CN102960244B - 一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物组培技术领域，提供了一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖；该将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法采用荧光显微镜观察克雷伯氏菌标记菌株的侵染和定殖，以抗生素抗性标记法和平板分离计数法调查克雷伯氏菌标记菌株的种群动态，为具有固氮菌的健康种苗的推广应用及固氮菌与甘蔗的互作研究提供参考依据，具有较强的推广与应用价值。

Description

一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，尤其涉及一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法。

背景技术

甘蔗健康种苗具有生长速度快、分蘖力强、成茎率高、产量高、用种量少等优点，是保证蔗糖业持续发展的重要措施之一。国家对甘蔗健康种苗的推广也非常重视。2011年，国家农业部在广西、云南、广东和海南4省(区)启动实施甘蔗健康种苗示范推广工作。世界甘蔗生产大国如巴西、古巴、美国、澳大利亚等国90％蔗区实现了甘蔗生产用种健康种植，使得甘蔗优良品种的种性得以保持，其产量和质量得到进一步提高。据报道，巴西在生产上使用健康种苗可使甘蔗增产20％-40％(个别蔗区增产高达60％)(Urquiaga et al.，1992)。沈万宽等(2009)报道，粤糖00-236健康种苗较其普通种茎苗蔗茎产量增产10.6％(小区试验)和9.1％(大面积示范)，甘蔗蔗糖分提高0.26个百分点，且萌芽快，萌芽率较普通种茎苗提高22.94个百分点。杨本鹏等(2010)报道，种植脱毒健康种苗可以使甘蔗单位面积产量提高23.0％～40.2％，蔗糖分含量提高0.51％～1.01％绝对值。

甘蔗作为世界主要的糖料和能源作物，氮肥的使用量对甘蔗的生产成本影响较大，若能降低氮肥的使用量，不仅可减少甘蔗的生产投入，也可减少对环境的污染。早在60年代，Dǒbereiner(1966)首次从甘蔗根部发现固氮菌后，甘蔗体内的固氮微生物种类越来越丰富，如例如醋酸杆菌、成团泛菌、草螺菌、克雷伯氏菌、巴西固氮螺菌、假单胞菌等(Cavalcante et al.，1988；Asis et al.，2000；Govindarajan et al.，2007；罗霆等，2010)。不同的甘蔗品种对接种的固氮菌的反应也不一样，有些是固氮菌种类的差别引起的，有的则是由于其基因型以及环境条件的差别引起的。甘蔗生物固氮研究表明某些甘蔗品种获得其氮素总量的30-70％左右，但是植物组织培养技术在去除一些病原微生物的同时，也会降低甘蔗体内的固氮菌数量，(Lima et al.，1987；Urquiaga et al.，1992)，若能在组培苗中接种固氮菌，对甘蔗健康种苗的推广计划则有更大推动作用。关于在甘蔗上接种固氮菌目前主要有两种方法，一是种茎进行浸种处理，二是对组培苗进行接种处理。接种固氮菌能不同程度提高各品种器官中细菌的固氮酶活性，巴西固氮甘蔗品种表现出比广西主栽甘蔗品种更强的固氮酶活性，且对接种固氮菌反应更敏感(林丽等，2008)欧阳雪庆等(2010)利用固氮菌液浸泡甘蔗单芽进行浸种处理，结果表明接种甘蔗内生固氮菌对甘蔗叶片硝酸还原酶活性和谷氨酰胺合成酶活性具有普遍而明显的促进作用，而对谷草转氨酶与谷丙转氨酶的影响则因甘蔗品种差异表现出不同效果。黄杏等(2009)研究报道了接种固氮菌能够提高甘蔗根系活力、蛋白质含量以及碳水化合物含量等。吴凯超等(2010)以伤口侵染法将菌液接种到甘蔗苗内发现，接种内生固氮菌可在不同程度上促进不同基因型甘蔗植株的生长，增加株高、茎径、平均节间长度和单茎重。Reis等(2006)将生根后的组培苗分成单株，用剪刀剪伤根系，50毫升MS培养基，加入0.1ML10⁸-19CFU/ML培养好的菌液体，培养后发现接种处理可以提高甘蔗产量和氮肥利用率。

生物标记是在基因表达定位、细菌接种植物后侵染植物过程以及在植物组织中定殖观察的研究中非常有效的一种方法(Haseloff，et al.，1998)。绿色荧光蛋白(GFP)基因是从水母Aquoria victoria中克隆到的，它作为一种看得见的生物标记广泛应用到基因表达和许多不同种类有机物的蛋白质亚细胞定位，在植物与根瘤菌以及植物与内生固氮菌的研究中有较好的应用(Singh et al.，2009)。

克雷伯氏菌DX120是从广西本地主栽品种新台糖22(ROC22)中分离到的一株具有高固氮活性的重要内生固氮菌，它可以在甘蔗组培苗的根中定殖并能进行固氮作用(林丽，2011)，揭示它具有较好的应用前景。本研究直接在甘蔗组培苗生根后，在液体培养基壮苗的同时，就接入一定量的固氨菌，简化了接种方法。而且研究了DX120在不同的甘蔗品种以及接种更长时间定殖存活能力。因此我们设计了以DX120不同的菌液浓度接种两种固氮能力不同甘蔗品种(B8和GT21)的组培苗后，研究它的定殖能力，以及同一接种浓度在不同时间和不同组培苗部位的菌群动态变化，探索一种较简单的接种方法，同时比较不同菌液浓度对这两种甘蔗品种组培苗的侵染和定殖能力差异，研究结果为进一步研究该固氮菌株与甘蔗的互作提供参考依据。

发明内容

本发明提供了一种将国氮菌引入甘蔗组培苗的方法，旨在解决现有技术提供的将固态氮引入到甘蔗组培苗的方法，存在引入过程复杂，成本高，效果不显著的问题。

本发明的目的在于提供一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，该方法包括以下步骤：

在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；

利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；

测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；

用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖。

进一步，所述在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养的实现方法为：

在无菌操作的条件下切取以上两个甘蔗品种的茎尖以上约2-4cm处的顶端分生组织接到添加3.0mgL^-12，4-D的固体MS培养基上诱导愈伤组织；

在完全黑暗的条件下培养40天后再把愈伤组织接到添加2.0mgL^-16-BA和0.2mgL^-1NAA的固体MS培养基上进行苗分化培养；

分化苗再用添加3.0mgL^-1NAA和2.0mgL^-1IBA的固体MS培养基上诱导生根，生根后再转入添加有1.0mgL^-1NAA和1.0mgL^-1IBA的液体MS培养基上进行壮苗培养。

进一步，所述愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养时的的传代培养周期均为30天。培养条件为白天28℃培养16小时，晚上25℃培养8小时，光照强度为2000Lx，固体MS培养基在进行121℃、20min的高压灭菌前，将pH值调到5.8。

进一步，所述利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理的实现方法为：

将克雷伯氏菌的标记菌株在LB液体培养基中培养，在37℃、200r/min条件下过夜培养至LB液体培养基浑浊；

取10μl菌悬液到50ml加有抗生素的LB液体培养基中，在37℃、200r/min条件下过夜培养至在600nm下的吸光度为0.8左右；

在4000×g、10min、4℃的条件下，离心收集菌体，用无菌的pH值为7.4的磷酸缓冲液悬浮至10¹²CFU/ml，再用磷酸缓冲液稀释，获得一定浓度的菌悬液；

把已生根的甘蔗组培苗在超净工作台中分成单株，转到装有50ml不含维生素的1/10MS液体培养液的500ml培养瓶中，并加入一定浓度的菌悬液。

进一步，所述LB液体培养基包含10gL ^-1 蛋白胨、5gL ^-1 酵母提取物、5gL ^-1 NaCl，并且在对LB液体培养基高压灭菌前将pH值调到7.0。

进一步，所述测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态的实现方法为：

取甘蔗组培苗分为根、叶鞘、和叶片三部分或根和苗两部分先在75％酒精中浸泡30s，再用1％的次氯酸钠表面消毒1min，然后用无菌水漂洗4次，每次1分钟；

用无菌滤纸轻轻吸干甘蔗组培苗上选取部分的水分后分别称取质量；

将甘蔗组培苗吸干水分的部分放到灭过菌的研钵中研磨成匀浆后加9ml灭菌的磷酸缓冲液混匀并转移到无菌的试管中，混匀后用无菌水进行10倍系列稀释，进行根、叶鞘和叶片内克雷伯氏菌标记菌株的分离；

取菌悬液100μl加到含有抗生素的LB平板中，均匀涂布后用封口膜封好，放到37℃的培养箱中倒置培养24小时后进行计数。

进一步，克雷伯氏菌标记菌株分离用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的固体LB培养基。

进一步，所述用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖的实现方法为：

分别在接种后2天和15天取甘蔗组培苗的根和叶片，用无菌水洗去根表面上附着的固氮菌，并进行灭菌处理；

将叶片横切面的徒手切或整体根在无菌水中铺展于载玻片上，再盖上盖玻片，把制作好的玻片置于荧光显微镜下观察，由低倍到高倍，拍照。

进一步，所述10²CFU/ml克雷伯氏菌标记菌株的接种浓度就可保证标记菌株进入甘蔗体内并积累定殖。

进一步，所述克雷伯氏菌的标记菌株携带有绿色荧光蛋白基因、四环素及氨苄青霉素抗性基因，四环素使用浓度为15μg/mL，氨苄青霉素使用浓度为100μg/mL。

本发明提供的将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖；该将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法采用荧光显微镜观察克雷伯氏菌标记菌株的侵染和定殖，以抗生素抗性标记法和平板分离计数法调查克雷伯氏菌标记菌株的种群动态，为具有固氮菌的健康种苗的推广应用及固氮菌与甘蔗的互作研究提供参考依据，具有较强的推广与应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例提供的将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法的流程图；

图2是本发明实施例提供的不同接种水平下液体培养基中的种群动态的示意图；

图3是本发明实施例提供的不同接菌水平下甘蔗各组织中的种群动态的示意图；

图4是本发明实施例提供的克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗不同部位的种群动态的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

图1示出了本发明实施例提供的将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法的流程。

该方法包括以下步骤：

在步骤S101中，在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；

在步骤S102中，利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；

在步骤S103中，测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；

在步骤S104中，用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖。

在本发明实施例中，在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养的实现方法为：

在无菌操作的条件下切取以上两个甘蔗品种的茎尖以上约2-4cm处的顶端分生组织接到添加3.0mgL^-12，4-D的固体MS培养基上诱导愈伤组织；

在完全黑暗的条件下培养40天后再把愈伤组织接到添加2.0mgL^-16-BA和0.2mgL^-1NAA的固体MS培养基上进行苗分化培养；

分化苗再用添加3.0mgL^-1NAA和2.0mgL^-1IBA的固体MS培养基上诱导生根，生根后再转入添加有1.0mgL^-1NAA和1.0mgL^-1IBA的液体MS培养基上进行壮苗培养。

在本发明实施例中，愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养时的的传代培养周期均为30天。培养条件为白天28℃培养16小时，晚上25℃培养8小时，光照强度为2000Lx，固体MS培养基在进行121℃、20min的高压灭菌前，将pH值调到5.8。

在本发明实施例中，利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理的实现方法为：

将克雷伯氏菌的标记菌株在LB液体培养基中培养，在37℃、200r/min条件下过夜培养至LB液体培养基浑浊；

取10μl菌悬液到50ml加有抗生素的LB液体培养基中，在37℃、200r/min条件下过夜培养至在600nm下的吸光度为0.8左右；

在4000×g、10min、4℃的条件下，离心收集菌体，用无菌的pH值为7.4的磷酸缓冲液悬浮至10¹²CFU/ml，再用磷酸缓冲液稀释，获得一定浓度的菌悬液；

把已生根的甘蔗组培苗在超净工作台中分成单株，转到装有50ml不含维生素的1/10MS液体培养液的500ml培养瓶中，并加入一定浓度的菌悬液。

在本发明实施例中，LB液体培养基包含10gl-1蛋白胨、5gl-1酵母提取物、5gl-1NaCl，并且在对LB液体培养基高压灭菌前将pH值调到7.0。

在本发明实施例中，测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态的实现方法为：

取甘蔗组培苗分为根、叶鞘、和叶片三部分或根和苗两部分先在75％酒精中浸泡30s，再用1％的次氯酸钠表面消毒1min，然后用无菌水漂洗4次，每次1分钟；

用无菌滤纸轻轻吸干甘蔗组培苗上选取部分的水分后分别称取质量；

将甘蔗组培苗吸干水分的部分放到灭过菌的研钵中研磨成匀浆后加9ml灭菌的磷酸缓冲液混匀并转移到无菌的试管中，混匀后用无菌水进行10倍系列稀释，进行根、叶鞘和叶片内克雷伯氏菌标记菌株的分离；

取菌悬液100μl加到含有抗生素的LB平板中，均匀涂布后用封口膜封好，放到37℃的培养箱中倒置培养24小时后进行计数。

在本发明实施例中，克雷伯氏菌标记菌株分离用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的固体LB培养基。

在本发明实施例中，用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖的实现方法为：

分别在接种后2天和15天取甘蔗组培苗的根和叶片，用无菌水洗去根表面上附着的固氮菌，并进行灭菌处理；

将叶片横切面的徒手切或整体根在无菌水中铺展于载玻片上，再盖上盖玻片，把制作好的玻片置于荧光显微镜下观察，由低倍到高倍，拍照。

在本发明实施例中，10²CFU/ml克雷伯氏菌标记菌株的接种浓度就可保证标记菌株进入甘蔗体内并积累定殖。

在本发明实施例中，克雷伯氏菌的标记菌株携带有绿色荧光蛋白基因、四环素及氨苄青霉素抗性基因，四环素使用浓度为15μg/mL，氨苄青霉素使用浓度为100μg/mL。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

1.1供试菌株：

克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)是从甘蔗体内分离得到的一株固氮菌，本实验所使用的是携带有绿色荧光蛋白基因和四环素及氨苄青霉素抗性基因的DX120标记菌株。四环素使用浓度为15μg/mL，氨苄青霉素使用浓度为100μg/mL。

1.2甘蔗组培苗的培养：

在无菌操作的条件下切取以上两个甘蔗品种的茎尖以上约2-4cm处的顶端分生组织接到添3.0mgL^-12，4-D的固体MS培养基上诱导愈伤组织，在完全黑暗的条件下培养30天后再把愈伤组织接到添加2.0mgL^-16-BA和0.2mgL^-1NAA的固体MS培养基上进行苗分化培养。分化苗再用添加3.0mgL^-1NAA和2.0mgL^-1IBA的固体MS培养基上诱导生根，生根后再转入添加有1.0mgL^-1NAA和1.0mgL^-1IBA的液体MS培养基上进行壮苗培养，以上各阶段的传代培养周期均为30天。培养条件为白天28℃培养16小时，晚上25℃培养8小时，光照强度为2000Lx。以上所用培养基在进行高压灭菌(121℃，20min)前将pH值调到5.8。

1.3菌悬液的制备及接菌处理：

将带有绿色荧光蛋白基因的菌株DX120从-80℃中取出后用LB液体培养基(10gL ^-1 蛋白胨、5gL ^-1 酵母提取物、5gL ^-1 NaCl，高压灭菌前将pH值调到7.0)，37℃、200r/min过夜培养至培养基浑浊后再取10μl菌悬液到50ml加有抗生素的LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养至在600nm下的吸光度为0.8左右，离心(4000×g，10min，4℃)，收集菌体，用无菌的pH值为7.4的磷酸缓冲液(PBS)悬浮至10¹²CFU/ml，再用磷酸缓冲液稀释，分别调节到10¹⁰、10⁸、10⁶、10⁴、10²CFU/ml用来做不同梯度浓度接菌实验。

把已生根的两个甘蔗品种组培苗在超净工作台中分成单株，选取长势基本一致的单株组培苗转到装有50ml不含维生素的1/10MS液体培养液的500ml培养瓶中，每个品种分7组处理(每个处理三瓶，每瓶5株苗)做不同接菌浓度实验，分别记做A、B、C、D、E、F、CK。A组：接菌浓度为10¹²CFU/ml菌悬液；B组：接菌浓度为10¹⁰CFU/ml菌悬液；C组：接菌浓度为10⁸CFU/ml菌悬液；D组：接菌浓度为10⁶CFU/ml菌悬液；E组：接菌浓度为10⁴CFU/ml菌悬液；F组：接菌浓度为10²CFU/ml菌悬液；对照组(CK)：接同样剂量的无菌水，以上各组的接种剂量均为1ml/瓶。

1.4标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态测定

取甘蔗组培苗分为根、叶鞘、和叶片三部分或根和苗两部分用无菌滤纸轻轻吸干水分后分别称取质量。各部分先在75％酒精中浸泡30s，再用1％的次氯酸钠表面消毒1min，然后用无菌水漂洗4次，每次1分钟。用无菌滤纸吸干水分后，放到灭过菌的研钵中研磨成匀浆后加9ml灭菌的磷酸缓冲液(pH值7.4)混匀并转移到无菌的试管中，混匀后用无菌水进行10倍系列稀释(盛有样品的悬液为原液，其稀释度为0次方)，进行根、叶鞘和叶片内标记菌株的分离。分离用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的固体LB培养基。分别取每种稀释浓度的悬液100μl加有抗生素的LB平板中，均匀涂布后用封口膜封好，放到37℃的培养箱中倒置培养24小时后便可进行计数。每浓度均3个重复，选取菌落数在30-300个范围内的平板统计每皿菌落数，计算平均每克根、叶鞘和叶片(鲜重)内标记菌株的数量，同时把最后一次漂洗的无菌水以及对照不接菌的根、叶鞘和叶的匀浆涂到同样的抗性平板上检查是否有菌落出现。

1.5用荧光显微镜检测标记菌株在甘蔗组织体内的定殖

分别在接种后2天和15天取甘蔗组培苗的根和叶片(每1株苗为一个重复，每次三个重复)，用无菌水洗去根表面上附着的固氮菌，并按上述方法进行灭菌处理。将叶片横切面的徒手切或整体根在无菌水中铺展于载玻片上，再盖上盖玻片，把制作好的玻片置于荧光显微镜下观察，由低倍到高倍，拍照。

2.1不同接菌水平下培养基中标记菌株DX120的群体密度

从图2可以看出，A：B8品种；B：GT21品种，当接种浓度为10²CFU/ml时，两个甘蔗品种培养基中的菌落数都表现为接种后第10天高于接种后第5天；而在高于10²CFU/ml的接种浓度时(10⁴，10⁶，10⁸，10¹⁰和10¹²CFU/ml)，则均表现出接种后10天培养基中的细菌量要低于接菌5天后培养基中的细菌量或基本维持不变。对于甘蔗品种B8，接种不同浓度的固氮菌后，培养基中的菌落数在两次测定时各处理间都达到显著水平，而GT21，在各处理接种后第5天，10⁶，10⁸，10¹⁰CFU/ml处理间差异不显著，接种后第10天，10⁴，10⁸CFU/ml处理间也未达到显著水平。这说明固氮菌DX120能利用培养基以及组培苗的根部分泌物进行繁殖，并且接种浓度在10⁴CFU/ml以上均在接种10天前细菌则在培养基中已经达到繁殖盛期，而接种浓度为10²则在接种10天后仍细菌在培养基中表现出能继续繁殖增长的趋势。总体上看，固氮菌DX120在GT21组培苗培养基中的总活菌量的下降速度要比B8品种的要慢。

2.2.不同接菌水平下甘蔗组培苗不同时间不同部位标记菌株的数量

不同接菌水平在两个甘蔗品种不同部位的菌落动态变化如图3所示，其中，A：B8根；B：B8根以上部分；C：GT21根；D：GT21根以上部分。从实验结果可以看出，用不同浓度梯度的菌液(从10²到10¹²CFU/ml培养基)接种两个品种的甘蔗组培苗，菌株均能进入植株根部并在根部定殖，同时能向植株根以上部分迁移并积累定殖。与GT21品种相比，应用低浓度的接种液，接菌菌更容易进入B8品种，并且其根和地上部分中细菌菌落量更高。6个接菌浓度在B8和GT21两个品种组培苗的根内部定殖的细菌量均表现出在接菌后7天或15天时达到最高峰，在30天时菌表现出下降的趋势，然而在根以上部分(叶鞘和叶)内部定殖的菌群数则表现出两个品种在不同的接菌浓度下达到菌群数量最高峰的时间不同，GT21品种要比B8品种晚。这可能与品种的基因型差异有很大关系。

2.3.标记菌株DX120在甘蔗品种B8和GT21组培苗体内各组织的群体动态，图4为菌株DX120在甘蔗组培苗不同部位的种群动态；A：B8品种，最初接种浓度为1×108cfu/ml；B：GT21品种，最初接种浓度为1×108cfu/ml。

限菌条件下，在接菌(接菌浓度为10²CFU/ml)后不同时间，通过平板计数分离法检测固氮能力较强的巴西引进品种B8和固氮能力相对较弱的广西主栽品种GT21的组培苗不同组织内可分离培养菌株的群体密度，作图(4-A，B)。结果表明，固氮菌DX120E在两个甘蔗品种中的群体动态图呈相似的的趋势，即植株的根、叶鞘和叶内固氮菌DX120的群体密度在初始(2d)的短暂迅速上升后便维持不变或缓慢下降，两个品种的叶中固氮菌数量均在两天达到一个高峰后开始出现下降趋势，在10天达到最低点后又开始逐渐上升直到实验结束。固氮菌DX120在两个甘蔗品种体内各组织的菌群密度菌表现为根＞叶鞘＞叶，说明内生固氮菌在甘蔗中的定殖是一个动态分布的过程，由根部入侵后从植物体内上升迁移到叶鞘和叶，并能在各组织中定殖，且在整个实验过程中维持一定的群体密度。通过比较两个品种各组织中的固氮菌群体动态，发现B8品种在根、叶鞘和叶中均比GT21具有更高的固氮菌群体密度，说明固氮菌在B8品种各组织中具有比GT21更强的内生和迁移定殖能力。

2.4.标记菌株DX120在GT21甘蔗组培苗根和叶中的定殖，荧光显微镜观察克雷伯氏菌DX120接种2天和15天后在根部的定殖。

A：标记菌株在根毛区的根毛附近大量聚集(接种后2d)；B：标记菌株在主根的边缘处大量聚集(接种后2d)；C：标记菌株在侧根断裂处聚集并有伤口进入根内(接种后2d)；D：标记菌株在主根和侧根连接处聚集并由边缘裂隙处侵入根内(接种后2d)；E：标记菌株在主根的细胞间隙中大量聚集和定殖(接种后15d)；F：标记菌株在根冠处开始在根表面形成侵染线并向根中部迁移(接种后15d)；G：标记菌株从根边缘细胞的裂隙侵入根细胞内并充满整个细胞(接种15d后)；H：标记菌株在根内大量聚集并在中部连接成线(接种后15d)；I：标记菌株在根表面细胞内部大量定殖(接种后15d)。比例尺示30μm。接种浓度为10⁸CFU/ml。

A：标记菌株在叶表皮的叶肉细胞中大量定殖(接种后2d)；B：标记菌株在叶片花环结构的维管束鞘细胞中有少量定殖(接种后2d)；C、D：标记记菌株在叶片中的维管束细胞和叶肉细胞中均有定殖(接菌后15d)比例尺示30μm。接种浓度为10⁸CFU/ml。

携带GFP标记的菌株120，在固体培养基上培养时，可看到绿色荧光。当应用该菌株接种甘蔗组培苗时，可利用荧光显微镜观察其在植株内部的分布情况。从接种标记菌株后不同时间内标记菌株在甘蔗组培苗体内各组织的菌群动态的结果知道，在接种菌液浓度为10⁸CFU/ml的菌液后2天，根和叶中的标记菌数量便达到了高峰。荧光显微镜观察的结果显示，接菌2d后标记菌株在根毛区的根毛附近以及主根边缘处大量聚集，并从细胞裂隙侵入根内。同时也可从侧根断裂处以及主根与侧根的连接处聚集并侵入根内。在接种后第15天，我们观察到标记菌株在根表皮细胞的细胞间隙中大量定殖，同时也在根边缘细胞和根表皮细胞内定殖并充满整个细胞。标记菌株也能在根冠处的靠近边缘的表皮细胞内开始形成侵染线并向主根方向迁移，同时也能在根表面的中部大量聚集并逐渐连成线。标记菌株在叶中主要出现在叶表皮叶肉细胞间隙，叶片的维管束鞘细胞以及叶肉细胞内。

固氮菌作为理想的植物促生菌不仅要求有高的固氮活性，而且要求生活能力强，能在寄主植株根和叶中成功定殖。本研究表明，DX120可进入两个甘蔗品种(GT21和B8)的根、叶鞘和叶中，且具有较强的持久定殖能力。DX120能够从甘蔗根表面的裂隙、主根和侧根发生处及根的断裂处进入到根内并在根内细胞间隙和细胞内大量定殖，也能够在叶片的叶肉细胞和维管束细胞中定殖，并能在定殖组织内进一步增殖。我们的研究结果与前人报道的其他固氮菌的定殖模式相以(James et al.，2006；Gyaneshwar et al.，2002；liu et al.，2002；Cocking，et al.，2006)。Gluconacetobacter Diazotrophicus可以定殖与甘蔗和水稻根和茎的内部(Rouws et al.，2010)。Herbaspirillum sp B501gfp菌株可以在甘蔗根部和茎的组织内部定殖，接种浓度高，在甘蔗不同组织分离到得菌落数量也多，但供试品种之间有差异(Njoloma et al.，2006)。Elbeltagy等人(2001)的研究认为，内生菌由根向茎中迁移可能是由于根表面细胞间隙形成的侵染线一直沿着侧根和不定根延伸造成的。Zakria等人(2007)认为内生菌的运动性在细菌入侵植物以及细菌在植物内部的迁移中起重要作用，因此内生菌能通过生长介质直接进入到植物茎基部并随后往植物的其它组织中迁移。然而本研究中的DX120菌株不具有运动性(林丽，2011)，我们推测该菌的向上迁移可能是随着植株的蒸腾流向上移动的，关于该菌是通过什么方式从根部往其他组织中迁移的原因还需进一步研究。

关于植物内生固氮菌的接种以及定殖动态变化研究，大多研究所使用的接菌浓度为102CFU/ml与10⁸CFU/ml，并且认为10⁸CFU/ml是比较适合的内生菌侵染浓度(Luna et al.，2010；Zakria et al.，2007；Njoloma et al.，2006)。目前尚未见有系统的内生固氮菌侵染宿主植物的不同浓度筛选的研究报道。本实验设置了六个不同菌液浓度((10²，10⁴，10⁶，10⁸，10¹⁰，10¹²CFU/ml))与两个甘蔗品种的组培苗做比较接种实验。结果表明不同的接菌浓度下的克雷伯氏菌DX120均能够从经过表面消毒的根、叶鞘和叶内部分离到，说明DX120能在甘蔗组培苗的各个组织器官中定殖，但根与根以上部位存在有一定的菌群数量差异，进一步的荧光显微镜观察也证实了上述的结果。Luna等(2010)报道用醋酸杆菌接种小麦和高梁的种子后菌株能在小麦和高粱的根、茎和叶中重新分离到一定细菌数量，并且不同的接菌浓度对醋酸杆菌在小麦和高梁根部的定殖数量没有太大的影响，即少量的固氮菌便能进入植株体内并在体内定殖。Reis等(1999)认为内生菌接种甘蔗组培苗后需要短期的时间繁殖后才能在植物体内定殖，高浓度的接种量有利于接种成功。Zakria等(2007)用两个浓度的草螺菌接种水稻苗后也发现在接种后30天后，菌株在根内定殖的细菌量才达到最大值，茎内则是接菌后45天定殖的细菌量最大，在叶中则一直检测不到菌株，并指出高浓度的菌液有利于草螺菌在水稻中定殖。本研究发现两个甘蔗品种在接菌2天后的根、叶鞘和叶内都分离到了一定数量的接种菌，表明了克雷伯氏菌能在短期内迅速进入植物根内并往根以上组织迁移和定殖，这可能是由于不同的菌株定殖能力不同造成的，也可能是接种技术不同造成的。Njoloma等(2006)用草螺菌接种两个品种的甘蔗组培苗后菌株在植株中的定殖研究表明相同的接种浓度在不同品种的甘蔗组织中定殖的细菌量有较大的区别，且高的接种浓度要比低的接种浓度在接种甘蔗后有更强的定殖能力。在本试验条件下，少量固氮菌接种到含有少量营养元素的组培苗液体培养后，细菌能利用培养基中的少量营养元素及植物根系分泌物进行繁殖，且进入到植物组织器官中后能利用组织器官中的营养物质继续积累繁殖，因此低的接菌浓度便可以让足够数量的固氮菌进入植物体内并稳定定殖，且低的接菌浓度可能比高的接菌浓度更有利于植物的生长。本研究的接种方法能在很大程度上降低菌液的使用量，且操作方法方便可行，尤其是将固氮菌引入甘蔗组培苗，提供具有固氮作用的健康种苗方面具有更广阔的应用前景。本研究结果可为研究固氮菌与寄主的互作提供参考依据，但本试验是在严格控制试验条件且无菌的条件下进行的，若在田间使用固氮菌接种甘蔗的定殖模式是否相同，也需进一步研究。在将固氮菌引入甘蔗组培苗时，可在在组培苗生根后，在壮苗的同时接入低浓度的固氮菌就可保证接种菌在甘蔗组培苗体内的成功定殖。

本发明实施例提供的将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖；该将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法采用荧光显微镜观察克雷伯氏菌标记菌株的侵染和定殖，以抗生素抗性标记法和平板分离计数法调查克雷伯氏菌标记菌株的种群动态，为具有固氮菌的健康种苗的推广应用及固氮菌与甘蔗的互作研究提供参考依据，具有较强的推广与应用价值。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；

利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；

测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；

用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖；

所述在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养的实现方法为：

在无菌操作的条件下切取B8和GT21两个甘蔗品种的茎尖上2-4cm处的顶端分生组织接到添加3.0mgL^-12，4-D的固体MS培养基上诱导愈伤组织；

在完全黑暗的条件下培养30天后再把愈伤组织接到添加2.0mgL^-16-BA和0.2mgL^-1NAA的固体MS培养基上进行苗分化培养；

分化苗再用添加3.0mgL^-1NAA和2.0mgL^-1IBA的固体MS培养基上诱导生根，生根后再转入添加有1.0mgL^-1NAA和1.0mgL^-1IBA的液体MS培养基上进行壮苗培养；

所述愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养时的的传代培养周期均为30天，培养条件为白天28℃培养16小时，晚上25℃培养8小时，光照强度为2000Lx，固体MS培养基在进行121℃、20min的高压灭菌前，将pH值调到5.8；

所述利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理的实现方法为：

将克雷伯氏菌的标记菌株在LB液体培养基中培养，在37℃、200r/min条件下过夜培养至LB液体培养基浑浊；

取10μl菌悬液到50ml加有抗生素的LB液体培养基中，在37℃、200r/min条件下过夜培养至在600nm下的吸光度为0.8左右；

在4000×g、10min、4℃的条件下，离心收集菌体，用无菌的pH值为7.4的磷酸缓冲液悬浮至10¹²CFU/ml，再用磷酸缓冲液稀释，分别调节至10¹⁰、10⁸、10⁶、10⁴、10²CFU/ml；

把已生根的甘蔗组培苗在超净工作台中分成单株，转到装有50ml不含维生素的 1/10MS液体培养液的500ml培养瓶中，并加入上述浓度的菌悬液；

所述LB液体培养基包含10gL^-1蛋白胨、5gL^-1酵母提取物、5gL^-1NaCl，并且在对LB液体培养基高压灭菌前将pH值调到7.0；

所述测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态的实现方法为：

取甘蔗组培苗分为根、叶鞘、和叶片三部分或根和苗两部分先在75％酒精中浸泡30s，再用1％的次氯酸钠表面消毒1min，然后用无菌水漂洗4次，每次1分钟；

用无菌滤纸轻轻吸干甘蔗组培苗上选取部分的水分后分别称取质量；

将甘蔗组培苗吸干水分的部分放到灭过菌的研钵中研磨成匀浆后加9ml灭菌的磷酸缓冲液混匀并转移到无菌的试管中，混匀后用无菌水进行10倍系列稀释，进行根、叶鞘和叶片内克雷伯氏菌标记菌株的分离；

分别取每种稀释浓度的悬液100μl加到含有抗生素的LB平板中，均匀涂布后用封口膜封好，放到37℃的培养箱中倒置培养24小时后进行计数；

克雷伯氏菌标记菌株分离用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的固体LB培养基；

所述用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖的实现方法为：

分别在接种后2天和15天取甘蔗组培苗的根和叶片，用无菌水洗去根表面上附着的固氮菌，并进行灭菌处理；

将叶片横切面的徒手切或整体根在无菌水中铺展于载玻片上，再盖上盖玻片，把制作好的玻片置于荧光显微镜下观察，由低倍到高倍，拍照；

所述10²CFU/ml克雷伯氏菌标记菌株的接种浓度就可保证标记菌株进入甘蔗体内并积累定殖；

所述克雷伯氏菌的标记菌株携带有绿色荧光蛋白基因、四环素及氨苄青霉素抗性基因。