ml实施例1所述培养基，于培养箱中培养，每隔48h换液，直至细胞密度汇合至60％；将细胞分为两组：诱导组2(使用脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基继续培养)和对照组2(使用实施例1所述培养基继续培养)；

(3)弃两组细胞的完全培养基，诱导组2加2ml脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基；对照组2加入实施例1所述培养基继续培养；

(4)对照组2细胞长满后即收集细胞进行茜素红染色，染色方法同下步骤(7)～(9)；

(5)诱导组2每隔2天更换新鲜成骨诱导分化培养液，诱导3周；

(6)成骨诱导分化结束后，弃去诱导分化液，收集细胞；

(7)1×PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定30min；

(8)弃固定液，1×PBS清洗2次，加1ml茜素红染液浸染20min；

(9)弃染液，1×PBS清洗2次，加1×PBS覆盖细胞，显微镜下观察拍照。

C、成软骨诱导分化及阿利新蓝染色

(2)消化下来的细胞以2×10⁴/ml布板于0.1％明胶包被的6孔培养板中，每孔加50ul实施例1所述培养基，于培养箱中培养2h；将细胞分为两组：诱导组3(使用脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基继续培养)和对照组3(使用实施例1所述培养基继续培养)；

(3)待细胞贴壁后诱导组3加2ml脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基；对照组3加入实施例1所述培养基继续培养；

(4)对照组3细胞长满后即收集细胞进行阿利新蓝染色，染色方法同下步骤(7)～(9)；

(5)诱导组3每隔2天更换新鲜成软骨诱导分化培养液，诱导3周；

(6)成软骨诱导分化结束后，弃去诱导分化液，收集细胞；

(7)1×PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定30min；

(8)弃固定液，1×PBS清洗2次，加1ml阿利新蓝染液浸染30min；

2、实验结果

结果见图6，油红O染色结果显示，诱导组1诱导形成的脂滴经油红O染色后呈红色，说明实施例2中实验组获得的间充质干细胞可被成功诱导分化为脂肪细胞；茜素红染色结果显示，诱导组2诱导为成骨细胞后形成的钙结节经茜素红染色后呈紫红色，说明实施例2中实验组获得的间充质干细胞可被成功诱导分化为成骨细胞；阿利新蓝染色结果显示，诱导组3诱导成为成软骨细胞后软骨组织中的酸性粘多糖经阿利新蓝染色后呈蓝色，说明实施例2中实验组获得的间充质干细胞可被成功诱导分化为成软骨细胞。上述结果表明，本发明方法培养获得的间充质干细胞可成功被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

本实施例中试剂配制如下：

成脂诱导分化培养基A液：43.75ml脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基+5ml脐带间充质干细胞成脂诱导分化专用胎牛血清+500ul双抗+500ul谷氨酰胺+100ul胰岛素+50ul 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+50ul罗格列酮+50ul地塞米松；

成脂诱导分化培养基B液：43.9ml脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液基础培养基+5ml脐带间充质干细胞成脂诱导分化专用胎牛血清+500ul双抗+500ul谷氨酰胺+100ul胰岛素。

成骨诱导分化培养液：43.35ml脐带间充质干细胞成骨诱导分化基础培养基+5ml脐带间充质干细胞成骨诱导分化专用胎牛血清+500ul双抗+500ul谷氨酰胺+100ul抗坏血酸+500ulβ-甘油磷酸钠+5ul地塞米松。

成骨诱导分化培养液：44.5ml脐带间充质干细胞成软骨诱导分化基础培养基+5ml脐带间充质干细胞成软骨诱导分化专用液+500ul双抗。

实施例8

本实施例对比不同消化液对犬脐带的消化效果。设置实验组1～5，各实验组分别使用不同的消化液(具体如表1所示)对剪碎的犬脐带组织进行消化，然后对获得的间充质干细胞进行培养。

表1实验组1～5使用的消化液组成

本实施例对犬脐带间充质干细胞的分离培养方法除了步骤(3)中使用的消化液不同外，其他均与实施例2相同。

对实验组1～5培养获得的间充质干细胞进行细胞活力检测(检测方法同实施例5)和免疫荧光鉴定(鉴定方法同实施例6)，具体结果如图7、图8和图9所示。

由图7可知，实验组1分离培养获得的间充质干细胞的细胞活力明显高于实验组2～5，说明实验组1中使用的消化液(制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶和0.1w/v％透明质酸酶按照体积比为2：1：1混合均匀)进行消化对细胞的损伤更小，获得的细胞的增殖能力较强。

由图8和图9可知，实验组1分离培养获得的犬间充质干细胞相较于实验组2～5，间充质干细胞特异性标记物的表达具有部分差异：3种酶按照体积比为2：1：1(实验组1)混合制备得到的消化液处理获得的间充质干细胞CD90的阳性表达率稍强于3种酶体积比为2：0：1(实验组3)及2：2：2(实验组5)组；3种酶按照体积比为2：1：1(实验组1)混合制备得到的消化液处理获得的间充质干细胞CD105的阳性表达率稍强于3种酶体积比为2：0：0(实验组4)及2：2：2(实验组5)组；3种酶按照体积比为2：1：1(实验组1)混合制备得到的消化液处理获得的间充质干细胞CD44的阳性表达率稍强于比例为2：2：2(实验组5)组；3种酶按照体积比为2：1：1(实验组1)混合制备得到的消化液处理获得的间充质干细胞不表达CD34，而3种酶按照体积比为2：1：0(实验组2)、2：0：1(实验组3)组及2：2：2(实验组5)组弱阳性表达CD34。上述结果说明实验组1分离培养获得的细胞更符合间充质干细胞的特异性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集新生犬脐带；

(3)使用消化液进行消化，获得脐带间充质干细胞；

(4)使用培养基对步骤(3)获得的脐带间充质干细胞进行培养，

所述培养基包含以下浓度的组分：10～20v/v％FBS、0.8～1.2mM丙酮酸钠、0.08～0.15mM甘氨酸、0.08～0.15mM L-丙氨酸、0.08～0.15mM L-天冬酰胺、0.08～0.15mM L-天冬氨酸、0.08～0.15mM L-谷氨酸、0.08～0.15mM L-脯氨酸、0.08～0.15mM L-丝氨酸、2～6mM谷氨酰胺；

步骤(3)所述消化液的制备方法如下：0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：(0.5～1)：(0.5～1)混合均匀。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基包含以下浓度的组分：10～15v/v％FBS、0.9～1mM丙酮酸钠、0.1～0.12mM甘氨酸、0.1～0.12mM L-丙氨酸、0.1～0.12mM L-天冬酰胺、0.1～0.12mM L-天冬氨酸、0.1～0.12mM L-谷氨酸、0.1～0.12mM L-脯氨酸、0.1～0.12mM L-丝氨酸、2～4mM谷氨酰胺。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基中还含有抗生素。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基的溶剂为低糖DEME培养基。

5.根据权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：1：1混合均匀。

6.根据权利要求1～5任一项所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述消化液的反应条件为37±1℃消化25～35min。

7.根据权利要求6所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述消化液的反应条件为37±1℃消化30min。