CN105385634A - 一株橡胶树根际促生菌株hbrm-86及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物微生物技术领域，具体涉及一种产气肠杆菌HBRM-86及其作为橡胶树根际促生菌株的应用。本发明以ACC脱氨酶为主要指标，通过精心筛选得到一株产气肠杆菌HBRM-86，并保存于中国典型培养物保藏中心，并且实验证明，本发明筛选菌株产气肠杆菌HBRM-86能够有效的作为根际促生菌株有助于橡胶树幼苗的成长，有助于提高天然橡胶的产量。

Description

一株橡胶树根际促生菌株HBRM-86及其应用
技术领域
本发明属于植物微生物技术领域，具体涉及一种产气肠杆菌HBRM-86及其作为橡胶树根际促生菌株的应用。
背景技术
天然橡胶是一种以聚异戊二烯为主要成分的天然高分子化合物，分子式是(C5H8)n，其成分中91-94％是橡胶烃(聚异戊二烯)，其余为蛋白质、脂肪酸、灰分、糖类等非橡胶物质。通常我们所说的天然橡胶，是指从巴西橡胶树上采集的天然胶乳，经过凝固、干燥等加工工序而制成的弹性固状物。天然橡胶是应用最广的通用橡胶，目前，天然橡胶是和钢铁、石油、煤炭并列的我国四大工业原料之一，工业需求量十分庞大。
当前，世界上99％的天然橡胶来自巴西橡胶树，研究表明，制约天然橡胶产量的主要因素之一即是橡胶树死皮现象。当前对橡胶树死皮的研究一直在进行当中，生理学家和病理学家为寻求割胶树的死皮原因及其防治方法，做了大量的工作，但至今仍没有切实有效的防控措施能够遏制割胶树死皮日趋严重的态势。于是，进一步提升橡胶树的生产能力成为了提高天然橡胶产量的主要有效趋势。
LorenzHiltner首先于1904年提出了植物根际(也称根圈)促生菌(Plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)的概念，他指出植物根际促生菌是指紧密环绕植物根的区域，对于植物有促生作用的微生物。在豆科植物中最先表述了细菌与根系的这种特殊关系，此区域是植物生物、化学和物理特性最容易受到影响的区域。目前对于PGPR的研究主要集中在农作物病害防治与促生增产方面。吉云秀等人从盐生植物根际土中分离得到4株含ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid，ACC)脱氨酶的PGPR，考察其对燕麦初生苗盐分胁迫下的促生效应，结果表明随盐分的升高，促生作用增大；张越己等从麻风树根际分离具有ACC脱氨酶活性的菌株，芽孢杆菌属菌株KLBMP4802、KLBMP4809、KLBMP4804，窄食单胞菌属的KLBMP482、粪产碱杆菌属的菌株KLBMP4806、KLBMP4816和节杆菌属的KLBMP4810、KLBMP4814都具有较强的促生长潜在性，这也扩大了已知的具有潜在促生长作用的细菌种属范围；张英以西藏阿里地区高寒草原四种牧草为研究对象，发现优良PGPR菌株以假单胞属和杆菌属为主且可以植物根际成功定殖，对植物促生效果显著；李凤汀等从植物根际土壤中分离到的硅酸盐细菌HM8841，能够使可利用钾含量达到原硅酸盐中含量数倍，并对不同土壤上生长的不同农作物的生长均表现出较好的促进作用；安永辉以紫花苜蓿幼苗为研究对象，发现根际细菌CS1、CS2、CS3、CS4、CS5、CS6处理后，幼苗的生理指标(生物量、叶绿素、丙二醛、超氧化物岐化酶等)均有所提高；Zahir等从豌豆、小麦和玉米的根际土壤中筛选出3株含ACC脱氨酶的假单胞菌，并检测它们对植物抗旱性的影响，结果表明这3株菌能增强植株的抗旱能力；Ma等从Alyssumserpyllifolium和Phleumphleoides的根际土壤中分离出5株具有Ni抗性PGPR，其中，相比较不加菌的对照处理，SRA2菌株可使生长在含镍450mg/kg的污染土壤中印度芥菜的鲜重和干重分别增加351％、285％；DorotaKrzyzanowska等对马铃薯的根际菌株BacillussubtilisMB73/2，Pseudomonassp.P482和Ochrobactrumsp.A44的定殖情况进行研究，发现它们可以有效的定殖并促进马铃薯的生长；Abbasi等用细菌产IAA为指标，从小麦根际筛选根际促生菌，并在土壤种植的条件下发现筛选的菌株对小麦的生长具有促进作用；Khalid等筛选小麦的根际促生菌，以期待通过促生菌来提高小麦作物的产量和生物防病能力。
可见，尽管PGPR的促生机制还没有定论，但是它多样的促生作用以及促生效果已然是已被广泛接受的。研究表明，其促生机制主要包括以下四种途径：(1)细菌和它的分泌物帮助植物获得充足的包括氮、钾、磷、铁等营养元素，以保证植物的最佳生长；(2)合成植物生长调节剂(包括生长素、赤霉素、细胞分裂素等)，促进植物生长；(3)通过抑制病原微生物的生长，从而提高植物的抗病能力，间接地促进植物生长发育；(4)抑制植物体内乙烯的合成，利于植物定居成活以及根的伸长。根际促生菌的主要作用机制是在植物根际存在有能产生ACC脱氨酶的细菌，这类细菌可以吸收、分解植物根系分泌出的ACC(乙烯的前体)，并利用其分解产物α-丁酮酸和氨分别作为C源和N源，使根际的ACC浓度降低，进而促使根系不断的向外分泌ACC，从而降低根系中ACC和应激乙烯的水平，减轻逆境下乙烯对植物的伤害，促进植物的生长发育，提高作物产量。因此，以ACC脱氨酶为主要指标来筛选根际促生菌用以提高植物的抗逆性是个很有研究和应用价值的方向。可见，利用促生菌株实现天然橡胶产量的提升的关键在于筛选到合适的具有橡胶树根际促生作用的菌株，也成为解决天然橡胶产量问题的首选方式。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于筛选出能应用于橡胶树死皮防控的具有橡胶树根际促生作用的菌株，以解决天然橡胶产量制约的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了一株产气肠杆菌株，其分类命名为产气肠杆菌HBRM-86，已于2015年11月09号保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编：430072；其保藏编号为CCTCCM2015671。
本发明还公开了一种培养所述产气肠杆菌株的方法，包括在含有适宜碳源的TSB培养基中培养所述菌株的步骤。
所述碳源包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇或葡萄糖。
所述TSB培养基中的氯化钠浓度为2-10％。
所述培养基的pH值为4-12。
所述培养步骤的培养温度为20-45℃。
本发明还公开了所述产气肠杆菌株在促进橡胶树幼苗生长中的应用。
本发明还公开了所述产气肠杆菌株用于制备促进橡胶树幼苗生长的微生物菌肥的应用。
本发明还公开了一种促进橡胶树幼苗生长的方法，包括按照上述培养方法进行培养权所述菌株，并制得菌悬液的步骤。
所述菌株的施用方式为菌悬液灌根处理。
本发明以ACC脱氨酶为主要指标，自橡胶树根际土壤分离得到菌株HBRM-86，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性试验以及16srDNA序列分析，具有以下特征：①菌株呈直杆状，革兰氏染色阴性，周生鞭毛，兼性厌氧；②通过甲基红实验、V-P实验、苯丙氨酸脱氨酶实验、过氧化氢酶实验、氧化酶实验、柠檬酸盐生长实验等生理生化指标，并结合《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，鉴定结果HBRM-86属于产气肠杆菌属，结果与分子鉴定一致。本发明所述产气肠杆菌HBRM-86，保存于中国典型培养物保藏中心，并且实验证明，本发明筛选菌株产气肠杆菌HBRM-86能够有效的作为根际促生菌株有助于橡胶树幼苗的成长，有助于提高天然橡胶的产量。
并且实验显示，本发明筛选得到的产气肠杆菌HBRM-86具有一定的产IAA能力、具有一定的解磷能力、具有一定的固氮能力，并且对不同抗生素具有适应敏感性，为化学防治打下基础。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为产气肠杆菌HBRM-86的菌落形态；
图2为本发明所述HBRM-86菌株的生长曲线图；
图3为本发明所述HBRM-86菌株对橡胶树幼苗的促生作用测试结果；其中，大写字母代表1％水平差异极显著，小写字母代表5％水平差异显著；
图4为本发明所述HBRM-86菌株产IAA能力的定性测定结果；
图5为本发明所述HBRM-86菌株产IAA能力的定量测定结果；
图6为本发明所述HBRM-86菌株的嗜铁能力测定结果；
图7为本发明所述HBRM-86菌株的解磷能力测定结果；
图8为本发明所述HBRM-86菌株的固氮能力测定结果。
具体实施方式
实施例1菌株HBRM-86的分离、纯化及其ACC脱氨酶活性测定
1.1采样
样品为海南省东方市广坝农场的橡胶树根际土壤，采样时避开路边，施肥沟，选取无明显环境影响(包括水源污染、人为影响)的林段根据对角线法进行布点。将采集的带有根际土壤的橡胶树细根放入塑料袋内并做好记录。
1.2菌株分离纯化
1.2.1样品处理
取5段大小约1cm的根放入50mL无菌水中，浸泡10min，轻微震荡处理5min，制成悬浮液备用。
1.2.2菌株分离纯化
吸取1mL悬浮液加入到50mLPAF培养液中，28℃、200r/min条件下振荡培养24h，从其中吸取1mL菌悬液重复转接1次，第2次菌悬液中转移1mL至50mLDF培养液中，28℃、200r/min条件下振荡培养24h，然后从中吸取1mL菌悬液加入到50mLADF培养液中，28℃、200r/min条件下振荡培养24h，用于ACC脱氨酶活性细菌的筛选。梯度稀释ADF培养液中的菌悬液，并涂布于ADF固体平板，28℃恒温箱中培养，待长出单菌落后挑取单菌落分离纯化。将初步筛选出来的菌株继续涂布于以ACC为唯一氮源的固体培养基上培养，以反复验证各菌株利用ACC为唯一氮源生长的特性，重复3次。纯化后保存于TSB斜面培养基，并以含体积分数30％甘油的混悬液形式保存于-80℃冰箱中。经过上述初筛、复筛及纯化的过程，从橡胶树根际土样中分别分离到产ACC脱氨酶的菌株152株，并各自进行命名。
1.3菌株的ACC脱氨酶活性测定
1.3.1标准曲线的制定
用0.1mol/L(pH8.5)Tris-HCI配制100mmol/La-丁酮酸，4℃保存，用前母液稀释至10mmol/L。取出200uLa-丁酮酸梯度稀释液(0.1-1.0umol)，分别加入300uL0.2％2,4-二硝基苯肼，混匀后于30℃温育30min，加入2mL2mol/LNaOH显色，在540nm处测定光吸收值，以a-丁酮酸浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标制成标准曲线。
1.3.2细胞悬液制备
将菌株HBRM-86在TSB培养液中24h的纯培养物4℃离心收集，用DF培养液(不加(NH4)2SO4)离心洗涤两次，菌体悬浮于ADF培养液，在28℃旋转摇床200rpm的条件下培养24h，以诱导产生ACC脱氨酶。4℃离心收集菌体，用0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH值为7.6)洗涤离心两次，重悬浮于600uL0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH值为8.5)中，加入30uL甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞。
1.3.3酶活测定
取200uL的含甲苯的细胞提取物于1.5ml离心管中，加入20uL0.5mol/LACC，振荡混匀。于30℃保温15min后，加入lmL0.56mol/LHCl，振荡混匀，室温下于16000g离心5min。取lmL上清液，加入800uL0.56mol/LHCl，混匀后，加入300uL2,4-二硝基苯肼，混匀后于30℃保温30min。然后用2.0mL2mol/LNaOH显色，于540nm处测定光吸收值。以a-丁酮酸制作标准曲线，根据提取液中a-丁酮酸的含量，计算出单位时间ACC脱氨酶催化ACC生成a-丁酮酸的量，即单位酶活力，用μmol/min表示。
1.3.4菌体细胞抽提物中总蛋白含量测定
采用Bradford比色法，以牛血清白蛋白为蛋白质(Pr)测定标准样品。然后用单位酶活除以总蛋白浓度即比活力(U/mg)表示ACC脱氨酶活性。
通过测定，上述筛选得到的菌株中，菌株命名编号为HBRM-86菌株的ACC脱氨酶活性最高，其酶活值为0.226U/mg。
实施例2菌株HBRM-86的鉴定
1、微生物学特性
对在28℃培养箱中划线培育的HBRM-86菌株进行形态特征观察，如图1所示，发现生防菌株HBRM-86呈直杆状，革兰氏染色阴性，周生鞭毛，兼性厌氧；在TSB培养基上培养48h后，菌落为近圆形，不透明且边缘整齐光滑，呈乳白色偏黄，中间凸起且颜色较深，边缘较薄，表面光滑、湿润、质地粘稠，易挑取，菌落平均直径为8.51mm，24h平均直径为6.27mm。
2、分子生物学鉴定
以菌株总DNA为模板，使用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)，进行16SrDNA扩增，引物由上海立菲生物技术有限公司合成。
PCR反应体系(30ul)：10倍Taqmix15ul，引物各0.5ul，基因组DNA1uL，加水至30uL。PCR反应程序：预变性：95℃，5min；变性：94℃，1min；退火：55℃，1min；延伸：72℃，1min；35个循环，延伸：72℃，10min，4℃保存。
扩增出条带后切胶回收并进行连接转化，将阳性克隆送去上海立菲生物技术有限公司进行。将所得序列与NCBI数据库中的序列进行Blast分析，利用Mega5.0软件中的邻接法构建系统发育树。通过比对分析，结果显示与产气肠杆菌的同源性为99.85％，因此推断HBRM-86菌株为产气肠杆菌，因此命名为产气肠杆菌HBRM-86，并保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCM2015671。
3、生防菌的生理生化鉴定
(1)甲基红试验
①培养液配制：称取蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO45g，分别溶解混匀后定容到1000mL，调pH7.0-7.2，分装于试管中，每管4-5mL，121℃灭菌20min；
②接种HBRM-86试验菌于以上培养液中，每次两个重复，置室温培养2.6天(如为阴性可适当延长培养时间)；
③在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为甲基红试验阴性反应(甲基红变色范围为4.4红至6.0黄)。
试验结果显示为产生黄色，故分析菌株HBRM-86的甲基红试验为阴性反应。
(2)V-P测定
①培养液配制：称取蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO45g，分别溶解混匀后定容到1000mL，调pH7.0-7.2，分装于试管中，每管4-5mL，121℃灭菌20min；
②接种HBRM-86试验菌于以上培养液中，每次两个重复，置室温培养2.6天(如为阴性可适当延长培养时间)；
③取培养液和40％氢氧化钠等量混合，加少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。
试验结果显示为产生红色，故分析菌株HBRM-86的V-P测定为阳性反应。
(3)苯丙氨酸脱氨酶
①培养液配制：称取酵母浸膏3g，Na2HPO41g，DL-苯丙氨酸2g，NaCl5g，琼脂12g，分别溶解混匀后定容到1000mL，调pH7.0，分装于试管中，每管4-5mL，121℃灭菌20min，摆成斜面；
②以适当的浓度接种HBRM-86试验菌于以上培养基中，37℃培养4h或者8-12h测定；
③将试剂4-5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。
试验结果为颜色没有变化，故判断菌株HBRM-86为阴性反应。
(4)接触酶
将24h培养的斜面菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有3％过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡则为阴性。
试验结果为有气泡产生，故判断菌株HBRM-86为阳性反应。
(5)氧化酶
①试剂配制：盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1％水溶液于棕色瓶中在冰箱中贮存；
②在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯二胺的1％水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用玻璃棒或者牙签取18-24h的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在10s内涂抹的菌苔出现红色者为阳性，(四甲基对苯撑二胺为蓝色)10-60s先红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理；
③氧化酶试纸制作及测定法：将质地较好的滤纸用1％盐酸二甲基对苯撑二胺浸湿，在室内悬挂风干。干后，剪裁成适当大小的纸条，放在有橡皮塞的试管中密封保存，在4℃冰箱中可存数月，使用前用玻璃棒或者牙签取18-24h的菌苔抹在纸条上，于10s内出现红色为氧化酶阳性。如纸条贮存过久，颜色不明显，则不能使用。
试验结果为颜色没有变化，故判断菌株HBRM-86为阴性反应。
(6)淀粉水解
①在肉汁胨中加0.2％的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min，倒平板备用；
②取新鲜斜面培养物点接于上述平板，28℃恒温培养；
③培养2-5天，形成明显菌落后，在平板上碘液平板成蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性，仍是蓝黑色为阴性。
试验结果为颜色仍为蓝黑色，故判断菌株HBRM-86为阴性反应。
(7)柠檬酸盐生长试验
①培养基配制：分别取NaCll.0g，MgSO4.7H2O0.2g，NH4H2PO40.5g，柠檬酸钠2.0g，琼脂18.0g，1％溴百里酚蓝水溶液(指示剂)l0mL；将以上成分除指示剂外加热溶解，蒸馏水补充至990mL，调pH为7.0，然后加入指示剂。分装试管，培养基量以能摆高低柱斜面为宜，121℃灭菌20min，摆斜面；
②挑取新鲜培养的供试菌株单菌落在斜面上划线接种，28℃培养3-7d；
③观察实验结果：培养基变蓝色或桃红色为阳性，否则为阴性。
试验结果为颜色为蓝色，故判断菌株HBRM-86为阳性反应。
(8)对抗生素的敏感性研究
用滤纸片法测定产气肠杆菌HBRM-86对不用抗生素的敏感性，用打孔器制备直径7毫米的滤纸片，高温灭菌。在溶化后冷却至50-55℃的TSB固体培养基中加入l毫升供试菌株种子液，摇匀后倒平板，将灭菌后的滤纸片置于平板中，然后在滤纸上添加抗生素溶液，添加量相当于氨苄青霉素Amp50微克每毫升、羧苄青霉素50微克每毫升、卡那霉素Kana50微克每毫升、氯霉素Chl50微克每毫升、链霉素Str50微克每毫升、四环素Tet50微克每毫升、红霉素Ery50微克每毫升、利福平Rif50微克每毫升、头孢霉素Cef50微克每毫升、硫酸庆大霉素50微克每毫升、壮观霉素50微克每毫升。放置于28摄氏度恒温培养箱内培养，于24小时观察结果，结果见下表1。
表1抗生素抗性实验结果
注：“+"为出现抑菌圈，“-”为不出现抑菌圈。
可见，本发明筛选菌株对不同抗生素其敏感性不同。
菌株HBRM-86培养条件的研究
实施例4生长曲线的制定
将菌株在TSB培养基中过夜培养(10-12h)，按1％的接种量接种到无菌培养基中，混合均匀后分别取5mL混合液至标记好时间的无菌试管中，在最适生长温度下震荡培养(200r/min)，选取0-50h共17个时间点进行定时取样测定，用未接种的液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行比色测定。对细胞密度大的培养液用液体培养基适当稀释后测定，使其OD600在0.1-0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。
以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制细菌的生长曲线，见图2。
由菌株HBRM-86的生长曲线图可知菌株HBRM-86的迟缓期较长，小于1h，约在32h左右进入稳定期，延滞期约16h，48h后进入衰败期。
实施例5不同pH值对菌株生长的影响
①基础培养基：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl5g，葡萄糖2.5g，K2HPO42.5g，将以上成分加热溶解，蒸馏水补充至1000mL，调pH为7.0，121℃灭菌20min，倒平板备用；
②配制培养基时，将培养基的pH值调节为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14；
③划线接种培养2-3天后观察实验结果见下表2。
表2不同pH值实验结果
注：“+"为可以生长，“-”为不能生长。
实施例6不同温度对菌株生长的影响
①基础培养基：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl5g，葡萄糖2.5g，K2HPO42.5g，将以上成分加热溶解，蒸馏水补充至1000mL，调pH为7.0，121℃灭菌20min，倒平板备用；
②将菌株接种于上述平板后放置于4℃、10℃、20℃、28℃、37℃、45℃、60℃培养2-3天后观察实验结果见下表3。
表3不同培养温度实验结果
注：“+"为可以生长，“-”为不能生长。
实施例7菌株的盐耐受性(NaCl)研究
①基础培养基：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl5g，葡萄糖2.5g，K2HPO42.5g，将以上成分加热溶解，蒸馏水补充至1000mL，调pH为7.0，121℃灭菌20min，倒平板备用；
②配制培养基时，将基础培养基中NaCl的浓度调整为2％、5％、7％、10％、12％、15％；
③划线接种培养2-3天后观察实验结果见下表4。
表4盐耐受性(NaCl)实验结果
注：“+"为可以生长，“-”为不能生长。
实施例8糖的利用
①基础培养基：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl5g，葡萄糖2.5g，K2HPO42.5g，将以上成分加热溶解，蒸馏水补充至1000mL，调pH为7.0，121℃灭菌20min，倒平板备用；
②配制培养基时，将基础培养基中葡萄糖替换为乳糖、蔗糖、D-甘露醇、葡萄糖；
③划线接种培养2-3天后观察实验结果见下表5。
表5糖的利用实验结果
注：“+"为可以生长，“-”为不能生长。
实施例9菌株HBRM-86对橡胶苗生长的促进作用
1、材料
供试幼苗材料：选取在沙床炼化、生长均一的巴西橡胶树CATAS7-33-97体胚组培苗(文中简称橡胶苗)为试验对象。供试幼苗材料由中国热带农业科学院橡胶研究所育种中心提供。
供试基质：砖红壤，采自海南省儋州市，过6mm筛，去除杂草、残根等杂物后与椰糠按体积比2:1混合均匀。
2、试验设计
试验采用温室盆栽法，地点设在中国热带农业科学院橡胶研究所试验场B点温室大棚，采用上口径15cm，下口径10cm，高40cm的黑色塑料盆为容器，每盆装土重2.7kg，每个处理和对照各10盆，三次重复，共60盆。
将橡胶苗种下以后管理一个月，待每株苗都正常生长再开始处理，处理时用菌悬液灌根，每株浇灌200ml菌悬液，每10d浇灌1次，共3次(30d)，以强化细菌在根际的定殖。对照(CK)浇灌相同体积的无菌水，处理方法相同。
菌悬液制备：配制基础培养基(胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl5g，葡萄糖2.5g，K2HPO42.5g，将以上成分加热溶解，蒸馏水补充至1000mL，调pH为7.0，121℃灭菌20min)，取菌株HBRM-86接种，28℃培养36h，制得菌悬液。
时间安排：处理后第0、20、70天测定株高，测试结果见附图3所示，其中，左侧柱状图为CK，右侧柱状图为菌株HBRM-86测试结果。
可见，本发明所筛选得到的产气肠杆菌HBRM-86能够有效的作为根际促生菌株有助于橡胶树幼苗的成长，有助于提高天然橡胶的产量。
实施例10菌株的促生潜力测定
1、产IAA能力测定
按照常规方法进行菌株产IAA能力的定性测试，结果如图4所示，结果表明菌株HBRM-86能够显色且显色颜色较深。
按照常规方法对菌株产IAA能力进行定量测定，如图5所示，测得菌株HBRM-86产IAA能力为19.007ug/ml。有此可知，菌株HBRM-86具有产IAA能力。
2、嗜铁能力测定
将菌株HBRM-86在CAS培养基上培养测试其嗜铁能力，如图6所示，培养基没具有明显的螯合圈，说明菌株HBRM-86没有明显的嗜铁能力。
3、溶磷能力测定
如图7所示，通过平板接种实验发现菌株HBRM-86的溶磷圈十分明显，测定菌株HBRM-86菌株的溶磷圈直径(HD)与菌落直径(CD)，计算HD/CD为1.79，实验表明菌株HBRM-86具有较好的解磷能力。4、固氮能力测定
如图8所示，将菌株HBRM-86在无氮培养基上经过5次转接后，能够生长，但菌落直径较小，而且HBRM-86在无氮培养基上生长时产色素能力也有所减弱。
可见，本发明筛选的到的产气肠杆菌HBRM-86具有一定的产IAA能力、具有一定的解磷能力、具有一定的固氮能力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株产气肠杆菌株，其分类命名为产气肠杆菌HBRM-86，保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCM2015671。
2.一种培养权利要求1所述产气肠杆菌株的方法，其特征在于，在含有适宜碳源的TSB培养基中培养所述菌株。
3.根据权利要求2所述的培养所述产气肠杆菌株的方法，其特征在于，所述碳源包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇或葡萄糖。
4.根据权利要求2或3所述的培养所述产气肠杆菌株的方法，其特征在于，所述TSB培养基中的氯化钠浓度为2-10％。
5.根据权利要求2-4任一所述的培养所述产气肠杆菌株的方法，其特征在于，所述培养基的pH值为4-12。
6.根据权利要求2-5任一所述的培养所述产气肠杆菌株的方法，其特征在于，所述培养步骤的培养温度为20-45℃。
7.权利要求1所述产气肠杆菌株在促进橡胶树幼苗生长中的应用。
8.权利要求1所述产气肠杆菌株用于制备促进橡胶树幼苗生长的微生物菌肥的应用。
9.一种促进橡胶树幼苗生长的方法，其特征在于，包括按照权利要求2-7任一所述方法进行培养权利要求1所述菌株，并制得菌悬液的步骤。
10.根据权利要求9所述促进橡胶树幼苗生长的方法，其特征在于，所述菌株的施用方式为菌悬液灌根处理。
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