CN109082408A

CN109082408A - 一种临床用脂肪干细胞的分离方法

Info

Publication number: CN109082408A
Application number: CN201810858191.3A
Authority: CN
Inventors: 罗盛康; 李方伟; 汪海滨; 陈春霖; 方锦平
Original assignee: Guangdong No 2 Peoples Hospital
Current assignee: Guangdong No 2 Peoples Hospital
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2018-12-25

Abstract

本发明公开了一种用于破碎脂肪组织的装置，所述装置包括两个不少于两个注射器和连接管，注射器通过乳头与连接管联通，连接管具有不少于一个弯折结构，连接管最小内径3mm。利用本发明提供的装置将脂肪组织破碎后，可以大幅度的缩减消化脂肪干细胞的时间和胶原酶的用量，仅需要20分钟就可以达到很好的消化效果，同时获得的干细胞的数量是传统方法的4倍以上；同时多次离心有效的去除了消化用的胶原酶，保证了分离到的脂肪干细胞的安全性，有很大的推广应用的价值和潜力。

Description

一种临床用脂肪干细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种临床用脂肪干细胞的分离方法。

背景技术

脂肪间充质干细胞起源于中胚层，具有成脂、成骨、成软骨、神经元等多能分化潜能，较骨髓间充质干细胞而言，在体内具有来源充足、取材方便、对人体创伤小等优点，在体外具有分离简单、增殖迅速、生物学稳定等特性，引起了众多研究者的兴趣和广泛关注，目前脂肪间充质干细胞已经运用到外胚层和内胚层的组织和器官，如视黄醇色素上皮细胞、肾管状上皮细胞、肝细胞、胰岛样细胞。

虽然，目前脂肪干细胞的制备方法众多，但是，难以统一脂肪干细胞的制备方法，而传统脂肪干细胞制备过程复杂，并且制备中所采用的试剂难以保证其临床安全性，限制其在临床中使用。而传统制备脂肪干细胞需要贴壁培养及提纯，耗时约1月左右，无疑增加患者手术次数，增加患者痛苦及经济负担。为此亟需一种可临床用的脂肪干细胞制备方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于破碎脂肪组织的装置，及其利用该装置的破碎脂肪组织和提取脂肪干细胞的方法。

本发明的第一个目的是提供一种用于破碎脂肪组织的装置。

本发明的第二个目的是提供利用所述装置破碎脂肪组织的方法。

本发明的第三个目的是提供一种分离脂肪干细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种用于破碎脂肪组织的装置，其特征在于，所述装置包括不少于两个注射器和连接管，注射器通过乳头与连接管联通，连接管具有不少于一个弯折结构，连接管最小内径3mm。

优选地，连接管内径3～5mm。

优选地，所述装置包括两个注射器，连接管具有一个弯折结构。

优选地，弯折结构的弯折角度为60～120°。

更优选地，弯折结构的弯折角度为90°。

利用所述装置破碎脂肪组织的方法，在其中一个注射器中放置待破碎脂肪组织，轮流推注或抽拉两个注射器。

优选地，当所述装置中具有一个弯折结构，弯折结构的弯折角度为60～120°时，推注/抽拉速度1～3ml/s，轮流推注或抽拉10～25次。

优选地，弯折结构的弯折角度为90°时，推注/抽拉速度1ml/s，来轮流推注或抽拉10次。

注射器推注并抽拉恢复原位为一次。

一种分离脂肪干细胞的方法，包括以下步骤：

S1. 采集脂肪组织；

S2. 在无菌环境条件下，用含有广谱抗菌药物的晶体液冲洗脂肪组织1～2次，离心，保留上层油脂；

S3. 利用所述方法对步骤S2得到的油脂进行破碎，得到破碎后的脂肪组织；

S4. 将S3破碎后的脂肪组织加入胶原酶溶液，震荡，进行消化，得到消化后的脂肪组织；

S5. 向S4消化后的脂肪组织加入晶体液，离心，保留底部细胞；

S6. 用晶体液重悬S5获得的细胞，得到重悬液，过滤重悬液，得脂肪干细胞。

优选地，晶体液为生理盐水、乳酸钠林格液或醋酸钠林格液中的一种。

更优选地，晶体液为醋酸钠林格液。

优选地，步骤S2中，广谱抗菌药物为庆大霉素。

优选地，步骤S2中，庆大霉素的用量为，以质量计算1～10%。

优选地，步骤S2中，庆大霉素的用量为，以质量计算2%。

最优选地，步骤S2中，用含有2%的庆大霉素的醋酸钠林格液冲洗脂肪组织。

优选地，步骤S4中，胶原酶为I型胶原酶。

优选地，步骤S4中，I型胶原酶的用量为终浓度为0.01～0.1%。

更优选地，步骤S4中，I型胶原酶的用量为终浓度为0.0375%。

优选地，步骤S4中，震荡条件为150～300转/分，15～60 min。

优选地，步骤S4中，震荡条件为200转/分，15～20 min。

优选地，步骤S1中，采集脂肪组织的方法为：抽脂区域均与注射肿胀液，麻醉充分起效后用抽脂针均匀抽吸脂肪。

更优选地，肿胀液的配方为：晶体液中含有400～800mg利多卡因，0.5mg肾上腺素

优选地，步骤S2中，离心的条件为800～1200g，3～5min。

更优选地，步骤S2中，离心的条件为1200g，3min。

优选地，步骤S5中，晶体液用量为脂肪组织的2～4倍体积。

更优选地，步骤S5中，晶体液用量为脂肪组织的2倍体积。

优选地，步骤S5中，离心的条件为1000～1200g，10～15min。

更优选地，步骤S5中，离心的条件为1200g，10min。

优选地，步骤S6中，无菌细胞滤网的规格为100μm孔径，由于脂肪干细胞的直径约为70μm，通过使用孔径为100μm的滤网过滤可以去除其他大粒径的细胞和杂质。

最优选地，包括以下步骤：

S1. 抽脂区域均与注射肿胀液，麻醉充分起效后用抽脂针均匀抽吸脂肪，采集脂肪组织，其中，肿胀液的配方为：醋酸钠林格液500ml，400～800mg利多卡因，0.5mg肾上腺素；

S2. 无菌环境内，用含有2％庆大霉素的醋酸钠林格液冲洗脂肪组织1～2次，1200g，3min离心，弃去除中层液体和底部细胞，保留上层油脂；

S3. 利用权利要求4所述方法对S2得到的油脂进行脂肪组织的破碎，得到破碎后的脂肪组织；

S4. 将S3得到的破碎后的脂肪组织加入I型胶原酶溶液，I型胶原酶终浓度为0.0375%，200转/分，15～20 min震荡，进行消化，得到消化后的脂肪组织；

S5. 向S4得到的消化后的脂肪组织加入2倍体积的醋酸钠林格液，1200g，10min离心，去掉上层脂肪和中层液体，保留底部细胞；

S6. 用醋酸钠林格液重悬S5获得的细胞，得到重悬液，100μm孔径的无菌细胞滤网过滤重悬液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

利用本发明提供的装置将脂肪组织破碎后，可以大幅度的缩减消化脂肪干细胞的时间和胶原酶的用量，仅需要20分钟就可以达到很好的消化效果，同时获得的干细胞的数量是传统方法的4倍以上；同时多次离心有效的去除了消化用的胶原酶，保证了分离到的脂肪干细胞的安全性，有很大的推广应用的价值和潜力。

附图说明

图1为实施例1的结构示意图。

图2为细胞生长曲线。

图3为细胞行脂肪干细胞分化鉴定；A：成脂分化（油红O染色）；B：成骨分化（茜素红染色）；C：成软骨分化（甲苯胺蓝染色）。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 一种用于破碎脂肪组织的装置

如附图1所示，一种破碎脂肪组织的装置，包括两个注射器和连接管，注射器通过乳头与连接管联通，连接管有一个弯折结构，连接管最小内径为5mm。弯折结构的弯折角度为90°。其中两个注射器均为10ml注射器。

实施例2 一种破碎脂肪组织的方法

使用实施例1中的装置进行破碎脂肪，其中一个注射器中放置5～8ml待破碎脂肪组织，两个注射器通过连接管配合推注，推注/抽拉速度1ml/s，轮流推注或抽拉10次。

实施例3 一种分离脂肪干细胞的方法

一、实验方法

1、本发明分离脂肪干细胞的方法，具体操作如下：

于抽脂区域均匀注射肿胀液（醋酸钠林格注射液500ml，400～800mg利多卡因，0.5mg肾上腺素），等待5分钟，麻醉充分起效后用抽脂针（内径3mm）均匀抽吸脂肪。

（1）清洗脂肪：在细超净工作台内，用含有2％庆大霉素的醋酸钠林格注射液冲洗脂肪1～2次，离心后（1200g，3min）去除下层液体和底部的红细胞（注意保留上层油脂）；

（2）脂肪破碎：使用实施例1中的装置按照实施例2中的方法进行破碎脂肪，即，将清洗后的脂肪分装至其中一个10ml注射器（每注射器含有脂肪5～8ml），两个注射器来回推注或抽拉，推注/抽拉速度1ml/s，来回推注10次；

（3）消化：将破碎后的脂肪分装至50ml离心管，加入等体积的0.075%Ⅰ型胶原酶，封口膜封闭后放置在空气浴摇床内消化15-20 min（转速：200转/分）；

（4）稀释法终止消化：往消化后的离心管内加入2倍体积的醋酸钠林格注射液。

（5）收集细胞：将上述液体置入离心机离心（1200g，10min），小心取出离心管，去掉上层脂肪和中层液体，保留底部细胞；

（6）清洗：用醋酸钠林格注射液重悬细胞，无菌细胞滤网过滤去除大粒径的细胞及杂质（孔径：100μm），视情况可再次重悬后过滤1～2次。

上述操作于无菌环境下进行，全程保持无菌观念。

2、另外，以一般方法，提取脂肪干细胞作对对照：

（1）对照1：取掉以上方法的步骤（2）脂肪破碎。

（2）对照2：将步骤（2）脂肪破碎的方法替换为超声波破碎，超声条件100W，间隔5s，5min。

3、将上述制备的脂肪干细胞稀释至4×10⁴/ml，均匀铺在培养皿，加入适量脂肪间充质干细胞完全培养基，置入培养箱（5％CO₂，37℃）内培养，取P3代细胞行CCK-8法检测细胞增殖。

二、实验结果

本法与传统制备方法细胞量对比，本法含量为传统方法的4倍以上，细胞活性无统计学差异（见表1）。

表1：

	脂肪/ml	样本量	细胞量	活性/%
					本法	5	10	4.85±0.83×10<sup>7</sup>	93.3±1.12
对照1	5	10	1.09±0.22×10<sup>7</sup>	92.6±2.01
					对照2	5	10	1.80±1.03×10<sup>4</sup>	90.1±1.08
<i>P</i>			0.004	0.1

样本量：即数据来自10次实验结果，并非单次结果。

以P3代细胞检测细胞增殖，以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，细胞生长呈“S”形生长（图2），在1~2天处于潜伏期，2~5天处于对数期，5～6天处于平台期。同时，取P3细胞行脂肪干细胞分化鉴定，结果显示可以成脂、成骨、成软骨分化（图3）。

Claims

1.一种用于破碎脂肪组织的装置，其特征在于，所述装置包括不少于两个注射器和连接管，注射器通过乳头与连接管联通，连接管具有不少于一个弯折结构，连接管最小内径3mm。

2.根据权利要求1所述装置，其特征在于，所述装置包括两个注射器，连接管具有一个弯折结构，弯折结构的弯折角度为60～120°。

3.根据权利要求2所述装置，其特征在于，弯折结构的弯折角度为90°。

4.利用权利要求1所述装置破碎脂肪组织的方法，其特征在于，在其中一个注射器中加入待破碎脂肪组织，轮流推注或抽拉两个注射器。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，当权利要求1所述装置中具有一个弯折结构，弯折结构的弯折角度为60～120°时，推注/抽拉速度1～3ml/s，轮流推注或抽拉10～25次。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，弯折结构的弯折角度为90°时，推注/抽拉速度1ml/s，轮流推注或抽拉10次。

7.一种分离脂肪干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 采集脂肪组织；

S3. 利用权利要求4所述方法对步骤S2得到的油脂进行破碎；

S4. 将S3破碎后的脂肪组织加入胶原酶，震荡，进行消化，得到消化后的脂肪组织；

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述晶体液为生理盐水、乳酸钠林格液或醋酸钠林格液中的一种。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，晶体液为醋酸钠林格液。

10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤S4中震荡条件为150～300转/分，15～60 min。