CN108904783A - 一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，利用自体脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞，并与一定比例的磁性纳米微球、红景天苷、绞股蓝提取物、泼尼松、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物、冬凌草提取物、混合支架等组成自体脂肪干细胞药物，再将自体脂肪干细胞药物通过注射液的形式注射到膝关节病灶处。总之，本发明所制备的自体脂肪干细胞药物药效好，疗效高，能够有效的修复关节软骨、恢复关节结构和功能。

Description

一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，具体是涉及一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物。
背景技术
根据调查研究的显示，目前全世界的骨关节患者已经超过了4亿人，在我们亚洲地区，相当于每六个人当中就会有一个人在某阶段患上骨关节炎疾病，一般来说，骨关节病常常发作与中老年人身上，由于老年性退化引发较多，并且女性人数常多于男性人数。在我国，骨关节患者达到了一亿以上，骨关节患者占我国总人口的近10％之多，而骨关节炎中最为常见的便是膝关节炎，根据相关数据显示，膝关节炎致残率全球第二，且发病率会随着年龄的增长而变高，可见，膝关节炎已经是伴随和困扰现代人的一个常见病。
一般膝关节软骨在青春期时期软骨厚度为2.5公分，随着年龄的慢慢的增长和使用劳损，软骨厚度会变得越来越薄，一般在55岁时软骨厚度只剩下仅仅0.5公分，而且如果膝关节受损或者长期受压的话，软骨厚度可能更薄，严重时还可能会出现骨刺或破裂。
常规的治疗为通过NSAIDs类药物、润滑剂及类固醇激素关节腔注射、软骨保护剂为主的治疗方法，但是这些治疗方法的疗效较为有限，不能够有效的阻止疾病的进展，随着干细胞研究的不断发展和普及，越来越多的研究者将干细胞技术扩展至骨关节炎治疗之中，通过干细胞治疗，有效的解决上述的这些问题。但是目前现有技术中所涉及到的膝关节炎干细胞药物治疗方法，仍然存在一些问题，比如在诱导分化过程中，诱导分化效果仍然较差，膝关节干细胞药物疗效仍然不稳定，治疗效果仍然不能达到我们所预期的效果等等。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物。
本发明的技术方案是:一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，所述自体脂肪干细胞药物按照重量百分比计包括：10-18％脂肪干细胞、7-11％磁性纳米微球、8-10％人血白蛋白原液、5-7％红景天苷、0.7-1.2％绞股蓝提取物、0.9-1.8％维生素E、2-7％黄酮醇苷、3-5％泼尼松、1.7-3.4％杜仲提取物、2.3-4.4％苍术提取物、0.6-1.3％生地黄提取物、2.1-3.9％海桐皮提取物、1.1-1.9％冬凌草提取物、2.7-4.9％混合支架、0.6-2.5％葡萄糖酸锌、0.3-0.5％肝素钙、0.7-1.5％乳化剂、0.7-1.5％稳定剂、0.2-0.6％pH调节剂、0.6-2％抗氧化剂，余量为生理盐水。所述红景天苷能够清除自由基，并且促进细胞生长的作用；所述绞股蓝提取液具有防抗癌，防止细胞癌化的作用；所述维生素E具有良好的抗氧化作用；所述黄酮醇苷可以消除细胞产生的自由基；所述泼尼松具有抗炎抑菌的作痛，能够抑制细胞组织增生；所述杜仲提取物可防止肌肉骨骼老化，抗菌的作用；所述苍术提取物治疗筋骨疼痛；所述生地黄提取物具有清热凉血的功效；所述海桐皮提取物具有消肿，治疗关节疼痛的功效；所述冬凌草提取物具有消炎止痛，活血的功效；所述肝素钙具有抗凝血的作用。
进一步地，所述绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物的制备方法为：将绞股蓝、杜仲、苍术、生地黄、海桐皮和冬凌草清洗晒干后分别研磨至粉末，将各粉末与去离子水按照体积比为1:35的比例混合，在83℃温度下浸提2.5h后过滤弃滤渣A得滤液A，再将滤渣A与去离子水按照体积比1:20的比例混合，在100℃温度下浸提1.2h后过滤弃滤渣B得滤液B，将滤液A和滤液B混合再过滤，浓缩至含水量为3-10％，分别得到绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物。
进一步地，所述磁性纳米微球由纳米三氧化二铁、纳米三氧化二钴和纳米陶瓷按照6:2:11的比例混合制成。可以通过为细胞补磁的方式，提高细胞活性，增强药效。
进一步地，所述混合支架由胶原蛋白支架与富血小板纤维凝胶支架按照9:7的比例混合制成。通过该比例的混合支架相对于单一支架对于移植到膝关节关节内的治疗效果更好，疗效更显著。
进一步地，所述自体脂肪干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织25ml，将脂肪组织破碎至直径为3-5mm的脂肪粒块，用清洗液反复冲洗人脂肪组织1-2次，以除去人脂肪组织中的血液；所述清洗液内含有质量百分比为0.1％的木质素磺酸盐和质量百分比为0.7％的亭扎肝素钠；所述木质素磺酸盐和亭扎肝素钠在该配比下可以有效提高清除脂肪组织中的血液效果，清洗次数少，提高清洗效率。
S2：将S1的脂肪粒块置于离心管中，并加入体积比为2:5的0.18％胰蛋白酶和0.24％胶原酶的混合酶液，然后将离心管置于37℃下，以130r/min的离心速率消化1.5h，离心期间每15min间歇5min；离心管内人脂肪粒块与混合酶液的体积比为5:6；可以有效将脂肪干细胞分离出来，提高脂肪干细胞的数量和质量，为后续药物制备做好前提基础。
S3：将脂肪干细胞的细胞悬液置入培养瓶中，后将所述培养瓶放入CO2培养箱中，在37℃恒温下培养4-7天，诱导脂肪间充质干细胞在所述细胞诱导培养液的诱导下，生成软骨细胞；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1800r/min离心5-7min得到上清液A和下层细胞A，将上清液A以2100r/min离心3-5min得到上清液B和下层细胞B，弃上清液B取下层细胞B，将下层细胞B和下层细胞A混合用生理盐水稀释后再以1550r/min离心9-13min，得到软骨细胞与脂肪干细胞的混合细胞；得到的软骨细胞与脂肪干细胞数量多，质量高。
S5：将所述混合细胞用所述人血白蛋白原液进行稀释，将所述磁性纳米微球和红景天苷依次添加到稀释混合细胞溶液，在37℃恒温下通过超声波辅助分散，时间为20-45min，得到药物原液；
S6：将所述绞股蓝提取物、黄酮醇苷、泼尼松、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物分别用生理盐水进行溶解，分别得到绞股蓝提取物溶液、黄酮醇苷溶液、泼尼松溶液、杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液；首先将所述药物原液与绞股蓝提取物溶液进行混合，期间滴加黄酮醇苷溶液并搅拌，得到混合溶液；将杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液混合后，升温至76℃后加入所述泼尼松溶液后搅拌4-7min，冷却至37℃后与所述混合溶液混合，之后依次加入维生素E、葡萄糖酸锌溶液和肝素钙溶液，搅拌均匀并通过超声辅助分散，得到药物混合液；混合效果好，药物混合液的药液性能更加稳定。
S7：在所述药物混合液中加入所述乳化剂、稳定剂、混合支架和抗氧化剂，搅拌均匀，同时在搅拌过程中，加入所述pH调节剂至药物混合液至PH＝7.1-7.3；即得含有自体脂肪干细胞药物的注射液。
更进一步地，所述S3具体步骤为：将1ml含有1×105个脂肪干细胞的细胞悬液加入10ml内置有多个二氧化钛小球的培养瓶中，将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中，约12小时后，轻轻振动培养瓶，使二氧化钛小球在培养瓶发生位移，然后全量更换诱导分化培养基；之后每隔12小时轻轻振动培养瓶一次，每隔1天半量更换一次诱导分化培养基，期间每隔4-6小时使用脉冲电磁场作用培养瓶10-25分钟，所述脉冲电磁场磁场强度1.8mT，感应电场强度5mV，频率70Hz。所述二氧化钛小球可有效促进脂肪干细胞的诱导分化，球形附着面积大，同时脉冲电磁场的配合促进脂肪干细胞的诱导分化，进一步的提高诱导分化的过程，提高诱导分化的软骨细胞的数量和质量。
更进一步地，所述诱导分化培养基为高糖DMEM加入176μg/ml红景天苷提取液，74μg/ml淫羊藿素，14ng/ml TGFβ3，7ng/ml生长因子，120nM地塞米松，21μg/ml复合维生素，9ng/ml小分子活性肽，79μg/ml丙酮酸钠，35μg/ml硫辛酸，所述复合维生素为维生素C、维生素B2和维生素E以质量比为4:1:2组成的。所述红景天苷和淫羊藿素在上述比例可以有效促进诱导分化的过程，所述硫辛酸可以消除加速老化和致病的自由基，所述复合维生素在上述比例中可以为脂肪干细胞又到分化成软骨细胞过程中提供最为合适的维生素需求。
本发明的有益效果是:本发明的通过将自体脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞，并与一定比例的磁性纳米微球、红景天苷、绞股蓝提取物、泼尼松、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物、冬凌草提取物、混合支架等组成自体脂肪干细胞药物，通过注射的方式注射在膝关节病灶处，相对于传统的对于膝关节炎治疗方式，疗效好，治疗快，可控性更高的特点；同时，本发明通过磁性纳米微球提高细胞活性，增强药效，并通过二氧化钛小球和脉冲电磁场的配合促进脂肪干细胞的诱导分化，进一步的提高诱导分化的过程，提高诱导分化的软骨细胞的数量和质量；总之，本发明方法治疗效果快速有效，稳定性高，疗效显著，实用性强。
具体实施方式
实施例1
一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，自体脂肪干细胞药物按照重量百分比计包括：10％脂肪干细胞、7％磁性纳米微球、8％人血白蛋白原液、5％红景天苷、0.7％绞股蓝提取物、0.9％维生素E、2％黄酮醇苷、3％泼尼松、1.7％杜仲提取物、2.3％苍术提取物、0.6％生地黄提取物、2.1％海桐皮提取物、1.1％冬凌草提取物、2.7％混合支架、0.6％葡萄糖酸锌、0.3％肝素钙、0.7％乳化剂、0.7％稳定剂、0.2％pH调节剂、0.6％抗氧化剂，余量为生理盐水。红景天苷能够清除自由基，并且促进细胞生长的作用；绞股蓝提取液具有防抗癌，防止细胞癌化的作用；维生素E具有良好的抗氧化作用；黄酮醇苷可以消除细胞产生的自由基；泼尼松具有抗炎抑菌的作痛，能够抑制细胞组织增生；杜仲提取物可防止肌肉骨骼老化，抗菌的作用；苍术提取物治疗筋骨疼痛；生地黄提取物具有清热凉血的功效；海桐皮提取物具有消肿，治疗关节疼痛的功效；冬凌草提取物具有消炎止痛，活血的功效；肝素钙具有抗凝血的作用。磁性纳米微球由纳米三氧化二铁、纳米三氧化二钴和纳米陶瓷按照6:2:11的比例混合制成。可以通过为细胞补磁的方式，提高细胞活性，增强药效。混合支架由胶原蛋白支架与富血小板纤维凝胶支架按照9:7的比例混合制成。通过该比例的混合支架相对于单一支架对于移植到膝关节关节内的治疗效果更好，疗效更显著。
绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物的制备方法为：将绞股蓝、杜仲、苍术、生地黄、海桐皮和冬凌草清洗晒干后分别研磨至粉末，将各粉末与去离子水按照体积比为1:35的比例混合，在83℃温度下浸提2.5h后过滤弃滤渣A得滤液A，再将滤渣A与去离子水按照体积比1:20的比例混合，在100℃温度下浸提1.2h后过滤弃滤渣B得滤液B，将滤液A和滤液B混合再过滤，浓缩至含水量为3％，分别得到绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物。
自体脂肪干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织25ml，将脂肪组织破碎至直径为3mm的脂肪粒块，用清洗液反复冲洗人脂肪组织2次，以除去人脂肪组织中的血液；清洗液内含有质量百分比为0.1％的木质素磺酸盐和质量百分比为0.7％的亭扎肝素钠；木质素磺酸盐和亭扎肝素钠在该配比下可以有效提高清除脂肪组织中的血液效果，清洗次数少，提高清洗效率。
S2：将S1的脂肪粒块置于离心管中，并加入体积比为2:5的0.18％胰蛋白酶和0.24％胶原酶的混合酶液，然后将离心管置于37℃下，以130r/min的离心速率消化1.5h，离心期间每15min间歇5min；离心管内人脂肪粒块与混合酶液的体积比为5:6；可以有效将脂肪干细胞分离出来，提高脂肪干细胞的数量和质量，为后续药物制备做好前提基础。
S3：将1ml含有1×105个脂肪干细胞的细胞悬液加入10ml内置有多个二氧化钛小球的培养瓶中，将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中，约12小时后，轻轻振动培养瓶，使二氧化钛小球在培养瓶发生位移，然后全量更换诱导分化培养基；之后每隔12小时轻轻振动培养瓶一次，每隔1天半量更换一次诱导分化培养基，期间每隔4小时使用脉冲电磁场作用培养瓶10分钟，脉冲电磁场磁场强度1.8mT，感应电场强度5mV，频率70Hz。二氧化钛小球可有效促进脂肪干细胞的诱导分化，球形附着面积大，同时脉冲电磁场的配合促进脂肪干细胞的诱导分化，进一步的提高诱导分化的过程，提高诱导分化的软骨细胞的数量和质量，在37℃恒温下培养4天，诱导脂肪间充质干细胞在细胞诱导培养液的诱导下，生成软骨细胞；诱导分化培养基为高糖DMEM加入176μg/ml红景天苷提取液，74μg/ml淫羊藿素，14ng/ml TGFβ3，7ng/ml生长因子，120nM地塞米松，21μg/ml复合维生素，9ng/ml小分子活性肽，79μg/ml丙酮酸钠，35μg/ml硫辛酸，复合维生素为维生素C、维生素B2和维生素E以质量比为4:1:2组成的。红景天苷和淫羊藿素在上述比例可以有效促进诱导分化的过程，硫辛酸可以消除加速老化和致病的自由基，复合维生素在上述比例中可以为脂肪干细胞又到分化成软骨细胞过程中提供最为合适的维生素需求；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1800r/min离心5min得到上清液A和下层细胞A，将上清液A以2100r/min离心3min得到上清液B和下层细胞B，弃上清液B取下层细胞B，将下层细胞B和下层细胞A混合用生理盐水稀释后再以1550r/min离心9min，得到软骨细胞与脂肪干细胞的混合细胞；得到的软骨细胞与脂肪干细胞数量多，质量高。
S5：将混合细胞用人血白蛋白原液进行稀释，将磁性纳米微球和红景天苷依次添加到稀释混合细胞溶液，在37℃恒温下通过超声波辅助分散，时间为20min，得到药物原液；
S6：将绞股蓝提取物、黄酮醇苷、泼尼松、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物分别用生理盐水进行溶解，分别得到绞股蓝提取物溶液、黄酮醇苷溶液、泼尼松溶液、杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液；首先将药物原液与绞股蓝提取物溶液进行混合，期间滴加黄酮醇苷溶液并搅拌，得到混合溶液；将杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液混合后，升温至76℃后加入泼尼松溶液后搅拌4min，冷却至37℃后与混合溶液混合，之后依次加入维生素E、葡萄糖酸锌溶液和肝素钙溶液，搅拌均匀并通过超声辅助分散，得到药物混合液；混合效果好，药物混合液的药液性能更加稳定。
S7：在药物混合液中加入乳化剂、稳定剂、混合支架和抗氧化剂，搅拌均匀，同时在搅拌过程中，加入pH调节剂至药物混合液至PH＝7.1；即得含有自体脂肪干细胞药物的注射液。
实施例2
一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，自体脂肪干细胞药物按照重量百分比计包括：16％脂肪干细胞、9.7％磁性纳米微球、9％人血白蛋白原液、6％红景天苷、1.1％绞股蓝提取物、1.4％维生素E、5％黄酮醇苷、4％泼尼松、2.3％杜仲提取物、3.7％苍术提取物、0.9％生地黄提取物、2.9％海桐皮提取物、1.4％冬凌草提取物、3.7％混合支架、2.1％葡萄糖酸锌、0.4％肝素钙、1.3％乳化剂、1.1％稳定剂、0.4％pH调节剂、1.3％抗氧化剂，余量为生理盐水。红景天苷能够清除自由基，并且促进细胞生长的作用；绞股蓝提取液具有防抗癌，防止细胞癌化的作用；维生素E具有良好的抗氧化作用；黄酮醇苷可以消除细胞产生的自由基；泼尼松具有抗炎抑菌的作痛，能够抑制细胞组织增生；杜仲提取物可防止肌肉骨骼老化，抗菌的作用；苍术提取物治疗筋骨疼痛；生地黄提取物具有清热凉血的功效；海桐皮提取物具有消肿，治疗关节疼痛的功效；冬凌草提取物具有消炎止痛，活血的功效；肝素钙具有抗凝血的作用。磁性纳米微球由纳米三氧化二铁、纳米三氧化二钴和纳米陶瓷按照6:2:11的比例混合制成。可以通过为细胞补磁的方式，提高细胞活性，增强药效。混合支架由胶原蛋白支架与富血小板纤维凝胶支架按照9:7的比例混合制成。通过该比例的混合支架相对于单一支架对于移植到膝关节关节内的治疗效果更好，疗效更显著。
绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物的制备方法为：将绞股蓝、杜仲、苍术、生地黄、海桐皮和冬凌草清洗晒干后分别研磨至粉末，将各粉末与去离子水按照体积比为1:35的比例混合，在83℃温度下浸提2.5h后过滤弃滤渣A得滤液A，再将滤渣A与去离子水按照体积比1:20的比例混合，在100℃温度下浸提1.2h后过滤弃滤渣B得滤液B，将滤液A和滤液B混合再过滤，浓缩至含水量为7％，分别得到绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物。
自体脂肪干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织25ml，将脂肪组织破碎至直径为4mm的脂肪粒块，用清洗液反复冲洗人脂肪组织1次，以除去人脂肪组织中的血液；清洗液内含有质量百分比为0.1％的木质素磺酸盐和质量百分比为0.7％的亭扎肝素钠；木质素磺酸盐和亭扎肝素钠在该配比下可以有效提高清除脂肪组织中的血液效果，清洗次数少，提高清洗效率。
S2：将S1的脂肪粒块置于离心管中，并加入体积比为2:5的0.18％胰蛋白酶和0.24％胶原酶的混合酶液，然后将离心管置于37℃下，以130r/min的离心速率消化1.5h，离心期间每15min间歇5min；离心管内人脂肪粒块与混合酶液的体积比为5:6；可以有效将脂肪干细胞分离出来，提高脂肪干细胞的数量和质量，为后续药物制备做好前提基础。
S3：将1ml含有1×105个脂肪干细胞的细胞悬液加入10ml内置有多个二氧化钛小球的培养瓶中，将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中，约12小时后，轻轻振动培养瓶，使二氧化钛小球在培养瓶发生位移，然后全量更换诱导分化培养基；之后每隔12小时轻轻振动培养瓶一次，每隔1天半量更换一次诱导分化培养基，期间每隔5小时使用脉冲电磁场作用培养瓶21分钟，脉冲电磁场磁场强度1.8mT，感应电场强度5mV，频率70Hz。二氧化钛小球可有效促进脂肪干细胞的诱导分化，球形附着面积大，同时脉冲电磁场的配合促进脂肪干细胞的诱导分化，进一步的提高诱导分化的过程，提高诱导分化的软骨细胞的数量和质量，在37℃恒温下培养6天，诱导脂肪间充质干细胞在细胞诱导培养液的诱导下，生成软骨细胞；诱导分化培养基为高糖DMEM加入176μg/ml红景天苷提取液，74μg/ml淫羊藿素，14ng/ml TGFβ3，7ng/ml生长因子，120nM地塞米松，21μg/ml复合维生素，9ng/ml小分子活性肽，79μg/ml丙酮酸钠，35μg/ml硫辛酸，复合维生素为维生素C、维生素B2和维生素E以质量比为4:1:2组成的。红景天苷和淫羊藿素在上述比例可以有效促进诱导分化的过程，硫辛酸可以消除加速老化和致病的自由基，复合维生素在上述比例中可以为脂肪干细胞又到分化成软骨细胞过程中提供最为合适的维生素需求；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1800r/min离心6min得到上清液A和下层细胞A，将上清液A以2100r/min离心4min得到上清液B和下层细胞B，弃上清液B取下层细胞B，将下层细胞B和下层细胞A混合用生理盐水稀释后再以1550r/min离心12min，得到软骨细胞与脂肪干细胞的混合细胞；得到的软骨细胞与脂肪干细胞数量多，质量高。
S5：将混合细胞用人血白蛋白原液进行稀释，将磁性纳米微球和红景天苷依次添加到稀释混合细胞溶液，在37℃恒温下通过超声波辅助分散，时间为40min，得到药物原液；
S6：将绞股蓝提取物、黄酮醇苷、泼尼松、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物分别用生理盐水进行溶解，分别得到绞股蓝提取物溶液、黄酮醇苷溶液、泼尼松溶液、杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液；首先将药物原液与绞股蓝提取物溶液进行混合，期间滴加黄酮醇苷溶液并搅拌，得到混合溶液；将杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液混合后，升温至76℃后加入泼尼松溶液后搅拌5min，冷却至37℃后与混合溶液混合，之后依次加入维生素E、葡萄糖酸锌溶液和肝素钙溶液，搅拌均匀并通过超声辅助分散，得到药物混合液；混合效果好，药物混合液的药液性能更加稳定。
S7：在药物混合液中加入乳化剂、稳定剂、混合支架和抗氧化剂，搅拌均匀，同时在搅拌过程中，加入pH调节剂至药物混合液至PH＝7.2；即得含有自体脂肪干细胞药物的注射液。
实施例3
一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，自体脂肪干细胞药物按照重量百分比计包括：18％脂肪干细胞、11％磁性纳米微球、10％人血白蛋白原液、7％红景天苷、1.2％绞股蓝提取物、1.8％维生素E、7％黄酮醇苷、5％泼尼松、3.4％杜仲提取物、4.4％苍术提取物、1.3％生地黄提取物、3.9％海桐皮提取物、1.9％冬凌草提取物、4.9％混合支架、2.5％葡萄糖酸锌、0.5％肝素钙、1.5％乳化剂、1.5％稳定剂、0.6％pH调节剂、2％抗氧化剂，余量为生理盐水。红景天苷能够清除自由基，并且促进细胞生长的作用；绞股蓝提取液具有防抗癌，防止细胞癌化的作用；维生素E具有良好的抗氧化作用；黄酮醇苷可以消除细胞产生的自由基；泼尼松具有抗炎抑菌的作痛，能够抑制细胞组织增生；杜仲提取物可防止肌肉骨骼老化，抗菌的作用；苍术提取物治疗筋骨疼痛；生地黄提取物具有清热凉血的功效；海桐皮提取物具有消肿，治疗关节疼痛的功效；冬凌草提取物具有消炎止痛，活血的功效；肝素钙具有抗凝血的作用。磁性纳米微球由纳米三氧化二铁、纳米三氧化二钴和纳米陶瓷按照6:2:11的比例混合制成。可以通过为细胞补磁的方式，提高细胞活性，增强药效。混合支架由胶原蛋白支架与富血小板纤维凝胶支架按照9:7的比例混合制成。通过该比例的混合支架相对于单一支架对于移植到膝关节关节内的治疗效果更好，疗效更显著。
绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物的制备方法为：将绞股蓝、杜仲、苍术、生地黄、海桐皮和冬凌草清洗晒干后分别研磨至粉末，将各粉末与去离子水按照体积比为1:35的比例混合，在83℃温度下浸提2.5h后过滤弃滤渣A得滤液A，再将滤渣A与去离子水按照体积比1:20的比例混合，在100℃温度下浸提1.2h后过滤弃滤渣B得滤液B，将滤液A和滤液B混合再过滤，浓缩至含水量为10％，分别得到绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物。
自体脂肪干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织25ml，将脂肪组织破碎至直径为5mm的脂肪粒块，用清洗液反复冲洗人脂肪组织2次，以除去人脂肪组织中的血液；清洗液内含有质量百分比为0.1％的木质素磺酸盐和质量百分比为0.7％的亭扎肝素钠；木质素磺酸盐和亭扎肝素钠在该配比下可以有效提高清除脂肪组织中的血液效果，清洗次数少，提高清洗效率。
S2：将S1的脂肪粒块置于离心管中，并加入体积比为2:5的0.18％胰蛋白酶和0.24％胶原酶的混合酶液，然后将离心管置于37℃下，以130r/min的离心速率消化1.5h，离心期间每15min间歇5min；离心管内人脂肪粒块与混合酶液的体积比为5:6；可以有效将脂肪干细胞分离出来，提高脂肪干细胞的数量和质量，为后续药物制备做好前提基础。
S3：将1ml含有1×105个脂肪干细胞的细胞悬液加入10ml内置有多个二氧化钛小球的培养瓶中，将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中，约12小时后，轻轻振动培养瓶，使二氧化钛小球在培养瓶发生位移，然后全量更换诱导分化培养基；之后每隔12小时轻轻振动培养瓶一次，每隔1天半量更换一次诱导分化培养基，期间每隔6小时使用脉冲电磁场作用培养瓶25分钟，脉冲电磁场磁场强度1.8mT，感应电场强度5mV，频率70Hz。二氧化钛小球可有效促进脂肪干细胞的诱导分化，球形附着面积大，同时脉冲电磁场的配合促进脂肪干细胞的诱导分化，进一步的提高诱导分化的过程，提高诱导分化的软骨细胞的数量和质量，在37℃恒温下培养7天，诱导脂肪间充质干细胞在细胞诱导培养液的诱导下，生成软骨细胞；诱导分化培养基为高糖DMEM加入176μg/ml红景天苷提取液，74μg/ml淫羊藿素，14ng/ml TGFβ3，7ng/ml生长因子，120nM地塞米松，21μg/ml复合维生素，9ng/ml小分子活性肽，79μg/ml丙酮酸钠，35μg/ml硫辛酸，复合维生素为维生素C、维生素B2和维生素E以质量比为4:1:2组成的。红景天苷和淫羊藿素在上述比例可以有效促进诱导分化的过程，硫辛酸可以消除加速老化和致病的自由基，复合维生素在上述比例中可以为脂肪干细胞又到分化成软骨细胞过程中提供最为合适的维生素需求；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1800r/min离心7min得到上清液A和下层细胞A，将上清液A以2100r/min离心5min得到上清液B和下层细胞B，弃上清液B取下层细胞B，将下层细胞B和下层细胞A混合用生理盐水稀释后再以1550r/min离心13min，得到软骨细胞与脂肪干细胞的混合细胞；得到的软骨细胞与脂肪干细胞数量多，质量高。
S5：将混合细胞用人血白蛋白原液进行稀释，将磁性纳米微球和红景天苷依次添加到稀释混合细胞溶液，在37℃恒温下通过超声波辅助分散，时间为45min，得到药物原液；
S6：将绞股蓝提取物、黄酮醇苷、泼尼松、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物分别用生理盐水进行溶解，分别得到绞股蓝提取物溶液、黄酮醇苷溶液、泼尼松溶液、杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液；首先将药物原液与绞股蓝提取物溶液进行混合，期间滴加黄酮醇苷溶液并搅拌，得到混合溶液；将杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液混合后，升温至76℃后加入泼尼松溶液后搅拌7min，冷却至37℃后与混合溶液混合，之后依次加入维生素E、葡萄糖酸锌溶液和肝素钙溶液，搅拌均匀并通过超声辅助分散，得到药物混合液；混合效果好，药物混合液的药液性能更加稳定。
S7：在药物混合液中加入乳化剂、稳定剂、混合支架和抗氧化剂，搅拌均匀，同时在搅拌过程中，加入pH调节剂至药物混合液至PH＝7.1-7.3；即得含有自体脂肪干细胞药物的注射液。
为进一步说明本发明药物疗效，我们对某医院进行了临床试验:
选取患有膝关节炎的患者共200人(男100人，女100人)，200名患者病症相似，采用随机方法分为实验组1、实验组2、实验组3和对照组，每组50人(男25，女25)，年龄均在40-70岁之间，其中实验组1、实验组2、实验组3为使用本发明实施例1、2、3所制备药物进行治疗，对照组为普通药物(非甾体抗炎药)进行治疗，症状改善疗效对比如表1所示:
显效:肿胀明显消失，步行无疼痛，屈曲角度增大效果明显。
有效:肿胀有部分消失，步行偶有疼痛，屈曲角度增大效果一般。
无效:肿胀无消失，步行疼痛，无法长时间步行和站立，屈曲角度较小，挛缩。
表1:膝关节炎治疗效果对比表
组别 人数/人 显效/人 有效/人 无效/人 总有效率/％
对照组 50 9 24 17 66
实验组1 50 18 28 4 92
实验组2 50 21 26 3 94
试验组3 50 17 27 6 88
从表1可以看出，采用本发明的实验组1、实验组2、实验组3的总有效率明显优于对照组的普通药物，同时实验组2相对于实验组1和实验组3的效果是最好的。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，其特征在于，所述自体脂肪干细胞药物按照重量百分比计包括：10-18％脂肪干细胞、7-11％磁性纳米微球、8-10％人血白蛋白原液、5-7％红景天苷、0.7-1.2％绞股蓝提取物、0.9-1.8％维生素E、2-7％黄酮醇苷、3-5％泼尼松、1.7-3.4％杜仲提取物、2.3-4.4％苍术提取物、0.6-1.3％生地黄提取物、2.1-3.9％海桐皮提取物、1.1-1.9％冬凌草提取物、2.7-4.9％混合支架、0.6-2.5％葡萄糖酸锌、0.3-0.5％肝素钙、0.7-1.5％乳化剂、0.7-1.5％稳定剂、0.2-0.6％pH调节剂、0.6-2％抗氧化剂，余量为生理盐水。
2.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，其特征在于，所述绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物的制备方法为：将绞股蓝、杜仲、苍术、生地黄、海桐皮和冬凌草分别清洗晒干后研磨至粉末，将所述绞股蓝粉末、杜仲粉末、苍术粉末、生地黄粉末、海桐皮粉末和冬凌草粉末分别与去离子水按照体积比为1:35的比例混合，加热熬制成药液，过滤，浓缩至含水量为3-10％，分别得到绞股蓝提取物、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物。
3.根据权利要求1所述的一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，其特征在于，所述磁性纳米微球由纳米三氧化二铁、纳米三氧化二钴和纳米陶瓷按照6:2:11的比例混合制成。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，其特征在于，所述自体脂肪干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
S1：从患者抽取自体脂肪组织25ml，将脂肪组织破碎至直径为3-5mm的脂肪粒块，用清洗液反复冲洗人脂肪组织1-2次，以除去人脂肪组织中的血液；所述清洗液内含有质量百分比为0.1％的木质素磺酸盐和质量百分比为0.7％的亭扎肝素钠；
S2：将S1的脂肪粒块置于离心管中，并加入体积比为2:5的0.18％胰蛋白酶和0.24％胶原酶的混合酶液，然后将离心管置于37℃下，以130r/min的离心速率消化1.5h，离心期间每15min间歇5min；离心管内人脂肪粒块与混合酶液的体积比为5:6；
S3：将脂肪干细胞的细胞悬液置入培养瓶中，后将所述培养瓶放入CO2培养箱中，在37℃恒温下培养4-7天，诱导脂肪间充质干细胞在所述细胞诱导培养液的诱导下，生成软骨细胞；
S4：将培养瓶中的液体移至离心管内，以1800r/min离心5-7min得到上清液A和下层细胞A，将上清液A以2100r/min离心3-5min得到上清液B和下层细胞B，弃上清液B取下层细胞B，将下层细胞B和下层细胞A混合用生理盐水稀释后再以1550r/min离心9-13min，得到软骨细胞与脂肪干细胞的混合细胞；
S5：将所述混合细胞用所述人血白蛋白原液进行稀释，将所述磁性纳米微球和红景天苷依次添加到稀释混合细胞溶液，在37℃恒温下通过超声波辅助分散，时间为20-45min，得到药物原液；
S6：将所述绞股蓝提取物、黄酮醇苷、泼尼松、杜仲提取物、苍术提取物、生地黄提取物、海桐皮提取物和冬凌草提取物分别用生理盐水进行溶解，分别得到绞股蓝提取物溶液、黄酮醇苷溶液、泼尼松溶液、杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液；首先将所述药物原液与绞股蓝提取物溶液进行混合，期间滴加黄酮醇苷溶液并搅拌，得到混合溶液；将杜仲提取物溶液、苍术提取物溶液、生地黄提取物溶液、海桐皮提取物溶液和冬凌草提取物溶液混合后，升温至76℃后加入所述泼尼松溶液后搅拌4-7min，冷却至37℃后与所述混合溶液混合，之后依次加入维生素E、葡萄糖酸锌溶液和肝素钙溶液，搅拌均匀并通过超声辅助分散，得到药物混合液；
S7：在所述药物混合液中加入所述乳化剂、稳定剂、混合支架和抗氧化剂，搅拌均匀，同时在搅拌过程中，加入所述pH调节剂至药物混合液至PH＝7.1-7.3；即得含有自体脂肪干细胞药物的注射液。
5.根据权利要求4所述的一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，其特征在于，所述步骤S5中磁性纳米微球由纳米三氧化二铁、纳米三氧化二钴和纳米陶瓷组成。
6.根据权利要求4所述的一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，其特征在于，所述S3具体步骤为：将1ml含有1×105个脂肪干细胞的细胞悬液加入10ml内置有多个二氧化钛小球的培养瓶中，将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中，约12小时后，轻轻振动培养瓶，使二氧化钛小球在培养瓶发生位移，然后全量更换诱导分化培养基；之后每隔12小时轻轻振动培养瓶一次，每隔1天半量更换一次诱导分化培养基，期间每隔4-6小时使用脉冲电磁场作用培养瓶10-25分钟，所述脉冲电磁场磁场强度1.8mT，感应电场强度5mV，频率70Hz。
7.根据权利要求6所述的一种利用自体脂肪干细胞制备治疗膝关节炎的干细胞药物，其特征在于，所述诱导分化培养基为高糖DMEM加入176μg/ml红景天苷提取液，14ng/ml TGFβ3，7ng/ml生长因子，120nM地塞米松，21μg/ml复合维生素，9ng/ml小分子活性肽，79μg/ml丙酮酸钠，35μg/ml硫辛酸，所述复合维生素为维生素C、维生素B2和维生素E以质量比为4:1:2组成的。
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