CN109554431A - 一种通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法 - Google Patents
一种通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明实施例提供一种通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，涉及生物技术领域，利用MTT检测方法作为体外评价生发冻干粉活性的标准，其操作方法简单，实用性强，可作为后期不同批次冻干粉使用前活性评价的参考依据，解决了生发冻干粉活性评价的问题，克服了批次间生发冻干粉活性检验的困扰。该通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法为首先制备人源性毛囊干细胞，并将生长期的毛囊干细胞胰酶消化后制备单细胞悬液，培养过夜之后给与生发冻干粉共培养，并设置不加冻干粉的细胞对照组，利用MTT方法进行吸光值的检测，获得生发冻干粉加入组与细胞对照组的吸光值，以此判定冻干粉的活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法。
背景技术
随着社会竞争加剧，社会压力增大，脱发的发病率逐年上升，且呈现出愈来愈年轻化的趋势。近年来，在我国各大医院脱发患者的门诊量在不断上升。脱发给患者的生活、精神和心理带来了极大的压力。目前临床上治疗脱发的药物主要是非那雄胺和米诺地尔，尽管使用后部分患者症状有所改善，但也因人而异，个别患者也会出现不良反应，并不能从根本上解决脱发的问题。因此有调查显示，约98%的脱发患者在使用了现有的防治脱发药物半年无效后会选择弃用。植发是近几年流行的新型技术，患者一般在中西药治疗无效之后会选用植发，但植发需要从自身后枕部健康毛发区取材再植入至前额、头顶等脱发区域，虽然有部分毛囊会在新部位生长，但对于头发本身稀疏的患者来说，这种“拆东墙补西墙”的做法并不能增加自身毛囊，且操作时间长，有严重痛苦感，价格昂贵，术后效果不能保证，还可能伴随有感染、肿胀等并发症出现，因此开发新的有效的生发药物有巨大的临床意义。
随着对脱发机理的逐渐认识及毛囊微观水平认知的不断提高，人们意识到毛发再生受到毛囊干细胞及其周围微环境的调控。干细胞是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，具有向多种组织细胞分化的能力，因此开发针对于毛囊部位干细胞微环境修复的再生产品成为治疗脱发药物的发展趋势。
具有生发功效的冻干粉是一种在无菌环境下将富含多种生发因子的药液冷冻呈固态，抽真空将水分升华干燥后而成的无菌粉注射剂，内含多种高浓度有效成分，便于运输，使用方便。现有的研究发现毛囊及其周围组织能通过自分泌和旁分泌产生一些生物活性因子，经各种途径影响和调控毛发的生长发育和生长周期。其中，促进毛囊生长的细胞因子主要有：肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor basic，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，因此富含以上生长因子的冻干粉为防治脱发提供了新的思路。但是，这类冻干粉如若批次间质量控制不严格或运输不当，就会造成有效成分降解、生物活性下降的结果，从而影响其生发的效果。因此，含生长因子类的生发冻干粉在使用前保证因子活性是取得生发效果的前提条件，而如何验证冻干粉是否具有生发活性成为首要解决的问题。
中国专利CN200710093074.4公开了“一种人源性细胞因子生发剂及其制备方法”是将人成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞的培养上清液制成蛋白冻干粉末，之后将冻干粉末包封在脂质膜中，经过旋转蒸发，冻干后制成易于透过皮肤屏障，更加稳定的冻干粉。此发明所制备的冻干粉用于生发领域，但目前未见有实验验证其冻干粉活性的报道。
毛囊中存在着多种细胞，包括隆突部的毛囊干细胞，真皮的毛乳头细胞和上皮的内、外根鞘细胞。毛囊干细胞是位于毛囊隆突区的多能干细胞，是毛囊周期性变化的种子细胞，能分化为毛囊及毛发中的各型细胞、皮脂腺等，其周期性的增殖和分化维持了毛发的正常生长、脱落和更替，在表皮损伤后还能参与表皮的损伤和修复，成为表皮干细胞的来源。研究证实，毛囊干细胞在瘢痕性脱发和非瘢痕性脱发疾病中对毛囊的分化及生长均起到了重要的支持作用，因此毛囊干细胞对于研究脱发及生发具有重要的意义。此外由于毛囊干细胞相较于毛乳头细胞、毛母质细胞及内外根鞘细胞更容易分离、培养，且培养基简单，传代多次也可用于体外研究，因此在冻干粉活性体外验证层面上选择毛囊干细胞作为靶细胞更具有说服力。
MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝）染色又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在特定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。由于该方法灵敏度高、耗时较短，且费用便宜，目前已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。因此，在验证生发冻干粉活性选择此方法作为评判标准具有快速、灵敏度高、经济的优点。
发明内容
本发明实施例提供了一种通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，利用MTT检测方法作为体外评价生发冻干粉活性的标准，其操作方法简单，实用性强，可作为后期不同批次冻干粉使用前活性评价的参考依据，解决了生发冻干粉活性评价的问题，克服了批次间生发冻干粉活性检验的困扰。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明的技术方案是具体如下：所提供的一种通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，包括以下步骤：
（1）人源性毛囊干细胞（HFSCs）的制备
将收集的植发后剩余毛囊清洗两遍后，在体式显微镜下去掉毛囊末端膨大部，剩余部分选择用组织贴壁法进行贴壁培养，3-7d后有细胞爬出。待细胞爬出面积增大后，轻轻消化细胞，并扩大化培养得到HFSCs。
待HFSCs细胞生长至对数期，胰酶消化后，制备HFSCs单细胞悬液，并种植于96孔培养板中，37℃, 5%CO2培养箱中培养24h。
（2）待检测生发冻干粉与HFSCs共培养
将待检测的生发冻干粉完全溶于完全培养基中，制备成样品培养基；将不加待检测生发冻干粉的培养基做为对照培养基，两种培养基分别加入已贴壁的96孔板相对应的孔中，每孔200uL，37℃, 5%CO2培养箱中共培养48h。
（3）MTT检测
弃掉96孔板的培养上清，加入MTT使各孔细胞染色，每孔200uL，37℃, 5%CO2培养箱中孵育4h后，吸弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）溶解，震荡后在酶标仪570nm处测定各组细胞吸光度值，并将各组细胞吸光度值作对比，以此判定待检生发冻干粉的活性。
上述步骤（1）具体是：将临床植发后剩余的毛囊无菌运输至超净工作台中，用含有双抗的PBS清洗两遍后，在体式显微镜下筛选具有完整结构的毛发（含毛囊和毛干）。用镊子轻轻去除多余脂肪组织，留下含完整的毛囊的毛发。PBS再次清洗后，沿着毛囊末端膨大部2-3mm的部位剪掉膨大部，剩余组织蘸取少量培养液，轻轻贴附于六孔板中，每孔放置5-6个组织。37℃, 5%CO2条件下过夜培养后，补加细胞培养液，并逐日观察细胞爬出情况，每3-4天换液一次。待细胞爬出面积变大时，胰酶消化细胞，传代并扩大化培养。待细胞长至生长期时，消化细胞并计数制备单细胞悬液，以2*104个/mL的密度接种于96孔板中，设置生发冻干粉组和细胞对照组，每组设置6个重复，每孔200uL悬液，37℃，5%的CO2培养箱培养1d。
上述步骤（2）具体是：无菌打开待检测的生发冻干粉一支，加入完全培养基5mL，轻轻晃动混合均匀，并静置5-10min，使冻干粉完全溶解，即得样品培养基，将不加待检测生发冻干粉的培养基做为对照培养基，并根据样品培养基的渗透压，向对照培养基中加入适量甘露醇加以调节，使样品培养基渗透压等于对照培养基渗透压；之后将样品培养基加入96孔板中的生发冻干粉细胞中，即得生发冻干粉加入组，将对照培养基加入未加生发冻干粉的细胞中，称为细胞对照组，两组细胞于37℃, 5%CO2条件下培养48h。
上述步骤（3）具体是96孔板培养48h后，弃掉培养基上清，PBS清洗一遍，之后每孔加入200uL的MTT工作液，于37℃, 5%CO2条件下避光培养4h。之后轻轻吸弃上清，每孔加入150uL的DMSO，避光在振荡器中振荡5-10min，立即于570nm波长处测定吸光度值。对比生发冻干粉组和细胞对照组吸光度值，评价生发冻干粉活性。
所述步骤（1）中，HFSCs的消化采用0.25%胰蛋白酶消化液，消化时间为2-5min，消化液进行800rpm/min，离心5min，得到的沉淀即为毛囊干细胞，其细胞培养液为DMEM培养液，内含10-20%FBS、500ug/mL氢化可的松、1mg/mL胰岛素、20ug/LEGF及20ug/L FGF。
所述步骤（2）中，生发冻干粉组和细胞对照组每组设置6个细胞重复孔，每孔细胞密度为2*104/mL。
所述步骤（3）中，MTT工作液浓度为0.5mg/mL，吸光值的测定使用BioTek Epoch酶标仪。
以上所述实验需至少重复3次后，结果显示生发冻干粉加入组吸光值显著高于细胞对照组吸光值至少1倍以上，且有显著性差异（p﹤0.05）时，可推断冻干粉有活性。
本发明用于使用前人源性生发冻干粉活性的把控，评价冻干粉能否通过促进毛囊干细胞的增殖达到生发的目的。本发明具有以下优点：相对于其他细胞，毛囊干细胞为毛发中最具代表性的细胞，利用此细胞来验证冻干粉有无活性最具有说服力，且高代次也可用于毛发相关实验。此外，首次将HFSCs用于生发冻干粉活性的检测，为今后生发育发类产品的体外功效评价提供了参考资料。
附图说明
图1为HFSCs原代培养示意图；
图2为与待检测生发冻干粉共培养前后，HFSCs状态示意图；
图3为与市售生发冻干粉共培养前后，HFSCs状态示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.人源性毛囊干细胞（HFSCs）的制备
将临床植发后剩余的毛囊无菌运输至超净工作台中，用含有双抗的PBS清洗两遍后，在体式显微镜下筛选具有完整结构的毛发（含毛根和毛干）。用镊子轻轻去除多余脂肪组织，留下含完整的毛囊的毛发。PBS再次清洗后，沿着毛囊末端膨大部2-3mm的部位剪掉膨大部，剩余组织蘸取少量培养液，轻轻贴附于六孔板中，每孔放置5-6个组织。37℃, 5%CO2条件下过夜培养后，补加细胞培养液，并逐日观察细胞爬出情况，每3-4天换液一次。
待细胞爬出面积变大约占据六孔板一半时，用0.25%的胰酶消化细胞，消化时间控制在2-5min，终止消化后细胞悬液经800rpm/min离心5min，弃掉上清，沉淀即为HFSCs。将此细胞悬浮，传代并扩大化培养。待细胞长至生长期时，弃掉培养液，PBS清洗两遍，加入0.25%的胰酶消化液消化细胞，终止消化后细胞悬液经800rpm/min离心5min，弃掉上清，沉淀中加入培养液悬浮并计数，制备单细胞悬液，以2*104个/mL的密度接种于96孔板中，设置生发冻干粉组和细胞对照组，每组设置6个重复，每孔200uL悬液，于37℃，5%的CO2培养箱培养24h。
2.待检测生发冻干粉与HFSCs共培养
无菌打开待检测的生发冻干粉一支，加入完全培养基5mL，轻轻晃动混合均匀，并静置5-10min，使冻干粉完全溶解，即得样品培养基，并测定样品培养基渗透压为553.9mOsM；将不加待检测生发冻干粉的培养基做为对照培养基，并根据样品培养基的渗透压，向对照培养基中加入4%的甘露醇加以调节，使样品培养基渗透压等于对照培养基渗透压；之后将培养过夜的96孔板取出，弃掉孔内上清液，将样品培养基加入96孔板中的生发冻干粉细胞中，即得生发冻干粉加入组，将对照培养基加入未加生发冻干粉的细胞中，称为细胞对照组，两组细胞于37℃, 5%CO2条件下培养48h。
3.MTT检测
弃掉已培养48h的96孔板中的上清，PBS清洗两遍后加入200uL的MTT工作液使各孔细胞染色，避光于37℃, 5%CO2培养箱中孵育4h后，吸弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）溶解，并于振荡器上以100rpm/min的速率震荡5-10min后在酶标仪570nm处测定各组细胞吸光度值，计算生发冻干粉加入组吸光值平均值与细胞对照组吸光度值平均值，并作对比，以此判定待检生发冻干粉的活性。
表1 待检测生发冻干粉活性检验结果
| 本底对照OD值 | 细胞对照组OD值 | 生发冻干粉加入组OD值 | |
| 0.054 | 0.8207 | 1.1953 | |
| 0.053 | 0.7949 | 1.3120 | |
| 0.052 | 0.8366 | 1.2318 | |
| 0.051 | 0.8290 | 1.2111 | |
| 0.052 | 0.8305 | 1.0157 | |
| 0.051 | 0.8402 | 1.3049 | |
| 平均值 | 0.0522 | 0.8253 | 1.2118 |
| 扣除本底值 | —— | 0.7731 | 1.1597 |
| 倍数 | —— | —— | 1.5001 |
结果：给与待检测生发冻干粉前，各组HFSCs细胞状态良好，无污染现象（图2-A）；加入生发冻干粉与HFSCs共培养后，细胞增殖良好，形态正常，无细胞死亡、崩解现象出现（图2-B），说明该生发冻干粉对细胞生长无毒性作用。经MTT检测结果显示（表1），生发冻干粉加入组吸光值高于细胞对照组吸光值接近1.5倍，且两组吸光值对比有极显著性差异（p﹤0.01），判定此生发冻干粉活性良好。
实施例2：
市售生发冻干粉对HFSCs体外细胞增殖的影响
1.HFSCs使用前鉴定
（1）镜下观察
在HFSCs细胞胰酶消化的当天，对培养瓶中的上清液进行颜色观察，在倒置显微镜下观察细胞形态、细胞密度、有无细菌或霉菌生长。如有可疑，需抽样作无菌试验培养细菌、霉菌。
（2）活细胞比例：在HFSCs细胞胰酶消化的当天对收集的细胞悬液抽样检查活细胞比例占95％以上。
2.市售生发冻干粉与HFSCs共培养后细胞增殖的检测
将已证明具有促进毛发再生功效的市售生发冻干粉加入HFSCs共培养，以正常HFSCs为对照。共培养48h后，加入MTT工作液孵育培养4h，之后弃掉液体，加入150uL的DMSO，振荡后于570nm处测定吸光度值，之后进行数据分析。
表2 市售生发冻干粉活性检验结果
| 本底对照OD值 | 细胞对照组OD值 | 市售生发冻干粉加入组OD值 | |
| 0.053 | 0.8607 | 0.9989 | |
| 0.053 | 0.8549 | 0.9970 | |
| 0.054 | 0.8366 | 1.0212 | |
| 0.052 | 0.8499 | 1.0010 | |
| 0.051 | 0.8350 | 1.0035 | |
| 0.051 | 0.8432 | 1.0108 | |
| 平均值 | 0.0525 | 0.8467 | 1.0055 |
| 扣除本底值 | —— | 0.7942 | 0.9530 |
| 倍数 | —— | —— | 1.1999 |
结果：给与市售生发冻干粉前，HFSCs细胞状态较好，细胞无污染现象（图3-A）；冻干粉与HFSCs共培养后，细胞增殖良好，形态正常，无细胞死亡、崩解现象出现（图3-B），说明该生发冻干粉对细胞生长无毒性作用；MTT结果显示（表2），该市售生发冻干粉作用于HFSCs细胞模型上，相对于细胞对照组，吸光度值明显升高，将近1.2倍，且两组数据相比有极显著性差异（p﹤0.01），与其宣传功效相一致。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）收集植发后剩余毛囊，原代分离培养后获得人源性毛囊干细胞（HFSCs）；
（2）分别将处于生长期的HFSCs消化后制备单细胞悬液，并于96孔板中培养过夜；
（3）将待检测的生发冻干粉溶解于完全培养基中获得样品培养基，并测定其渗透压；将未加待检测生发冻干粉的培养基作为对照培养基，并调节渗透压等于样品培养基渗透压；
（4）将权利要求（3）中的各培养基分别加入权利要求（2）中96孔板对应的孔板中，相同条件下进行培养；
（5）对所获得的不同组别细胞进行MTT染色和吸光值检测，通过对比二者的吸光值，获得生发冻干粉加入组相对于细胞对照组的吸光值，以此判定冻干粉的活性。
2.根据权利要求1所述的通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（1）中人源性毛囊干细胞（HFSCs）的获得，具体为：HFSCs的经过一次分离扩增后，所获得的细胞可持续用于后续检测的进行。
3.根据权利要求1所述的通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（2）中单细胞悬液的制备，具体为：所述HFSCs单细胞悬液以4*104个/mL的量加入96孔板中，每孔200uL悬液，并于37℃, 5%CO2培养箱中培养过夜。
4.根据权利要求1所述的通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（3）中的完全培养基中，血清的含量为10%-20%。
5.根据权利要求1所述的通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（3）中的对照组培养基为使渗透压等于样品培养基，对照组培养基中加入甘露醇作为渗透压调节剂。
6.根据权利要求1所述的通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（4）中的培养基加入96孔板中，具体为：样品培养基加入生发冻干粉细胞组，称为生发冻干粉加入组；对照培养基加入未加生发冻干粉细胞组，称为细胞对照组；培养条件为37℃， 5%CO2培养箱中培养48h。
7.根据权利要求1所述的通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（5）中的MTT检测方法，具体为：吸去所述96孔板中各个孔内的液体，将MTT加入所述各个孔内对细胞进行染色；4h后吸去上清液，各孔加入二甲基亚砜，并于酶标仪中震荡，在570nm波长下读取生发冻干粉加入组和细胞对照组吸光值。
8.根据权利要求1所述的通过毛囊干细胞体外增殖评价生发冻干粉活性的方法，其特征在于，所述（5）中的MTT检测方法，具体为：评价生发冻干粉活性，细胞增殖实验重复至少三次，且生发冻干粉加入组吸光值高于细胞对照组吸光值至少1倍，且有显著性差异（p﹤0.05）时，判定此生发冻干粉有促进毛发生长的活性。
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| Title |
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| 王泽等: "重组人角质细胞生长因子- 2 对实验秃毛大鼠的毛发再生作用" * |
| 马丽等: "重组人角质细胞生长因子2 在伤口愈合及 毛发再生方面的影响" * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317404A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-12 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3d毛囊干细胞的培养方法 |
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