CN106635973A - 一种促进毛发再生的细胞营养液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，主要包括三个步骤步骤：1)ADSCs的原代分离；2)ADSCs的扩大培养；3)ADSCs的诱导培养。本发明制备的细胞营养液可以从细胞再生角度解决脱发问题，ADSCs条件培养液在毛囊周期性重建过程中，能激活毛囊干细胞微环境，调控毛囊正常生长；采用低剂量的UVB照射可以明显的增加ADSCs的存活、迁移、旁分泌能力，血管形成能力以及毛发再生能力；采用成纤维细胞的条件培养液培养ADSCs可以模拟在体环境下细胞的生存代谢过程，促进细胞分泌更多利于细胞微环境调控的细胞因子；同时该方法制备细胞营养液的细胞取材方便，可取材于临床抽脂后的脂肪废弃物及其他外科手术切除的皮片，来源广泛，便于临床推广。

Description

一种促进毛发再生的细胞营养液的制备方法
技术领域
本发明涉及一种促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，具体涉及一种人源性细胞因子生发营养液及其制备方法。
背景技术
近年来，随着社会竞争增加以及环境日益恶化，脱发发生的比例呈上升态势，并且年轻化趋势明显。目前国内外用于治疗脱发的药品主要为西药，如米诺地尔，其经头皮吸收后可扩张头皮下血管，改善毛囊周围的微循环，减少毛囊周围炎症细胞浸润，从而使萎缩的毛囊增大并促进毛发的生长，使毳毛变成终毛；此外，非那雄胺是一种能抑制5α-还原酶的活性以阻止雄性激素合成的药物。但米诺地尔和非那雄胺主要是针对雄激素性脱发有较好的疗效，有一定局限性，且要长期用药，对人体会产生副作用。国内也有很多主要成分为中药的产品，但是由于其成分单一，没有从毛囊生理性生长的角度去解决问题，所以效果并不显著。
随着对毛囊微观结构及毛发再生机理研究的深入，人们发现毛发再生受到毛囊自身干细胞及毛囊周围干细胞微环境的综合调控。干细胞是一类具有自我复制，自我更新的原始细胞，具有向多种组织细胞分化的能力，在体内能通过分泌多种调控因子从而调节组织器官的正常生理代谢。因此，开发针对于毛囊部位干细胞微环境修复的再生产品成为治疗脱发药物的发展趋势。
中国专利CN200510048870.7公开了“一种治疗斑秃药物的制备方法”采用含人AB型血清的基础培养基培养低传代人毛乳头细胞，收集低传代人毛乳头细胞培养上清，将所收集上清液制备成冻干粉。此发明所制备的药物在治疗斑秃中有明显的疗效，且本药物所用细胞和培养血清对人体均无抗原性，克服激素治疗斑秃给人体带来的副作用。但毛乳头细胞的获得是取意外死亡的正常健康青年枕后一手掌大小头皮，而且只能使用低传代人毛乳头细胞的培养上清来制备冻干粉，其取材受限从而注定不能用于临床推广。
中国专利CN101336932A公开了“一种猪毛乳头细胞培养上清的药物在治疗秃发中的应用”采用含人AB型血清的基础培养基培养低传代猪毛乳头细胞，收集细胞培养上清，将所收集的上清液制备成冻干粉用于秃发的治疗。由于猪毛乳头细胞来源广泛，因此可以解决人毛乳头细胞来源有限这一瓶颈，为产业化应用于临床治疗秃发奠定了基础。但是，猪的毛发并不像人的毛发能不断长长，因此，其毛发生长的干细胞调控机制及干细胞微环境和人的毛发生长存在差异，细胞培养后有效成分的种类和含量也存在差异，不利于临床使用。
综上所述，由于现有生发药物不能从细胞再生的角度去解决脱发问题，而现有细胞条件培养液生发成分由于取材受限或者不能用于临床推广，因此，开发一款能从生发本质上解决脱发问题，并且利于临床使用的治疗脱发的药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，主要解决了现有技术中不能从细胞再生的角度去解决脱发问题，同时现有细胞培养液生发成分由于取材受限无法用于临床推广。
本发明的技术方案具体如下：所提供的促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，包括以下步骤：
1]ADSCs的原代分离
将脂肪组织离心处理，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；然后将脂肪颗粒去除结缔组织，剪碎，加入生理盐水进行清洗，离心，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；再加入生理盐水配置的胶原酶溶液，震荡，收集消化液，离心，去除上清，取细胞沉淀；再加入生理盐水，离心，对细胞进行清洗，取细胞沉淀，用1-10ml培养液重悬，接种于培养瓶中，置于恒温培养箱中进行培养；其中，脂肪组织离心目的实去除抽脂前麻醉过程中注射的肿胀液，使脂肪组织纯度更高；去除结缔组织并将组织块剪碎是使胶原酶对脂肪组织消化更充分。
2]ADSCs的扩大培养
将步骤1所得的原代脂肪细胞培养5-7天后，弃去培养液，用PBS清洗一次，用胰酶消化后，根据细胞密度进行1:2-3传代培养(当细胞密度比较大时，进行1:3传代培养；当细胞密度比较小时，进行1：2传代培养)，之后每48-72h传代一次；
3]ADSCs的诱导培养
将步骤2中10代以内ADSCs接种于6孔板中，培养1-2天，弃去培养液，用PBS清洗后，经过UVB照射和成纤维细胞条件培养液处理后，即得促进毛发再生的细胞营养液。其中，UVB照射是由于低剂量的UVB照射可以诱导活性氧的生成，并且可以明显的增加ADSCs的存活能力和旁分泌能力，也能促进ADSCs的血管形成能力以及毛发再生能力；成纤维细胞条件培养的使用是由于成纤维细胞分泌的多种细胞因子可促进贯穿皮下组织、真皮层、表皮层的毛囊器官的正常代谢，因此采用成纤维细胞的条件培养液培养ADSCs可以模拟在体环境下细胞的生存代谢过程，促进细胞分泌更多利于细胞微环境调控的细胞因子。
上述步骤1具体是：将抽脂获得的脂肪组织在1000-2000r/min且温度为21℃条件下离心处理，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；然后将脂肪颗粒去除结缔组织，剪碎，加入等体积的生理盐水进行清洗，在1000-1500r/min且温度为21℃条件下离心，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，震荡消化，收集消化液，在500-1200r/min且温度为21℃条件下离心，去除上清，取细胞沉淀；再加入生理盐水，在500-1500r/min且温度为21℃条件下离心，对细胞进行清洗，取细胞沉淀，用1-10ml培养液重悬，计数后以1×106个细胞/瓶接种于培养瓶中，置于质量浓度为5％的CO2、温度为37℃的恒温培养箱中进行培养。
上述步骤1中生理盐水采用医用质量浓度为0.9％的NaCl注射液。
上述步骤3中成纤维细胞条件培养液是由成纤维细胞培养液和新鲜培养液换液组成。
上述成纤维细胞培养液是通过将原代2-7代成纤维细胞按1-3×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，培养三天后收集培养液制备。其中，成纤维细胞的培养和使用是由于成纤维细胞为真皮层主要结构细胞，在毛囊的生长发育过程中，成纤维细胞通过分泌细胞因子参与毛囊的正常生长代谢；原代2-7代成纤维细胞的选择是由于低代数的原代细胞具有更好的细胞因子分泌功能。
本发明的优点：
1、本发明制备的细胞营养液可以从细胞再生角度解决脱发问题，ADSCs条件培养液在毛囊周期性重建过程中，能激活毛囊干细胞微环境，调控毛囊正常生长。
2、本发明采用低剂量的UVB照射可以明显的增加ADSCs的存活、迁移、旁分泌能力，血管形成能力以及毛发再生能力。
3、本发明采用成纤维细胞的条件培养液培养ADSCs可以模拟在体环境下细胞的生存代谢过程，促进细胞分泌更多利于细胞微环境调控的细胞因子。
4、本发明的制备细胞营养液的细胞取材方便，可取材于临床抽脂后的脂肪废弃物及其他外科手术切除的皮片，来源广泛，便于临床推广。
附图说明
图1是本发明细胞营养液中所含细胞因子检测结果图；
图2是本发明细胞营养液用于小鼠毛发再生效果图。
具体实施方式
毛囊是包围在毛发根部的囊状组织，内层是上皮组织性毛囊，外层是结缔组织性毛囊，内层与表皮相连，外层则与真皮相连。毛囊由毛杆，毛凸，毛球，毛乳头，毛基质等部分组成。神经纤维末梢使毛囊具有感觉的功能，动脉和静脉毛细血管丛给毛囊提供血液。毛囊的最深处是位于角质层3-7mm的毛乳头，它含有神经和血管，向毛杆提供养分。毛囊的发育经过表皮和真皮之间一系列复杂的相互作用而形成，且具有周期性。
皮下脂肪组织是毛囊重建和再生最基本的宏观环境。脂肪组织可取材于临床抽脂后的脂肪废弃物及其他外科手术切除的皮片，来源广泛。脂肪系细胞已被定义为皮肤微环境调控细胞，调节毛囊干细胞的激活。脂肪间充质干细胞(Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)的数目随毛发生长周期发生改变：在毛囊干细胞生长期达到顶峰，并在退行期减小。在毛囊周期性重建过程中，ADSCs最本质的功能是分泌生长因子以激活毛囊干细胞微环境，调控毛囊正常生长。此外，ADSCs具有血管生成以及诱导组织血管再生的能力，能够为毛囊再生提供充足的血液供应。
有研究表明，ADSCs条件培养液可以促进体外培养的毛乳头细胞的增殖，而动物在体实验也表明ADSCs条件培养液可以缩短小鼠毛发再生周期，并且毛发再生部位有大量新血管形成。进一步验证表明，ADSCs条件培养液中VEGF的表达量明显增高。
外部刺激，像低氧，可以诱导ADSCs的增殖、迁移和促进其旁分泌功能，刺激后，ADSCs通过生成活性氧(Reactive oxygen species，ROS)而促进伤口愈合和毛发再生。紫外线B(Ultraviolet B，UVB)，像低氧一样，是调节ROS形成的重要因素。作为一种电磁辐射，UVB比可见光和紫外线A的波长都短，在280-315nm之间。皮肤上照射UVB，可诱导维生素D的生成，而且很多种短时UVB照射受益于身体都是与维生素生成有关。已有研究表明，低剂量的UVB照射可以明显的增加ADSCs的存活、迁移、旁分泌能力，血管形成能力以及毛发再生能力。
由于在毛囊的生长发育过程中，上皮组织成分、真皮组织成分及皮下组织都参与其干细胞微环境的再造过程，因此，如果体外培养的细胞模拟体内的生存环境，细胞合成和分泌的蛋白质就更接近于在体内环境下蛋白质的生成。
成纤维细胞(Fibroblast，Fb)是真皮层的一种具有增殖及分化能力的细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，也具有干细胞的特性，有明显的蛋白质合成和分泌功能，对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。同时，由于真皮层细胞微环境还能为表皮层及皮下组织层提供必需的营养供给，如成纤维细胞分泌的多种细胞因子可促进贯穿皮下组织、真皮层、表皮层的毛囊器官的正常代谢。因此，采用成纤维细胞的条件培养液(Fibroblastconditioned medium，Fb-CM)培养ADSCs可以模拟在体环境下细胞的生存代谢过程，促进细胞分泌更多利于细胞微环境调控的细胞因子。
以下结合实施例对本发明的技术方案进一步详细说明：
实施例1：
步骤一：ADSCs的原代分离
将抽脂获得的脂肪组织1500r/min，21℃离心5min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，加入等体积生理盐水进行清洗，1000r/min，21℃离心10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，200U/ml，37℃，恒温震荡消化60min，收集消化液，800r/min，21℃离心10min，去除上清，取细胞沉淀，再加入5ml生理盐水，800r/min，21℃离心10min，对细胞进行清洗，取细胞沉淀，用3ml培养液重悬，计数后以1×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养；
步骤二：ADSCs的扩大培养
将步骤一原代脂肪细胞培养5天后，弃去培养液，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)清洗一次，用0.25％胰酶消化后，进行1:2传代培养。以后每48h传代一次。
步骤三：成纤维细胞条件培养液的准备
将第5代成纤维细胞按2×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，培养三天后收集培养液，用于ADSCs的诱导。
步骤四：ADSCs的诱导培养
将步骤二中的第5代ADSCs以1.3×105个细胞/孔接种于6孔板中，培养24h后，弃去培养液，用2ml PBS清洗两次后，分为不同的处理组，分别为对照组、UVB组、Fb-CM组、UVB+Fb-CM组四组。对照组为正常培养的ADSCs，UVB组为UVB照射处理的ADSCs，Fb-CM组为成纤维细胞条件培养液处理的ADSCs、UVB+Fb-CM组为UVB和成纤维细胞条件培养液同时处理的ADSCs。UVB照射处理为每孔加入1ml PBS，用UVB 30mJ/cm2照射4min，后弃去PBS；成纤维细胞条件培养液处理为用70％的步骤三中收集的成纤维细胞培养液和30％的新鲜培养液换液，重新进行细胞的培养。
实施例2：
步骤一：ADSCs的原代分离
将抽脂获得的脂肪组织2000r/min，21℃离心3min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，加入等体积生理盐水进行清洗，1500r/min，21℃离心3min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，200U/ml，37℃，恒温震荡消化30min，收集消化液，1000r/min，21℃离心8min，去除上清，取细胞沉淀，再加入8ml生理盐水，1000r/min，21℃离心8min，对细胞进行清洗，取细胞沉淀，用5ml培养液重悬，计数后以1×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养；
步骤二：ADSCs的扩大培养
将步骤一原代脂肪细胞培养6天后，弃去培养液，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)清洗一次，用0.25％胰酶消化后，进行1:2传代培养。以后每48h传代一次。
步骤三：成纤维细胞条件培养液的准备
将第2代成纤维细胞按1×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，培养三天后收集培养液，用于ADSCs的诱导。
步骤四：ADSCs的诱导培养
将步骤二中的第3代ADSCs以1×105个细胞/孔接种于6孔板中，培养24h后，弃去培养液，用1ml PBS清洗两次后，分为不同的处理组，分别为对照组、UVB组、Fb-CM组、UVB+Fb-CM组四组。对照组为正常培养的ADSCs，UVB组为UVB照射处理的ADSCs，Fb-CM组为成纤维细胞条件培养液处理的ADSCs、UVB+Fb-CM组为UVB和成纤维细胞条件培养液同时处理的ADSCs。UVB照射处理为每孔加入1ml PBS，用UVB 10mJ/cm2照射5min，后弃去PBS；成纤维细胞条件培养液处理为用50％的步骤三中收集的成纤维细胞培养液和50％的新鲜培养液换液，重新进行细胞的培养。
实施例3：
步骤一：ADSCs的原代分离
将抽脂获得的脂肪组织1000r/min，21℃离心10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，加入等体积生理盐水进行清洗，1200r/min，21℃离心5min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，200U/ml，37℃，恒温震荡消化45min，收集消化液，1200r/min，21℃离心5min，去除上清，取细胞沉淀，再加入10ml生理盐水，1500r/min，21℃离心5min，对细胞进行清洗，取细胞沉淀，用10ml培养液重悬，计数后以1×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养；
步骤二：ADSCs的扩大培养
将步骤一原代脂肪细胞培养7天后，弃去培养液，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)清洗一次，用0.25％胰酶消化后，进行1:3传代培养。以后每72h传代一次。
步骤三：成纤维细胞条件培养液的准备
将第7代成纤维细胞按3×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，培养三天后收集培养液，用于ADSCs的诱导。
步骤四：ADSCs的诱导培养
将步骤二中的第8代ADSCs以3×105个细胞/孔接种于6孔板中，培养24h后，弃去培养液，用2ml PBS清洗两次后，分为不同的处理组，分别为对照组、UVB组、Fb-CM组、UVB+Fb-CM组四组。对照组为正常培养的ADSCs，UVB组为UVB照射处理的ADSCs，Fb-CM组为成纤维细胞条件培养液处理的ADSCs、UVB+Fb-CM组为UVB和成纤维细胞条件培养液同时处理的ADSCs。UVB照射处理为每孔加入1ml PBS，用UVB 100mJ/cm2照射3min，后弃去PBS；成纤维细胞条件培养液处理为用30％的步骤三中收集的成纤维细胞培养液和70％的新鲜培养液换液，重新进行细胞的培养。
对制备的促进毛发再生的细胞营养液进行功能评价，具体如下：
对步骤四中不同处理换液后的ADSCs继续培养48h后，收集上清，进行不同条件处理下条件培养液毛发再生功效的验证。用PBS清洗细胞两次，用Trizol试剂进行裂解并提取RNA，通过RT-PCR实验进行基因水平细胞因子表达量检测。
动物实验是公认的直观评价产品毛发再生功能的在体实验。其具体操作步骤为：用松香/蜡混合物拔毛法对小鼠进行背部脱毛，诱导生长期毛发，将脱毛后的小鼠分为对照组、UVB组、Fb-CM组、UVB+Fb-CM组四组。对照组为正常培养的ADSCs，UVB组为UVB照射处理的ADSCs，Fb-CM组为成纤维细胞条件培养液处理的ADSCs、UVB+Fb-CM组为UVB和成纤维细胞条件培养液同时处理的ADSCs。脱毛后每隔5天，每组条件培养液以200ul/cm2进行脱毛部位皮下注射，其余时间每天均匀涂抹，观察小鼠背部皮肤颜色变化和毛发生长情况。
细胞实验可以客观的检测不同处理下细胞营养液中各种细胞因子的含量，为最优化的细胞处理工艺的选择提供理论依据。其具体操作步骤为：将对照组、UVB组、Fb-CM组、UVB+Fb-CM组细胞收集条件培养液后，用PBS清洗两次，每孔加入1ml Trizol裂解液，静置5min后收样于无酶1.5ml EP管中。按照Trizol试剂盒细胞样品RNA提取步骤，进行RNA的抽提。抽提完成后，进行RNA浓度及A260/A280的测定。按照PrimeScript 1st Strand cDNASynthesiskit逆转录试剂盒的说明书进行RNA逆转，并以cDNA为模板用RT-PCR检测目的基因表达。
通过RT-PCR的方法，对不同处理条件下ADSCs基因水平表达干细胞因子(Stemcell factor，SCF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子-β(Transforming growth factor beta，TGF-β)、肝细胞生长因子(Hepatocytegrowth factor，HGF)、纤维母细胞生长因子7(Fibroblast growth factor 7，FGF7)、纤维母细胞生长因子5(Fibroblast growth factor 5，FGF5)的量进行检测。结果表明，UVB+Fb-CM组SCF、VEGF、TGF-β、HGF、FGF7的表达量明显高于其余各组，这些细胞因子在毛发再生过程中，通过促进毛囊干细胞增殖、缩短毛乳头细胞生长停滞期、促进血管发生及组织再生等不同的作用调控毛囊生长周期，促进毛发再生。而FGF5通过阻断毛乳头细胞的激活，抑制毛发生长。本研究结果表明，不同处理组FGF5的表达量没有显著性差异，见附图1。
不同处理调价下收集到的条件培养液用于脱毛小鼠21天后效果图。从结果可知，UVB+Fb-CM组小鼠毛发生长最好，脱毛区域已经全部长出毛发；对照组仍有部分区域未长出毛发。UVB组和Fb-CM组的毛发再生效果优于对照组，但均劣于UVB+Fb-CM组，见附图2。

Claims (5)

1.一种促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)ADSCs的原代分离
将脂肪组织离心处理，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；然后将脂肪颗粒去除结缔组织，剪碎，加入生理盐水进行清洗，离心，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；再加入生理盐水配置的胶原酶溶液，震荡，收集消化液，离心，去除上清，取细胞沉淀；再加入生理盐水，离心，对细胞进行清洗，取细胞沉淀，用1-10ml培养液重悬，接种于培养瓶中，置于恒温培养箱中进行培养；
2)ADSCs的扩大培养
将步骤1所得的原代脂肪细胞培养5-7天后，弃去培养液，用PBS清洗一次，用胰酶消化后，进行1:2-3传代培养，之后每48-72h传代一次；
3)ADSCs的诱导培养
将步骤2中10代以内ADSCs接种于6孔板中，培养1-2天，弃去培养液，用PBS清洗后，经过UVB照射和成纤维细胞条件培养液处理后，即得促进毛发再生的细胞营养液。
2.根据权利要求1所述的促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体是：
将抽脂获得的脂肪组织在1000-2000r/min且温度为21℃条件下离心处理，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；然后将脂肪颗粒去除结缔组织，剪碎，加入等体积的生理盐水进行清洗，在1000-1500r/min且温度为21℃条件下离心，去除液体部分，得固态的脂肪颗粒；再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，震荡消化，收集消化液，在500-1200r/min且温度为21℃条件下离心，去除上清，取细胞沉淀；再加入生理盐水，在500-1500r/min且温度为21℃条件下离心，对细胞进行清洗，取细胞沉淀，用1-10ml培养液重悬，计数后以1×106个细胞/瓶接种于培养瓶中，置于质量浓度为5％的CO2、温度为37℃的恒温培养箱中进行培养。
3.根据权利要求1或2所述的促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，其特征在于：所述步骤1中生理盐水采用医用质量浓度为0.9％的NaCl注射液。
4.根据权利要求1所述的促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，其特征在于：所述步骤3中成纤维细胞条件培养液是由成纤维细胞培养液和新鲜培养液换液组成。
5.根据权利要求4所述的促进毛发再生的细胞营养液的制备方法，其特征在于：所述成纤维细胞培养液是通过将原代2-7代成纤维细胞按1-3×106个细胞/瓶接种于75cm2培养瓶中，培养三天后收集培养液制备。
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