CN102747029B - 一种视网膜祖细胞培养方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种视网膜祖细胞培养方法及视网膜祖细胞培养基。本发明所述细胞培养方法使贴壁或悬浮细胞生长在有一定三维空间结构的细胞外基质中，有效提高细胞的生长速率，防止细胞出现老化或分化，且不改变细胞的基因表达，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统培养方法细胞产量小、质量差等局限性，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种细胞培养方法及培养基。
背景技术
视网膜退行性疾病是当今全球主要致盲性疾病，该类疾病如视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）的主要特征是视网膜感光细胞死亡。由于人类视网膜细胞属于神经细胞，没有再生能力，所以目前最有效的治疗方法是替代或修复受损的视网膜感光细胞。
过去的几十年，在医药再生领域应用干/祖细胞移植方法诱导组织重建和功能再生已经吸引人们广泛的兴趣，特别是在视网膜再生领域已经取得了很多令人为之兴奋的成果。2004年科学家研究发现将视网膜祖细胞移植到受损的动物模型眼中后，这些移植的细胞可以形成成熟的视网膜神经细胞，包括视网膜节细胞和感光细胞等，并且可以迁移到受损细胞周围，一定程度的修复和替代受损细胞。视网膜祖细胞具有较成体细胞具有较强的增殖和分化潜能，免疫原性极低，无致瘤性，且来源于特定的组织减少了分化的问题，所以成为理想的再生医学领域内的种子细胞。
传统的视网膜祖细胞培养技术采用的是二维贴壁法，其与细胞生长的天然状态不同，不符合细胞体内生存环境，因而细胞的生长繁殖速度、基因表达、信号传导和形态学都可能与天然有异，且其常用的细胞外基质材料是纤维蛋白。纤维蛋白来源于患者自身的血浆中，其采集过程给患者造成痛苦，且可能由于血浆的大量流失导致患者出现身体疾病。应用异体来源或动物来源的纤维蛋白培养细胞都会造成外源物质的污染，且实验成本高，又难于满足临床和科研的广泛推广应用。传统的视网膜祖细胞用无血清培养基培养易导致细胞产量小，胎牛血清培养基由于含有异源成份不能满足临床的需要。
发明内容
为了克服现有技术的上述问题，本发明提供一种细胞培养方法，包含以下步骤：
步骤1：取海藻酸钠粉末与溶剂混合，混合均匀加热制成海藻酸钠凝胶，灭菌备用；
步骤2：收集成球培养的细胞，离心取沉淀，用培养基混匀细胞，种植在铺有海藻酸钠凝胶的细胞培养装置中进行培养；
所述培养基配方为DMEM/F12培养液，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10-20ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10-20ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为10-20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为10-20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为10-20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为10-20ng/ml神经营养物质-3（NT-3）以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
作为优选，所述细胞为视网膜祖细胞或神经干细胞。
本发明所述培养基为无血清无动物源性培养基，能够高效的促进视网膜细胞的生长和繁殖，防止细胞过早老化或分化。
海藻酸钠(C5H7O4COONa)n是含在海带、海藻等褐藻类植物中的有机高分子电解物之一，与其它一些物质构成细胞膜的主要成份。海藻酸钠的化学成份属于碳水化合物，是海藻酸的钠盐，与淀粉、纤维素相比仅含有游离羧基（-COONa），从化学结构上看是由甘露糖醛酸和古罗糖醛酸共聚而成的一种链状高分子杂聚物。海藻酸钠为白色或淡黄色粉末，几乎无臭无味。海藻酸钠溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。溶于水成粘稠状液体，1％水溶液pH值为6-8。当pH＝6-9时粘性稳定，加热至80℃以上时则粘性降低。
海藻酸钠自身带有二价阴离子，在二价阳离子存在条件下可交联形成网状水凝胶，该凝胶为细胞的生长提供了三维空间，又因其具有较好的亲水性，营养物质易于渗透扩散，酶解产物对细胞无毒害作用，故非常适宜细胞生长需要。海藻酸钠凝胶具有三维网状空间结构，当细胞在这种材料中培养时可以有效的模拟体内细胞生长环境，能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，从而培养出的细胞更加接近体内真实环境的细胞。本发明所述细胞培养方法可以使贴壁或悬浮细胞生长在有一定三维空间结构的细胞外基质中，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统培养方法细胞产量小、质量差等局限性。
美国食品和药品监督管理局（FDA）要求治疗用细胞制品体外培养时间不应超过五周，传统的细胞培养方法培养到第五周时也很难得到满足临床需要的细胞量，应用三维培养方法，二周或三周可到的产量就远远满足于临床的需要。本发明所述细胞培养方法使细胞在三维空间内形成排列有序的细胞球，随着细胞的生长，细胞长成梭型，2周即可获得大量的细胞。通过实验证明，三维空间方法培养的细胞基因表达和自我增殖能力均未发生变化，细胞具有高效的向其它胚层分化的能力，同时易于外源基因的转染。
作为优选，所述培养基配方为DMEM/F12基础培养基，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为20ng/ml神经营养物质-3（NT-3）以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
更优选地，所述溶剂为水或平衡盐溶液。
在本发明的具体实施例中，海藻酸钠粉末与溶剂的重量比例为2:100-5:100。
更为优选，所述加热为加热至55℃。
试验证实，应用本发明所述方法培养视网膜祖细胞或神经干细胞，从第1代开始细胞迅速增殖，与传统培养方法相比，细胞的生长繁殖数量提高3-5倍，且所培养的细胞仍处于旺盛的增殖期，未出现衰老迹象；体外培养第10代的视网膜祖细胞或神经干细胞仍具有相应祖细胞或干细胞的特性，且具有分化成成熟成体细胞的能力。
本发明还具体提供一种细胞培养基，所述培养基配方为：DMEM/F12培养液，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10-20ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10-20ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为10-20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为10-20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为10-20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为10-20ng/ml神经营养物质-3（NT-3）以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
更优选地，所述培养基配方为DMEM/F12基础培养基，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为20ng/ml神经营养物质-3（NT-3）以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
本发明的另一个目的是提供上述培养基在培养视网膜祖细胞或神经干细胞中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明应用海藻酸钠作为细胞外基质材料，使用安全方便又降低了实验成本，适合于大面积推广应用。
2、本发明所述培养方法可以防止细胞出现老化或分化，不改变细胞的基因表达。
3、本发明所述细胞培养方法使贴壁或悬浮细胞生长在有一定三维空间结构的细胞外基质中，有效提高了细胞的生长速率，与传统培养方法相比，细胞的生长繁殖数量提高3-5倍，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统培养方法细胞产量小、质量差等局限性。
附图说明
图1为MTT法测定细胞生长曲线结果。
图2为流式细胞仪检测细胞周期结果。
图3为流式细胞仪检测细胞相关蛋白表达的结果。
图4为Hoechst33342（红色）为细胞核染色，视网膜祖细胞nestin染色（绿色）阳性，证明此细胞为视网膜祖细胞。
图5为Hoechst33342（红色）为细胞核染色，Ki-67染色（绿色）阳性，证明细胞仍处于增殖期。200倍观察。Ki-67是一种存在于增殖细胞核基质内的抗原，它可以敏感地反映出细胞的增殖活性。
图6：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，星形胶质细胞标志物GFAP染色（红色）阳性，细胞经过诱导分化可以形成星形胶质细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化成成熟视网膜细胞的能力。
图7：细胞核染色Hoechst33342（红色）阳性，成熟神经元标志物MAP-2染色(绿色)阳性，细胞经过诱导分化可以形成神经元细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化成成熟视网膜细胞的能力。
图8：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，双极细胞标志物PKC-α染色（红色）阳性，细胞经过诱导分化可以形成视网膜双极细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化成成熟视网膜细胞的能力。
图9：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，无长突神经细胞标志物Pax6染色（红色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成无长突神经细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化为成熟视网膜细胞的能力。
图10：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，神经丝蛋白标志物NF-200染色（绿色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成成熟神经细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化为成熟视网膜细胞的能力。
图11：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，光感受器细胞标志物recoverin染色（绿色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成视网膜光感受器细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化为成熟视网膜细胞的能力。
图12：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，视杆细胞标志物Rhodopsin染色（绿色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成视杆细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化为成熟视网膜细胞的能力。
具体实施方式
本发明公开了一种细胞培养方法及培养基，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：本发明所述培养方法进行视网膜祖细胞培养
视网膜祖细胞的成球培养：组织消毒后，取视网膜组织，用酶消化后，1000r离心3分钟，取沉淀，用DMEM/F12基础培养基（加入N-2添加物，浓度为1：100、表皮生长因子EGF、浓度为10ng/ml、碱性生长因子bFGF、浓度为10ng/ml、L-谷氨酰胺、浓度1：100）混匀沉淀计数、按照1-2×105/cm2接种于低吸附的T25培养瓶中，置于37℃，5%CO2恒温培养箱内培养，次日细胞成球。
海藻酸钠凝胶的制备：以去离子水作为海藻酸钠的溶剂，先称取海藻酸钠粉末，将粉末缓缓加入装有少量溶剂（20ml）的离心管中，同时边加粉末边加剩余溶剂，最后用旋涡混合器震荡5min后55℃水浴加热过夜，次日高压蒸汽灭菌，然后在超净工作台内灌装于细胞培养瓶中，恢复到室温既可以使用。
视网膜祖细胞的三维空间培养：细胞成球后，收集细胞液离心，收集沉淀，用视网膜专用培养基混匀细胞，种植铺有海藻酸钠凝胶的细胞培养瓶中，细胞即能在海藻酸钠凝胶的三维空间中快速生长和繁殖。
视网膜专用培养基由DMEM/F12基础培养基、N-2添加物（浓度为1：100）、表皮生长因子EGF（浓度为10ng/ml）、碱性生长因子bFGF（浓度为10ng/ml）、L-谷氨酰胺（浓度1：100）、三碘甲状腺氨酸T3（浓度为20ng/ml）、神经营养素NT4（浓度为20ng/ml）、神经生长因子NGF（浓度为20ng/ml）、神经营养物质-3（NT-3）（浓度为20ng/ml）组成。
实施例2：MTT法测定细胞活性和增殖率
参照实施例1所述实验方法，取第3代对数生长期视网膜祖细胞，制备单细胞悬液，按750个细胞/孔接种于铺有海藻酸钠凝胶并含实施例1制备的培养基的96孔培养板中6d内每天进行MTT试验。同时设立传统培养方法对照，即以悬浮或贴壁方式培养视网膜祖细胞，培养基为10%-20%的血清培养基。
每孔细胞加入10μl MTT（1g/L），继续培养4h。离心去除培养液，加入二甲亚砜裂解细胞，570nm波长下测定OD值。以未加MTT孔为本底，其余孔的OD值扣除本底后均以该组未铺凝胶孔为基准换算成百分数。
MTT法测定本发明所述方法培养的细胞活性和增殖率见图1，细胞传代周期为3-5天，从图中可以看出，应用本专利所述方法从第1代开始细胞迅速增殖，与传统培养方法相比，细胞的生长繁殖数量提高3-5倍。
实施例3：流式细胞仪检测细胞周期
取用实施例1所述方法培养的视网膜祖细胞1×106个，加入碘化丙啶PI染料，染色20min，加入PBS离心清洗后，流式细胞仪检测细胞所在周期。细胞周期检测采用PI（碘化丙锭）染色检测细胞周期，可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。
图2及图3检测的细胞为第10代细胞，从图2中可以看出应用本专利方法培养的细胞仍处于旺盛的增殖期，未出现衰老迹象；图3流式细胞术鉴定结果证明体外培养第10代的视网膜祖细胞均表达视网膜祖细胞标记物Nestin和Sox-2，表明体外培养第10代的视网膜祖细胞仍具有祖细胞的特性，仍为视网膜祖细胞。
实施例4：免疫荧光细胞化学染色鉴定细胞
按照实施例1所述方法培养视网膜祖细胞后，将长有细胞的盖玻片或滴有细胞的载玻片经蒸馏水洗后，滴加正常山羊血清或兔血清封闭液，室温20min，甩掉不洗；分别滴加稀释的一抗，4℃过夜；次日PBS洗涤后滴加1:100稀释的荧光二抗，4℃避光2h，PBS洗后，甘油(9份甘油+1份P B S)封片；荧光倒置显微镜下观察、照相。
实验结果见图4-12。
图4为Hoechst33342（红色）为细胞核染色，视网膜祖细胞nestin染色（绿色）阳性，证明此细胞为视网膜祖细胞。
图5为Hoechst33342（红色）为细胞核染色，Ki-67染色（绿色）阳性，证明细胞仍处于增殖期。200倍观察。Ki-67是一种存在于增殖细胞核基质内的抗原，它可以敏感地反映出细胞的增殖活性。
图6：DAPI（蓝色）为细胞核染色，星形胶质细胞标志物GFAP染色（红色）阳性，细胞经过诱导分化可以形成星形胶质细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化成成熟视网膜细胞的能力。
图7：Hoechst33342（红色）为细胞核染色，成熟神经元标志物MAP-2染色(绿色)阳性，细胞经过诱导分化可以形成神经元细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化成成熟视网膜细胞的能力。
图8：DAPI（蓝色）为细胞核染色，双极细胞标志物PKC-α染色（红色）阳性，细胞经过诱导分化可以形成视网膜双极细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化成成熟视网膜细胞的能力。
图9：DAPI（蓝色）为细胞核染色，无长突神经细胞标志物Pax6染色（红色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成无长突神经细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化成成熟视网膜细胞的能力。
图10：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，神经丝蛋白标志物NF-200染色（绿色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成成熟神经细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化为成熟视网膜细胞的能力。
图11：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，光感受器细胞标志物recoverin染色（绿色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成视网膜光感受器细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化为成熟视网膜细胞的能力。
图12：细胞核染色DAPI（蓝色）阳性，视杆细胞标志物Rhodopsin染色（绿色）为阳性，细胞经过诱导分化可以形成视杆细胞，证明本专利方法培养的细胞具有分化为成熟视网膜细胞的能力。
实施例5：脑源性神经干细胞培养方法
本发明所述方法及培养基可用于培养脑源性神经干细胞，视网膜祖细胞是神经外胚层发育而成，与脑源性神经干细胞来源于同一胚层，所以细胞具有很多相似的特性。
脑源性神经干细胞的成球培养：组织消毒后，分离取出端脑，用酶消化后，1000r离心3分钟，取沉淀，用DMEM/F12基础培养基（加入N-2添加物，浓度为1：100、表皮生长因子EGF、浓度为10ng/ml、碱性生长因子bFGF、浓度为10ng/ml、L-谷氨酰胺、浓度1：100）混匀沉淀计数、按照1-2×105/cm2接种于低吸附的T25培养瓶中，置于37℃，5%CO2恒温培养箱内培养，次日细胞成球。
细胞成球后，收集细胞液离心，收集沉淀，用本发明所述培养基混匀细胞，种植铺有海藻酸钠凝胶的细胞培养瓶中，细胞即能在海藻酸钠凝胶的三维空间中快速生长和繁殖。
上述培养基由DMEM/F12基础培养基、N-2添加物（浓度为1：100）、表皮生长因子EGF（浓度为10ng/ml）、碱性生长因子bFGF（浓度为10ng/ml）、L-谷氨酰胺（浓度1：100）、三碘甲状腺氨酸T3（浓度为20ng/ml）、神经营养素NT4（浓度为20ng/ml）、神经生长因子NGF（浓度为20ng/ml）、神经营养物质-3（NT-3）（浓度为20ng/ml）组成。
参照实施例2-4的方法用MTT法测定第10代细胞的细胞活性和增殖率，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光细胞化学染色鉴定细胞，证明培养获得细胞具有为脑原性神经干细胞，具备干细胞特性，处于旺盛的增殖期，具有分化能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种细胞培养方法，包含以下步骤：
步骤1：取海藻酸钠粉末与溶剂混合，混合均匀加热制成海藻酸钠凝胶，灭菌备用；
步骤2：收集成球培养的细胞，离心取沉淀，用培养基混匀细胞，种植在铺有海藻酸钠凝胶的细胞培养装置中进行培养；
所述培养基配方为DMEM/F12培养液，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10-20ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10-20ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为10-20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为10-20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为10-20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为10-20ng/ml神经营养物质-3以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，所述细胞为视网膜祖细胞或神经干细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养基配方为DMEM/F12基础培养基，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为20ng/ml神经营养物质-3以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
4.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，所述溶剂为水或平衡盐溶液。
5.根据权利要求1或4所述的细胞培养方法，其特征在于，海藻酸钠粉末与溶剂比例为2:100-5:100。
6.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，所述加热为加热至55℃。
7.一种细胞培养基，其特征在于，所述培养基配方为：DMEM/F12培养液，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10-20ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10-20ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为10-20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为10-20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为10-20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为10-20ng/ml神经营养物质-3以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
8.根据权利要求7所述的培养基，所述培养基配方为DMEM/F12基础培养基，添加终浓度为1:100的N-2添加物，终浓度为10ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为20ng/ml神经营养物质-3以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。
9.权利要求7或8所述培养基在培养视网膜祖细胞或神经干细胞中的用途。
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