WO2022100399A1 - 无细胞脂肪提取液对关节炎的治疗用途 - Google Patents

无细胞脂肪提取液对关节炎的治疗用途 Download PDF

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张文杰
侯曦凡
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上海萨美细胞技术有限公司
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the arthritis includes drug-induced osteoarthritis.
  • the pain includes arthritis pain.
  • the concentration of BDNF is 800-5000pg/ml, preferably 1000-4000pg/ml, more preferably 1200-2500pg/ml, more Preferably 1400-2000 pg/ml, more preferably 1600-2000 pg/ml, more preferably 1700-1850 pg/ml.
  • the concentration of the bFGF is 50-600pg/ml, preferably 100-500pg/ml, more preferably 120-400pg/ml, more Preferably 150-300 pg/ml, more preferably 200-280 pg/ml, more preferably 220-260 pg/ml.
  • the concentration of TGF- ⁇ 1 is 200-3000pg/ml, preferably 400-2000pg/ml, more preferably 600-1500pg/ml , more preferably 800-1200pg/ml, more preferably 800-1100pg/ml, more preferably 900-1000pg/ml.
  • the weight ratio of HGF to VEGF is 1-20:1, preferably 1-15:1, more preferably 1-10:1, more preferably 2-8:1, More preferably 4-5.5:1.
  • the cell-free fat extract is prepared by the following method:
  • the centrifugation time is 1-15 minutes, preferably 1-10 minutes, more preferably 1-8 minutes, and optimally 1-5 minutes.
  • the temperature of the centrifugation is 2-6°C.
  • the emulsification is mechanical emulsification.
  • the thawed mixture is used for centrifugation after thawing after freezing.
  • the thawing temperature is 20-40°C, preferably 25-40°C, more preferably 37°C.
  • the number of cycles of thawing after freezing is 1-5 times (preferably 1, 2, 3 or 4 times).
  • the intermediate liquid layer is a transparent or substantially transparent layer.
  • the non-human mammals include rodents, such as rats and mice.
  • Figure 1 shows the changes of animal body weight and time in each group after administration.
  • Figure 3 shows the paw withdrawal pressure values of rats in each group before and after administration.
  • Figure 5 shows the absolute value of the pressure difference between the two feet of rats in each group before and after administration.
  • Figure 6 shows the results of HE staining of rats in different groups (200 ⁇ ).
  • cell free fat extract As used herein, the terms “cell free fat extract”, “Cell free fat extract” and “CEFFE” are used interchangeably.
  • TGF- ⁇ 1 is referred to as transforming growth factor- ⁇ 1.
  • the concentration of BDNF is 800-5000pg/ml, preferably 1000-4000pg/ml, more preferably 1200-2500pg/ml, more Preferably 1400-2000 pg/ml, more preferably 1600-2000 pg/ml, more preferably 1700-1850 pg/ml.
  • the concentration of the bFGF is 50-600 pg/ml, preferably 100-500 pg/ml, more preferably 120-400 pg/ml, More preferably 150-300 pg/ml, more preferably 200-280 pg/ml, more preferably 220-260 pg/ml.
  • the weight ratio of GDNF to VEGF is 2-20:1, preferably 4-15:1, more preferably 6-12:1, and most preferably 8.5-9.5:1.
  • the weight ratio of bFGF to VEGF is 0.2-8:1, preferably 0.5-5:1, more preferably 0.6-2:1, more preferably 0.8-1.6:1, Optimally 1-1.5:1.
  • the cell-free fat extracts of the present invention are prepared by the following methods:
  • the mechanical emulsification is performed mechanically by repeated blowing through a syringe (eg 20-200 times, preferably 20-150 times, more preferably 20-100 times, more preferably 30-50 times). emulsification.
  • the centrifugation time is 1-15 minutes, preferably 1-10 minutes, more preferably 2-8 minutes, and optimally 3-7 minutes.
  • the first layer, the second layer, the third layer and the fourth layer are arranged in order from top to bottom.
  • the filtration and sterilization are performed through a filter (eg, a 0.22 ⁇ m microporous membrane).
  • a filter eg, a 0.22 ⁇ m microporous membrane
  • the arthritis of the present invention is osteoarthritis.
  • the site of occurrence of osteoarthritis is not particularly limited, for example, it can be weight-bearing joints and joints with more activities, such as cervical vertebrae, lumbar vertebrae, knee joint bones, hip joint bones, etc. of arthritis.
  • compositions described in the present invention include (but are not limited to): pharmaceutical compositions, food compositions, health care compositions, dietary supplements, and the like.
  • acceptable carrier moieties are cellulose and its derivatives (such as sodium carboxymethyl cellulose, sodium ethyl cellulose, cellulose acetate, etc.) , gelatin, talc, solid lubricants (such as stearic acid, magnesium stearate), calcium sulfate, vegetable oils (such as soybean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil, etc.), polyols (such as propylene glycol, glycerin, mannitol, sorbitol) etc.), emulsifiers (such as ), wetting agents (such as sodium lauryl sulfate), colorants, flavors, stabilizers, antioxidants, preservatives, pyrogen-free water, etc.
  • cellulose and its derivatives such as sodium carboxymethyl cellulose, sodium ethyl cellulose, cellulose acetate, etc.
  • gelatin such as sodium carboxymethyl cellulose, sodium ethyl cellulose, cellulose acetate, etc.
  • Solid dosage forms such as tablets, dragees, capsules, pills and granules can be prepared using coatings and shell materials, such as enteric coatings and other materials well known in the art. They may contain opacifiers.
  • compositions for parenteral injection may comprise physiologically acceptable sterile aqueous or anhydrous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, and sterile powders for reconstitution into sterile injectable solutions or dispersions.
  • Suitable aqueous and non-aqueous carriers, diluents, solvents or excipients include water, ethanol, polyols and suitable mixtures thereof.
  • the present invention is the first to discover that cell-free fat extracts have excellent therapeutic effects on arthritis and its symptoms of pain and mobility impairment.
  • the middle layer ie, the fat layer containing adipocytes
  • the MIA knee joint injection was used to establish the model, and the experimental animals were 8-week-old male SD rats. 6 rats were randomly selected as the normal control group, and the other rats were used for OA modeling. After the modeling rats were anesthetized with isoflurane, 50 ⁇ L of 40 mg/mL MIA solution was injected into the joint cavity of the left hind limb, and 1 week after modeling, the rats were selected. Animals with significantly increased bipedal pressure difference and significantly decreased left hind foot Von Frey value 24 OA model rats were randomly divided into 4 groups with 6 rats in each group. The doses of the normal control group and the rats after modeling are as follows:
  • Detection method Put the animal into the container, and record the data when the animal calms down, the left and right feet are in the corresponding sensing area, and the number showing the weight of the left and right feet remains relatively stable (at least for 3s).
  • Figure 3 shows the paw withdrawal pressure values of each group of arthritis model rats before and after administration.
  • the paw withdrawal pressure values of rats in the model control group and CEFFE dose groups were similar, and were significantly lower than those in the normal control group (P ⁇ 0.001).
  • the paw withdrawal pressure of the rats in the normal control group fluctuated between 30.0 ⁇ 4.9 and 44.5 ⁇ 5.2g.
  • the fluctuation of the paw withdrawal pressure value in the model control group was smaller, and was significantly lower than that in the normal control group at each time point (P ⁇ 0.001).
  • the absolute value of the pressure difference between the feet in the high-dose CEFFE group was significantly lower than that in the model control group from one week after the first administration (ie, the second week) to the experimental end point (one week after the fourth administration) (P ⁇ 0.05-P ⁇ 0.05). 0.01).
  • the absolute value of the pressure difference between the feet reflects the joint load. The smaller the difference, the closer the weight is to the normal. The pressure difference between the feet can definitely reflect the improvement of the syndrome of arthritis, including joint pain and movement disorders. As can be seen from Figure 5, CEFFE was able to improve symptoms of arthritis and its joint pain and mobility impairment.
  • Table 3 Summary table of main pathological changes of knee joints in different groups of rats by HE staining
  • FIG. 7D CEFFE medium dose group, CEFFE intra-articular injection of MIA-induced osteoarthritis model rats, euthanized on the 54th day of the experiment (D54), mild articular cartilage fibrosis and mild articular cartilage cells were seen in the knee joint (lower end of femur) reduce.
  • FIG. 7E CEFFE high-dose group, CEFFE intra-articular injection of MIA-induced osteoarthritis model rats, euthanized on the 54th day of the experiment (D54), mild articular cartilage fibrosis and mild articular cartilage cells were seen in the knee joint (lower end of the femur). reduce.

Abstract

提供了一种无细胞脂肪提取液对关节炎的治疗用途。该无细胞脂肪提取物用于制备组合物或制剂，该组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途：(i)预防和/治疗关节炎；(ii)预防和/治疗疼痛；(iii)活动障碍。

Description

无细胞脂肪提取液对关节炎的治疗用途 技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及无细胞脂肪提取液对关节炎的治疗用途。
背景技术
关节炎是一种发生在人体关节及其周围组织，由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病，临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形，严重者导致关节残疾、影响患者生活质量。
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种严重影响患者健康的关节炎。骨关节炎是一种软骨退行性疾病，起病于关节软骨，逐步侵蚀至软骨下骨及周围组织，导致局灶性、侵蚀性的关节病变，从而引发关节疼痛、活动障碍及畸形。OA发病率随年龄增长而增高，已成为导致中老年人残疾的第一大疾病，严重影响患者工作及生活。目前的治疗方式包括保守治疗和手术治疗，在病程早期进行关节腔内药物注射，如注射玻璃酸钠，糖皮质激素等，是缓解OA症状的主流保守治疗方式，然而，尚缺乏理想的治疗药物，寻找安全有效的生物制剂成为亟待解决的问题。
因此，本领域需要开发一种能够有效治疗关节炎的药物。
发明内容
本发明的目在于提供一种无细胞脂肪提取物在预防和/或治疗关节炎方面中的用途。
本发明第一方面，提供一种无细胞脂肪提取物的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途：(i)预防和/治疗关节炎；(ii)预防和/治疗疼痛；(iii)活动障碍。
在另一优选例中，所述的关节炎包括骨关节炎。
在另一优选例中，所述的关节炎包括药物诱导性骨关节炎。
在另一优选例中，所述的关节炎包括退行性骨关节炎。
在另一优选例中，所述的关节炎包括软骨退行性骨关节炎。
在另一优选例中，所述的骨关节炎包括负重骨关节及活动量较多的骨关节处的关节炎。
在另一优选例中，所述的骨关节炎选自下组：颈椎骨关节炎、腰椎骨关节炎、膝关节骨关节炎、髋关节骨关节炎，或其组合。
在另一优选例中，所述的骨关节炎包括膝关节骨关节炎。膝关节骨关节炎为一种膝关节软骨退行性改变为主的慢性骨关节病，
在另一优选例中，所述的疼痛包括关节炎疼痛。
在另一优选例中，所述的活动障碍包括关节炎引起的活动障碍。
在另一优选例中，所述的预防和/治疗关节炎通过选自下组的一种或多种方式进行：
(a)抑制关节软骨纤维化；和/或
(b)改善关节软骨细胞数量。
在另一优选例中，所述的改善包括提高。
在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物为从人或非人哺乳动物中的脂肪中提取制备获得的无细胞脂肪提取物。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为猴、猩猩、牛、猪、狗、羊、鼠或兔。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂包括药物组合物或制剂、食品组合物或制剂、保健品组合物或制剂或膳食补充剂。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。
在另一优选例中，所述的注射制剂为静脉注射剂或肌肉注射剂。
在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。
在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂通过外用、局部、或皮下注射方式施用。
在另一优选例中，所述无细胞脂肪提取物不含有细胞且不含有脂滴。
在另一优选例中，所述脂滴为脂肪细胞破碎后释放的油滴。
在另一优选例中，所述“不含有脂滴”指所述无细胞脂肪提取物中，油滴体积占总液体百分比小于1％，优选地小于0.5％，更优选地小于0.1％。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：内皮细胞、脂肪干细胞、巨噬血细胞、基质细胞。
在另一优选例中，所述“无细胞”指1ml无细胞脂肪提取物中的细胞平均数量≤1个，优选地≤0.5个，更佳地≤0.1个，或为0个。
在另一优选例中，所述无细胞脂肪提取物为天然获得的无添加成分的纳米脂肪提取物。
在另一优选例中，所述“无添加成分的”指除漂洗步骤外，在所述脂肪提取物的制备过程中未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂。
在另一优选例中，所述种无细胞脂肪提取物是通过将脂肪组织经过乳化后离心制备获得。
在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物含有一种或多种选自下组的组分：IGF-1、BDNF、GDNF、TGF-β1、HGF、bFGF、VEGF、TGF-β1、PDGF、EGF、NT-3、GH、G-CSF，或其组合。
在另一优选例中，所述的种无细胞脂肪提取物含有但不限于一种或多种选自下组的组分：IGF-1、BDNF、GDNF、bFGF、VEGF、TGF-β1、HGF、PDGF，或其组合。
在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物为无细胞脂肪提取液。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的IGF-1的浓度为5000-30000pg/ml，较佳地6000-20000pg/ml，更佳地7000-15000pg/ml，更佳地8000-12000pg/ml，更佳地9000-11000pg/ml，更佳地9500-10500pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的BDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1850pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的GDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1900pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的bFGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地100-500pg/ml，更佳地120-400pg/ml，更佳地150-300pg/ml，更佳地200-280pg/ml，更佳地220-260pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的VEGF的浓度为50-500pg/ml，较佳地100-400pg/ml，更佳地120-300pg/ml，更佳地150-250pg/ml，更佳地170-230pg/ml，更佳地190-210pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的TGF-β1的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地800-1200pg/ml，更佳地800-1100pg/ml，更佳地900-1000pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的HGF的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地600-1200pg/ml，更佳地800-1000pg/ml，更佳地850-950pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的PDGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地80-400pg/ml，更佳地100-300pg/ml，更佳地140-220pg/ml，更佳地160-200pg/ml，更佳地170-190pg/ml。
在另一优选例中，所述的IGF-1与VEGF的重量比为20-100：1，较佳地30-70：1，更佳地40-60：1，最佳地45-55：1。
在另一优选例中，所述的BDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8-9.5：1。
在另一优选例中，所述的GDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8.5-9.5：1。
在另一优选例中，所述的bFGF与VEGF的重量比为0.2-8：1，较佳地0.5-5：1，更佳地0.6-2：1，更佳地0.8-1.6：1，最佳地1-1.5：1。
在另一优选例中，所述的TGF-β1与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-6：1。
在另一优选例中，所述的HGF与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-5.5：1。
在另一优选例中，所述的PDGF与VEGF的重量比为0.1-3：1，较佳地0.2-2：1，更佳地0.4-1.5：1，最佳地0.7-1.2：1。
在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：
(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；
(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；
(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；
(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；
(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和
(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。
本发明第二方面，提供一种制备无细胞脂肪提取物的方法，所述的方法包括步骤：
(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；
(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；
(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；
(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；
(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和
(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。
在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物如本发明第一方面所述。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。
在另一优选例中，所述的离心的温度为2-6℃。
在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的乳化为机械乳化。
在另一优选例中，所述机械乳化为经注射器反复吹打(如吹打20-200次，较佳地20-150次，更佳地20-100次，更佳地30-50次)进行机械乳化。
在另一优选例中，所述的吹打的方式为2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打。
在另一优选例中，，所述的步骤(4)中，所述乳化为通过组织匀浆机打碎的方法。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，在将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理前，还包括对所述乳化的脂肪混合物冷冻后解冻处理。
在另一优选例中，冷冻后解冻处理后，将解冻后的混合物用于离心。
在另一优选例中，所述的冷冻的温度为-50℃至-120℃，较佳地-60℃至-100℃，更佳地-70℃至-90℃。
在另一优选例中，所述的解冻的温度为20-40℃，较佳地25-40℃，更佳地37℃。
在另一优选例中，所述的冷冻后解冻的循环次数为1-5次(优选为1、2、3或4次)。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，离心后，所述乳化的脂肪混合物分层4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层(即为中间液体层)，第四层为细胞/组织碎片沉淀层。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地2-8min，最佳地3-7min。
在另一优选例中，所述的离心的温度为2-6℃。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，第一层、第二层、第三层和第四层从上到下依次排列。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的中间液体层为透明或基本透明层。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤包能够将脂肪初提物中的脂肪细胞除去。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是通过滤器(如0.22μm微孔滤膜)进行。
在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。
在另一优选例中，所述的微孔滤膜的孔径大小为0.05-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.4μm，更佳地0.15-0.3μm，更佳地0.2-0.25μm，最佳地0.22μm。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是先通过可滤去细胞的第一过滤器，然后再通过可滤去病原体(如细菌)的第二滤器(如0.22μm的滤器)进行的。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，还包括对所述脂肪提取物进行分装，形成分装的产品。(所述分装后的提取物可于-20℃保存待用；可低温(如-4℃)或常温解冻后直接使用，或解冻后置于低温(如4℃)保存一段时间，然后使用)。
本发明第三方面，提供一种无细胞脂肪提取物，所述的无细胞脂肪提取物通过如本发明第二方面所述的方法制备获得。
本发明第四方面，提供一种组合物或制剂，所述的组合物或制剂包含(a)如本发明第三方面所述的无细胞脂肪提取物；和(b)药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物或膳食补充剂。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。
在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
在另一优选例中，所述的注射剂为静脉注射剂或肌肉注射剂。
在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。
在另一优选例中，在所述组合物或制剂中，无细胞脂肪提取物的质量百分比为5wt％，较佳地1-20wt％，以合物或制剂的总重量计。
本发明第五方面，提供一种制备如本发明第四方面所述的组合物或制剂的方法，所述的方法包括步骤：将如本发明第三方面所述的无细胞脂肪提取物与药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成组合物或制 剂。
本发明第六方面，提供一种i)预防和/治疗关节炎；(ii)预防和/治疗疼痛；和/或(iii)活动障碍的方法，对需要的对象施用如本发明第三方面所述的的无细胞脂肪提取物。
在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为给药后各组的动物体重与时间的变化。
图2为大鼠造模前后的缩爪压力值。
图3为各组大鼠给药前后缩爪压力值。
图4为大鼠造模前后的双足压力差绝对值。
图5为各组大鼠给药前后的双足压力差绝对值。
图6为不同组的大鼠HE染色结果(200×)。
图7为不同组的大鼠Safranin O-fast green staining染色结果(200×)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了无细胞脂肪提取物对关节炎及其疼痛和活动障碍症状具有优异的治疗作用。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“无细胞脂肪提取液”、“Cell free fat extract”与“CEFFE”可互换使用。
在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。本文中使用的"预防"还包括延迟疾病和/或它的附随症状的发作和降低对象的得病的风险。
本发明所述的“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的组合物、药盒、食品盒或保健品盒、活性成分组合时观察到的水平相比，本发明所述组合物或药物组合物减轻、抑制和/或逆转了糖尿病例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
如本文所用，“改善”包括预防、治疗、缓解、逆转和减轻等等。
如文本所用，术语“IGF-1”称为胰岛素样生长因子1(insulin-like growth  factors-1)。
如文本所用，术语“BDNF”称为脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)。
如文本所用，术语“GDNF”称为胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor)。
如文本所用，术语“bFGF”称为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)。
如文本所用，术语“VEGF”称为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)。
如文本所用，术语“TGF-β1”称为转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1)。
如文本所用，术语“HGF”称为肝细胞生长因子
如文本所用，术语“PDGF”称为血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor)
如文本所用，术语“EGF”称为表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor)
如文本所用，术语“NT-3”称为神经营养因子3(neurotrophins-3)。
如文本所用，术语“GH”称为生长激素(Growth Hormone)。
如文本所用，术语“G-CSF”称为粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)。
无细胞脂肪提取物(Cell free fat extract,CEFFE)及其制备方法
如本文所用，术语“本发明的无细胞脂肪提取物”、“本发明提取物”、“本发明的脂肪提取物”等可互换使用，指在脂肪提取物制备过程中(除漂洗步骤外)未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂所制备的源自脂肪组织的提取物(或提取液)。一种典型的制备本发明提取物的方法如上本发明第二方面中所述。此外，应理解，虽然本发明提取物在制备过程中不必添加任何添加剂(或添加成分)，但是也可以添加一些或少量的对本发明提取物的活性无负面或不利影响的安全的物质(如少量水)。
在本发明的一个优选例中，所述的无细胞脂肪提取物为无细胞脂肪提取液。
在本发明所述的无细胞脂肪提取物，可以包括多种细胞因子。代表性地，所述的无细胞脂肪提取物包括IGF-1、BDNF、GDNF、TGF-β、HGF、bFGF、VEGF、TGF-β1、PDGF、EGF、NT-3、GH和G-CSF中的一种或多种。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的IGF-1的浓度为5000-30000pg/ml，较佳地6000-20000pg/ml，更佳地7000-15000pg/ml，更佳地8000-12000pg/ml，更佳地9000-11000pg/ml，更佳地9500-10500pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的BDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1850pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的GDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1900pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的bFGF的浓度为50-600 pg/ml，较佳地100-500pg/ml，更佳地120-400pg/ml，更佳地150-300pg/ml，更佳地200-280pg/ml，更佳地220-260pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的VEGF的浓度为50-500pg/ml，较佳地100-400pg/ml，更佳地120-300pg/ml，更佳地150-250pg/ml，更佳地170-230pg/ml，更佳地190-210pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的TGF-β1的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地800-1200pg/ml，更佳地800-1100pg/ml，更佳地900-1000pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的HGF的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地600-1200pg/ml，更佳地800-1000pg/ml，更佳地850-950pg/ml。
在另一优选例中，在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的PDGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地80-400pg/ml，更佳地100-300pg/ml，更佳地140-220pg/ml，更佳地160-200pg/ml，更佳地170-190pg/ml。
在另一优选例中，所述的IGF-1与VEGF的重量比为20-100：1，较佳地30-70：1，更佳地40-60：1，最佳地45-55：1。
在另一优选例中，所述的BDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8-9.5：1。
在另一优选例中，所述的GDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8.5-9.5：1。
在另一优选例中，所述的bFGF与VEGF的重量比为0.2-8：1，较佳地0.5-5：1，更佳地0.6-2：1，更佳地0.8-1.6：1，最佳地1-1.5：1。
在另一优选例中，所述的TGF-β1与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-6：1。
在另一优选例中，所述的HGF与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-5.5：1。
在另一优选例中，所述的PDGF与VEGF的重量比为0.1-3：1，较佳地0.2-2：1，更佳地0.4-1.5：1，最佳地0.7-1.2：1。
优选地，本发明所述的无细胞脂肪提取物通过如上述本发明第二方面所述的方法制备获得。
代表性地，本发明所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：
(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；
(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；
(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；
(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；
(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和
(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。
具体地，本发明所述的无细胞脂肪提取物
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。
在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的乳化为机械乳化。
在另一优选例中，所述机械乳化为经注射器反复吹打(如吹打20-200次，较佳地20-150次，更佳地20-100次，更佳地30-50次)进行机械乳化。
在另一优选例中，所述的吹打的方式为2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打。
在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述乳化为通过组织匀浆机打碎的方法。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，在将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理前，还包括对所述乳化的脂肪混合物冷冻后解冻处理。
在另一优选例中，冷冻后解冻处理后，将解冻后的混合物用于离心。
在另一优选例中，所述的冷冻的温度为-50℃至-120℃，较佳地-60℃至-100℃，更佳地-70℃至-90℃。
在另一优选例中，所述的解冻的温度为20-40℃，较佳地25-40℃，更佳地37℃。
在另一优选例中，所述的冷冻后解冻的循环次数为1-5次(优选为1、2、3或4次)。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，离心后，所述乳化的脂肪混合物分层4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层(即为中间液体层)，第四层为细胞/组织碎片沉淀层。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地2-8min，最佳地3-7min。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，第一层、第二层、第三层和第四层从上到下依次排列。
在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的中间液体层为透明或基本透明层。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤包能够将脂肪初提物中的脂肪细胞除去。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是通过滤器(如0.22μm微孔滤膜)进行。
在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。
在另一优选例中，所述的微孔滤膜的孔径大小为0.05-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.4μm，更佳地0.15-0.3μm，更佳地0.2-0.25μm，最佳地0.22μm。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是先通过可滤去细胞的第一过滤器，然后再通过可滤去病原体(如细菌)的第二滤器(如0.22μm的滤器)进行的。
在另一优选例中，所述的步骤(6)中，还包括对所述脂肪提取物进行分装，形 成分装的产品。(所述分装后的提取物可于-20℃保存待用；可低温(如-4℃)或常温解冻后直接使用，或解冻后置于低温(如4℃)保存一段时间，然后使用)。
关节炎
关节炎(arthritis)指发生在人体关节及其周围组织，由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病，临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形，严重者导致关节残疾、影响患者生活质量。
代表性地，本发明所述的关节炎为骨关节炎。
骨关节炎及其症状
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种软骨退行性疾病，起病于关节软骨，逐步侵蚀至软骨下骨及周围组织，导致局灶性、侵蚀性的关节病变，从而引发关节疼痛、关节僵硬、关节肿胀、活动障碍及畸形等症状
在本发明中，所述的骨关节炎的诱导因素很多，病因尚完全清楚，可能与高龄、肥胖、药物、职业性过度使用等因素有关。
在本发明中，所述的骨关节炎中的发生部位并没有特别的限定，例如可以是负重关节及活动量较多的关节，例如颈椎骨、腰椎骨、膝关节骨、髋关节骨等部位的关节炎。
组合物和施用
本发明所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、保健组合物、膳食补充剂等。
代表性地，可将本发明的无细胞脂肪提取物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。
本发明的组合物还可以包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。“药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure PCTCN2021125386-appb-000001
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用，优选的施用方式为口服施用和注射施用。
本发明所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。代表性地，用于口服施用或给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、 乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，。
用于口服施用或给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部施用或给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明无细胞脂肪提取物可以单独施用或给药，或者与其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物联合施用或给药。
施用组合物时，是将安全有效量的本发明无细胞脂肪提取物适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上、食品上或保健品上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
本发明首次发现无细胞脂肪提取物对关节炎及其疼痛和活动障碍症状具有优异的治疗作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
1.实验方法
1.1.无细胞脂肪提取液(Cell free fat extract,CEFFE)的制备
脂肪由自愿者在获得知情同意的条件下获得。无细胞脂肪组织提取液的制备方法如下：
(1)脂肪组织获取自6名常规脂肪抽吸术的健康女性，平均年龄31岁(24-36岁)。局部注射肿胀液麻醉后，使用具有大侧孔(2mm x 7mm)的3mm吸脂抽脂套管连接20mL注射器，人工负压下放射状抽吸，将获得的脂肪直立静止，去除肿胀液后，用生理盐水漂洗3遍。
(2)取经漂洗后的脂肪组织，置于离心管中，放入离心机中以1200g 4℃离心3分钟后，获得分层的混合物。
(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)。
(4)对所述中间层，用2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打30次，从而进行机械乳化，并获得经机械乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)。
(5)将所述经机械乳化的脂肪混合物置入-80℃冰箱冷冻，再进行37℃水浴解冻，单次冻融循环后，将解冻后的脂肪混合物以1200g 4℃离心5分钟，获得分层的混合物，分层的混合物共分为4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层，第四层为细胞/组织碎片沉淀层，去除油层和残余脂肪组织层，吸取液体层，吸取过程中避免细胞/组织碎片沉淀层污染，从而得到脂肪初提取液。
(6)将得到的脂肪初提取液经0.22μm滤器过滤除菌，从而灭菌并去除可能混有的活细胞，从而获得无细胞脂肪提取液(CEFFE)，分装冻存于-20℃保存，使用时4℃解冻。
对制备得到的无细胞脂肪提取液，使用ELISA免疫吸附测定试剂盒检测细胞因子含量，包括IGF-1、BDNF、GDNF、bFGF、VEGF、TGF-β1、HGF和PDGF等细胞因子。6例样本检测平均浓度如下：IGF-1(9840.6pg/ml)、BDNF(1764.5pg/ml)、GDNF(1831.9pg/ml)、bFGF(242.3pg/ml)、VEGF(202.9pg/ml)、TGF-β1(954.5pg/ml)、HGF(898.4pg/ml)和PDGF(179.9pg/ml)。
1.2大鼠骨关节炎(Osteoarthritis,OA)模型建立、分组及给药
碘乙酸钠(Sodium iodoacetate，MIA)是诱导骨关节炎(OA)模型的蟾宫化合物之一，其作用机理是促进活性氧的产生，诱导线粒体膜去极化，进一步增加细胞色素C的释放，激活Caspase3的活性，导致软骨细胞凋亡。
本研究采用MIA膝关节腔内注射方式造模，实验动物选择8周龄雄性SD大鼠。随机选择6只大鼠作为正常对照组，其它大鼠用于OA造模，造模大鼠异氟烷麻醉后，给予左后肢关节腔注射40mg/mL MIA溶液50μL，造模后1周，选 取双足压力差显著升高和左后足Von Frey值显著降低的动物24只OA造模的大鼠，随机分为4组，每组6只。正常对照组和造模后的大鼠给药剂量如下：
表1不同组大鼠的给药剂量
Figure PCTCN2021125386-appb-000002
备注：正常对照组大鼠全程不作任何处理；模型对照组大鼠给予0.9％氯化钠注射液，CEFFE低剂量组、CEFFE中剂量组和CEFFE高剂量组的大鼠分别给予不同剂量的无细胞脂肪提取液(CEFFE)；模型对照组、CEFFE低剂量组、CEFFE中剂量组和CEFFE高剂量组的大鼠均为左侧关节腔内给药，每2周给药1次(共计给药4次)，以给药当天为Day1(计为第1周)。
1.3 Von Frey测试
检测指标：缩爪值(g)。
检测时间：造模前1次、造模后1周、每次给药后1周。
检测方法：将动物放入测试容器中，适应环境10min左右，测定动物左足缩爪压力(当压力达到最大值50g，潜伏期持续至40s，动物仍未出现缩爪反应时，避免造成组织损伤，手动结束，缩爪潜伏期和压力值分别记为40s、50g)，每只足爪测量2～3次，间隔1～3min，取2次结果相近的数据求平均值。(若测量过程因动物自发活动而停止，需间隔1～3min后重新测量，若不确定，可多次测量求平均值，确保动物缩爪是因机械刺激引起的)。
使用仪器：动态足底触觉器(型号：37450；厂家：Ugo Basile)。
1.4双足平衡测量
检测指标：双足压力差值(g)。
检测时间：造模前1次、造模后1周、每次给药后1周。
检测方法：将动物放入容器内，待动物平静下来，左右足在相应的感应区，且显示左右足负重的数字保持相对稳定时(至少持续3s不变)，记录该数据。
使用仪器：双足平衡测试仪(Weight bearing asymmetry)(型号：600MR；厂家：
IITC life science)。
1.5病理组织学检查
末次给药结束后1周、行为学检测结束后，安乐死动物。左侧关节组织生理盐水冲洗，置于10％中性福尔马林溶液中固定，脱钙脱水，切片(沿软骨表面横切2片，5μm/片)，一片HE染色，另一片Safranin O-fast green staining染色。
HE染色采用常规4分级法对显微结果进行分级，分别为轻微(+)、轻度(++)、中度(+++)和重度(++++)，以便于进行组间比较。Safranin O-fast green staining 法每张片子随机选3个视野进行评分，评分标准件下表2：
表2 Safranin O-fast green staining法的评分标准
Figure PCTCN2021125386-appb-000003
Figure PCTCN2021125386-appb-000004
1.6数据统计分析
计量以平均值±标准差来表示，所有数据统计均采用SPSS13.0统计学软件进行，所有数据进行方差齐性检验，具有方差齐性的数据(P>0.05)，进行单因素方差分析，有差异(P≤0.05)的数据进行LSD多重比较分析，以P≤0.05为具有统计学差异；方差不齐的数据(P≤0.05)进行Kruskal-Wallis非参数检验，有差异(P≤0.05)的数据进行Mann-Whitney两两分析比较，以P≤0.05为具有统计学差异。
2结果
2.1 CEFFE治疗对模型大鼠一般情况无明显变化
给药后，各组动物未见死亡或濒死情况。实验终点安乐死时(Day54)，大体观察未见明显异常。给药前各组动物体重相近；给药后各组动物体重随着时间增加，且各时间点体重均相近，各组体重变化情况见图1。
2.2 CEFFE治疗显著提高模型大鼠机械痛阈值
动物造模前后的缩爪压力值变化如图2所示。从图2中可以看出，造模前，造模组和正常对照组大鼠的缩爪压力值相近(28.1±5.0vs 27.8±6.2g，P>0.05)。MIA造模一周后，造模组的缩爪压力值显著低于正常对照组(14.2±3.7vs 32.1±4.1g，P<0.001)，提示MIA成功诱导SD大鼠骨关节炎模型。
各组关节炎模型大鼠给药前后缩爪压力值如图3所示。从图3中可以看出，给药前，模型对照组和CEFFE各剂量组大鼠的缩爪压力值相近，均显著低于正常对照组(P<0.001)。实验过程中，正常对照组大鼠的缩爪压力值在30.0±4.9～44.5±5.2g之间波动。给药后，模型对照组缩爪压力值波动较小，各时间点均显著低于正常对照组(P<0.001)。CEFFE低剂量组缩爪压力值，除第四次给药后1周(即第八周)显著高于模型对照组外(26.2±7.5vs 15.9±4.7g，P<0.01)，其余各时间点均与模型对照组相近。CEFFE中剂量组缩爪压力值，除第四次给药后1周(即第八周)显著高于模型对照组外(25.3±4.3vs 15.9±4.7g，P<0.01)，其余各时间点均与模型对照组相近。CEFFE高剂量组缩爪压力值，第一次给药后一周(即第二周)至实验终点(第四次给药后一周)均显著高于模型对照组(P<0.05～P<0.01)。给药前后各组动物的缩爪压力值变化趋势见图3
因此，从图3可以看出，CEFFE对骨关节炎的疼痛具有优异的治疗效果。
2.3 CEFFE治疗显著降低后肢体重分布差异，减轻模型大鼠症状
大鼠造模前后的双足压力差绝对值如图4所示。从图4中可以看出，造模前，造模组和正常对照组双足压力差绝对值相近(8±5vs9±7g，P>0.05)。MIA造模后一周，造模组的双足压力差绝对值显著高于正常对照组(66±19vs 8±5g，P<0.001)，提示MIA成功诱导骨关节炎模型。动物造模前后的双足压力差绝对值变化见图4。
给药前，模型对照组和CEFFE各组的双足压力差绝对值相近，均显著高于正常对照组(P<0.001)。各组关节炎模型大鼠给药前后的双足压力差绝对值如图5所示，从图5中可以看出，实验给药过程中，正常对照组的双足压力差绝对值在4±2～8±6g之间波动。给药后，模型对照组各时间点双足压力差绝对值均显著高于正常对照组(P<0.01～P<0.001)。CEFFE低剂量组双足压力差绝对值，除第四次给药后1周(即第八周)显著低于模型对照组外(27±8vs 55±19g，P<0.05)，其余各时间点均与模型对照组相近。CEFFE中剂量组双足压力差绝对值，除第三次给药后1周(即第六周)与模型对照组相近，其他时间点均显著低于模型对照组(P<0.05～P<0.01)。CEFFE高剂量组双足压力差绝对值，第一次给药后一周(即第二周)至实验终点(第四次给药后一周)均显著低于模型对照组(P<0.05～P<0.01)。
双足压力差绝对值体现关节负重，差值越小表明负重越接近正常，双足压力差绝能够反映治疗关节炎的综合症状的改善，包括关节疼痛和活动障碍等。从图5可以看出，CEFFE能够改善关节炎及其关节疼痛和活动障碍等症状。
2.4 CEFFE治疗有效改善模型大鼠骨关节炎病变程度
显微镜下，模型对照组动物的膝关节可见轻微至中度关节软骨纤维化、轻度至重度关节软骨细胞数量减少、轻度关节软骨细胞增生/变性及轻微至轻度关节软骨细胞变性/坏死/糜烂；以上病理改变均为骨关节炎的典型病变，表明造模成功。
CEFFE低、中和高剂量组动物的膝关节可见轻微至中度关节软骨纤维化、轻度至中度关节软骨细胞数量减少、轻微至轻度关节软骨细胞增生/变性及轻微至轻度关节软骨细胞变性/坏死/糜烂。与模型对照组动物相比，CEFFE中、高剂量组的以上病变发生率和/或程度降低，表明CEFFE在中、高剂量可改善MIA诱导的大鼠骨关节炎病变程度。Safranin O-fast green staining染色结果表明，与模型对照组相比，CEFFE中、高剂量组Safranin O-fast green staining染色结果的评分有所降低，不同组的大鼠的HE染色和Safranin O-fast green staining染色结果分别如图6和图7所示。
不同组的大鼠的HE染色的组织学结果如下：
图6A.正常对照组(不做任何处理)，实验第54天(Day54)安乐死，膝关节(股骨下端)软骨组织未见明显异常。
图6B.模型对照组(生理盐水注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠)，实验第54天(Day54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见中度关节软骨纤维化及重度关节软骨细胞数量减少。
图6C.CEFFE低剂量组，CEFFE关节腔注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠，实验第54天(Day54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见中度关节软骨纤维化及重度关节软骨细胞数量减少。
图6D.CEFFE中剂量组，CEFFE关节腔注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠，实验第54天(Day54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见轻微关节软骨纤维化及轻微关节软骨细胞数量减少。
图6E.CEFFE高剂量组，CEFFE关节腔注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠，实验第54天(Day54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见轻微关节软骨纤维化及轻微关节软骨细胞数量减少。
其中，不同组大鼠的的膝关节HE染色主要病理改变组间汇总表如表3所示：
表3不同组大鼠的膝关节HE染色主要病理改变组间汇总表
Figure PCTCN2021125386-appb-000005
不同组的大鼠的Safranin O-fast green staining染色(番红O-固绿染色)的组织学结果如下：
图7A.正常对照组，(不做任何处理)，实验第54天(D54)安乐死，膝关节(股骨下端)软骨组织未见明显异常。
图7B.模型对照组，(生理盐水注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠)，实验第54天(D54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见中度关节软骨纤维化及重度关节软骨细胞数量减少。
图7C.CEFFE低剂量组，CEFFE关节腔注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠，实验第54天(D54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见中度关节软骨纤维化及重度关节软骨细胞数量减少。
图7D.CEFFE中剂量组，CEFFE关节腔注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠，实验第54天(D54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见轻微关节软骨纤维化及轻微关节软骨细胞数量减少。
图7E.CEFFE高剂量组，CEFFE关节腔注射给予MIA诱导的骨关节炎模型大鼠，实验第54天(D54)安乐死，膝关节(股骨下端)可见轻微关节软骨纤维化及轻微关节软骨细胞数量减少。
其中，不同组大鼠的膝关节番红O-固绿染色主要病理改变组间汇总表如表4所示：
表4不同组大鼠的膝关节番红O-固绿染色主要病理改变组间汇总表
Figure PCTCN2021125386-appb-000006
Figure PCTCN2021125386-appb-000007
3结论
本研究采用CEFFE关节腔注射，治疗MIA诱导的骨关节炎模型大鼠，行为学研究表明，CEFFE治疗可有效提高模型大鼠机械痛阈值，缓解机械性疼痛，降低双足压力差，减轻骨关节炎导致的后肢负重异常，减轻骨关节炎症状；组织病理学结果同样证实，CEFFE治疗能够有效减轻骨关节炎病变程度，减少软骨组织破坏。综上所述，CEFFE对骨关节炎具有优异的治疗作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

  1. 一种无细胞脂肪提取物的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途：(i)预防和/治疗关节炎；(ii)预防和/治疗疼痛；(iii)活动障碍。
  2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的关节炎包括骨关节炎。
  3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的骨关节炎包括退行性骨关节炎。
  4. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的骨关节炎选自下组：颈椎骨关节炎、腰椎骨关节炎、膝关节骨关节炎、髋关节骨关节炎，或其组合。
  5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的疼痛包括关节炎疼痛；和/或
    所述的活动障碍包括关节炎引起的活动障碍。
  6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的无细胞脂肪提取物含有一种或多种选自下组的组分：IGF-1、BDNF、GDNF、TGF-β1、HGF、bFGF、VEGF、TGF-β1、HGF、PDGF、EGF、NT-3、GH、G-CSF，或其组合。
  7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的无细胞脂肪提取物包括选自下组的一种或多种特征：
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的IGF-1的浓度为5000-30000pg/ml，较佳地6000-20000pg/ml，更佳地7000-15000pg/ml，更佳地8000-12000pg/ml，更佳地9000-11000pg/ml，更佳地9500-10500pg/ml；
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的BDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1850pg/ml；
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的GDNF的浓度为800-5000pg/ml，较佳地1000-4000pg/ml，更佳地1200-2500pg/ml，更佳地1400-2000pg/ml，更佳地1600-2000pg/ml，更佳地1700-1900pg/ml；
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的bFGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地100-500pg/ml，更佳地120-400pg/ml，更佳地150-300pg/ml，更佳地200-280pg/ml，更佳地220-260pg/ml；
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的VEGF的浓度为50-500pg/ml，较佳地100-400pg/ml，更佳地120-300pg/ml，更佳地150-250pg/ml，更佳地170-230pg/ml，更佳地190-210pg/ml；
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的TGF-β1的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地800-1200pg/ml，更佳地800-1100pg/ml，更佳地900-1000pg/ml；
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的HGF的浓度为200-3000pg/ml，较佳地400-2000pg/ml，更佳地600-1500pg/ml，更佳地600-1200pg/ml，更佳地800-1000pg/ml，更佳地850-950pg/ml；和/或
    在所述的无细胞脂肪提取物中，所述的PDGF的浓度为50-600pg/ml，较佳地80-400pg/ml，更佳地100-300pg/ml，更佳地140-220pg/ml，更佳地160-200pg/ml， 更佳地170-190pg/ml。
  8. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的无细胞脂肪提取物包括选自下组的一种或多种特征：
    所述的IGF-1与VEGF的重量比为20-100：1，较佳地30-70：1，更佳地40-60：1，最佳地45-55：1；
    所述的BDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8-9.5：1；
    所述的GDNF与VEGF的重量比为2-20：1，较佳地4-15：1，更佳地6-12：1，最佳地8.5-9.5：1；
    所述的bFGF与VEGF的重量比为0.2-8：1，较佳地0.5-5：1，更佳地0.6-2：1，更佳地0.8-1.6：1，最佳地1-1.5：1；
    所述的TGF-β1与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-6：1；
    所述的HGF与VEGF的重量比为1-20：1，较佳地1-15：1，更佳地1-10：1，更佳地2-8：1，更佳地4-5.5：1；和/或
    所述的PDGF与VEGF的重量比为0.1-3：1，较佳地0.2-2：1，更佳地0.4-1.5：1，最佳地0.7-1.2：1。
  9. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。
  10. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物或制剂的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
  11. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述无细胞脂肪提取物不含有细胞且不含有脂滴。
  12. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述无细胞脂肪提取物为天然获得的无添加成分的纳米脂肪提取物。
  13. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：
    (1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；
    (2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；
    (3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；
    (4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；
    (5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和
    (6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。
  14. 一种无细胞脂肪提取物，其特征在于，所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：
    (1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；
    (2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；
    (3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细 胞的脂肪层)；
    (4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；
    (5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和
    (6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。
  15. 一种组合物或制剂，其特征在于，所述的组合物或制剂包含(a)如权利要求14所述的无细胞脂肪提取物；和(b)药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体或赋形剂。
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