CN104946574A - 一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C - Google Patents

Abstract

本发明属于生防菌株挖掘和利用的领域，具体涉及一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C，该菌株的保藏编号为CGMCC No.10963。本发明还公开了上述菌株的分子生物学特性和生理生化特性、培养方法，并验证了其具有抑制多种植物病原真菌的活性，包括镰孢炭疽菌、胶孢炭疽菌和镰刀菌。

Description

一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C

技术领域

本发明涉及生防菌株挖掘和利用的领域，具体涉及一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C的鉴定和应用。

背景技术

英国植物真菌病害专家Garratt,S.D.(1965)指出“生物防治是在任何条件下或借助于任何措施，通过其它生物(人除外)的作用来减少病原物的生存和活动，从而减少病原物所致病害的发生”；“生物防治指引进一种或几种用于防治的生物，通过增加该生物的数目或者通过改变环境使其利于这些生物的活动，通常两种措施综合作用”。

植物病害生物防治是利用一种或多种拮抗体，通过对环境、寄主或拮抗体的控制，减少处于活跃状态或休眠状态的病原菌或寄生物的密度或致病活动。

植物病害生物防治的目的：1、减少病原菌的接种体，要通过减少作物之间的幸存者，减少产生或释放活的繁殖体，或者减少菌丝体生长所造成的传播。2、减少病原菌对寄主的感染。3、减少病原菌为害的程度。

生防细菌在植物病害的防治中占有十分重要的地位，其主要优势有：(1)生防细菌复杂多样的生防机制使病原菌不易产生抗药性。生防细菌的抑菌机理有多种，并且通常是两种以上的抑菌机制协同作用起到防治病害的效果。在植物病害防治实践中，普遍采用的方法是同时使用活菌体和其拮抗性代谢产物，这有利于各种抑菌机制互促互补，从而使生防细菌的生防潜力得到最大限度的发挥。此外，细菌产生的抑菌活性物质(如细菌素)能同时影响敏感菌的多种代谢途径，如此以来，因病原菌发生突变而对细菌素产生抗性的可能性就不像抗生素那样容易。(2)生防细菌的活体应用使得其防效较之其它微生物更为持久的原因是生防细菌大多由农田生态系统中分离出来，一般情况下具有与病原菌相同或相近的生态适应及对寄主植物的亲和性，定殖相对容易，再加上其繁殖迅速，使应用细菌活体防治病害成为可能。而用于生防的其他微生物类群，多数是利用它们的代谢产物防治病害。相比之下，生防细菌定殖后能大量繁殖并建立产生抑菌物质的“活工厂”防效会更持久。(3)代谢旺盛、产生拮抗物质周期短，与生防真菌或放线菌相比生 防细菌繁殖速度快得惊人，在适宜的条件下，几十分钟就分裂繁殖一次，一天以后便产生数千万个后代。液体培养条件下，44小时即可达产拮抗物质的高峰期。这有利于节约时间，缩短生产周期，降低生产成本。(4)有利于维持有益微生物的生态平衡，由于生防细菌所产生的抑菌物质通常直接针对相应的病原菌起作用，特异性强，故此不会对农业生态系统其它有益微生物产生不利影响，有助于维持有益微生物的生态平衡。

诱导植物抗性是生防菌发挥生防作用的一个重要方面。病原物诱导的植物抗性与非病原物诱导植物抗性具有相同的表型特征。关于生防菌的诱导抗性的可能机制包括:①产生抗微生物的低分子量化学物质，如植物保卫素、木质素、富含轻脯氨酸的糖蛋白等。②诱导一些水解酶和氧化酶类，如几丁质酶、过氧化物酶。③诱导病程相关蛋白的产生等。利用植物内生菌防治植物病原菌已成为研究热点.杨海莲等从水稻中分离得到内生阴沟肠杆菌MR12，发现它既有固氮活性，又可防治水稻稻瘟病和纹枯病。唐明娟等发现，在野外盆栽条件下，内生真菌能提高台湾金线莲的成活率，使其成活率达100％，同时还发现使用内生真菌的金线莲生长快，叶大且绿，根系发达。马冠华等的研究结果表明，烟草内生菌不仅能在烟草中定殖，还能有效抑制病原菌的入侵及扩繁。生防微生物诱导植物抗性在G^-细菌如假单胞菌和真菌己有很多研究。但是芽孢杆菌诱导植物抗性作用的报道相对较少，已有研究证明诱导植物抗性也是其生防作用的重要机制之一。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的空白提供一株生防菌Baisha2C及其在防治多种植物真菌病害中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明采用的细菌是枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2015年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号为CGMCC NO.10963。

本发明的生防菌Baisha2C分离自海南省白沙县胡椒感病叶片，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性试验以及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌的一个新菌株，具有以下特征：(1)菌株呈杆状，有成链趋，具圆端或方端；芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，无荚膜；革兰氏染色阳性；(2)通过对生防菌进行分子鉴定、吲哚实验、甲基红实验、酪氨酸分解实验、柠檬酸盐生长实验、生长温度、碳源利用以及其他生理生化指标，并结合《伯杰细菌鉴定 手册》，鉴定结果Baisha2C属于枯草芽孢杆菌属，结果与分子鉴定一致。

生防菌Baisha2C的基本培养基为LB培养基或YEP培养基。

生防菌Baisha2C的可利用碳源有：山梨醇、鼠李糖、维生素C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、甘露醇、麦芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖。

生防菌Baisha2C对环境的适应能力比较强，可以在4℃-80℃的温度范围内生长，在盐浓度为0-10％均能生长。

本发明还研究了生防菌Baisha2C对不同的抗生素的敏感性，为化学防治提供基础。

本发明的菌株Baisha2C对镰孢炭疽菌、胶孢炭疽菌和镰刀菌具有抑制作用。

本发明的菌株Baisha2C或其发酵液可以作为生物防治剂使用，用于防治植物真菌病害枯萎病等。

本发明还提供一种生防菌Baisha2C的应用，该菌株可以用于防治甘蔗赤腐病、胡椒枯萎病和橡胶炭疽病。

本发明还提供一种植物真菌病害的生物防治方法，向具有真菌病害的植物施用生防菌Baisha2C或其发酵液，或者施用含有上述菌株或其发酵液的生物防治剂，也可以与其他生物防治制剂联合施用。

本发明的菌株Baisha2C具有广谱抗菌性，培养简单，适应性强，抗菌能力稳定，可以广泛应用于多种植物真菌病害的防治。

附图说明

图1为Baisha2C和其他生防菌的16S rDNA PCR产物电泳图，泳道M为DNA marker，6为Kg1，7为Baisha2C，8为Kg13，9为Kg4。

图2为生防菌Baisha2C的革兰氏染色结果。

图3为生防菌Baisha2C对镰孢炭疽菌的拮抗效果图。

图4为生防菌Baisha2C对胶孢炭疽菌的拮抗效果图。

图5为生防菌Baisha2C对镰刀菌的拮抗效果图。

具体实施方式

实施例1

生防菌Baisha2C的分离培养和筛选纯化。

1.1采样

样品为海南省白沙县胡椒感病叶片，将采集好的叶片放入塑料袋中并记录。

1.2材料表面消毒与拮抗细菌分离

1.2.1清水冲洗与剪取病叶

用清水洗去叶片上的灰尘砂砾，晾干。用剪刀在病健交界处剪取大小为5×5mm的小叶片备用。

1.2.2样品消毒

将剪取的小病叶放入烧杯，用升汞浸泡30秒，在浸泡的过程中应注意不断轻轻搅动小病叶，然后用无菌水冲洗三次，晾干，备用。

1.2.3细菌分离培养 

用灭过菌的镊子将剪取的小叶片贴放到PDA固体培养基上，每皿均匀摆放4块，再将培养皿用保鲜膜密封。倒置放入恒温培养箱中，28℃培养。每隔12h进行观察48h后将长出的菌体转接至相同的培养基上，28℃培养48h后进行纯化；同时，将纯化后所得的细菌采用梯度稀释涂布LB平板培养基中，28℃培养48h后挑取单菌落接至相应培养基斜面上。

1.3拮抗细菌的筛选

1.3.1细菌的纯化 

无限稀释法：将放置于8～10℃培养箱中的斜面试管取出，在无菌操作台中，将液体LB培养基分装到锥形瓶中，然后用接种针挑去少量的细菌于锥形瓶中，封口。放置于28℃摇床上震荡培养约12小时，取出。然后用移液器吸取200μL于LB固体培养基上，涂抹棒涂抹均匀，于28℃培养箱培养。然后再通过无限稀释法处理获得单一菌株。

或者采用划线纯化法：

如果要挑的菌落很小，而且又长得慢，菌落全部粘到接种环上，划线时可适当增加第二梯度线的宽度和划线数，因为当菌少时，拉不开4个梯度，而第二梯度可较好的分离出单菌落。如果要挑的菌落很大，而且又长得快，可挑菌少些，第一梯度线要多划几下，且占地要小。第二梯度线划得少且密一些，第三和第四梯度线则划得多且疏，因为这些菌主要靠第三和第四梯度线分离单菌落。第二梯度2～3条线与第一梯度线连接，第三与第二梯度线也是2～3条线连接。在第二与第三梯度划线前将接种环灼烧冷却，这样可烧死粘在接种环上的细菌。

实施例2

生防菌Baisha2C的鉴定

1、微生物学特性：

对在37℃培养箱中划线培育的生防菌株进行形态特征观察，发现生防菌株Baisha2C呈杆状，有成链趋，具圆端或方端；芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，无荚膜，为芽孢杆菌属。经革兰氏染色后菌体均呈现出蓝紫色，为革兰氏阳性菌。

2、分子生物学鉴定：

(1)DNA提取：采用本领域通用的试剂盒进行基因组DNA的提取；

(2)PCR反应：细菌通用引物8F和1492R，由英潍捷基(上海)贸易公司合成，结构如下：8F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

生防菌株Baisha2C的16S rDNA基因扩增结果如图1所示，扩增条带长度约1500bp，与预期大小一致；

(3)将PCR鉴定正确的重组菌送英潍捷基(上海)贸易公司基因测序。

通过在NCBI网上进行比对分析，结果显示与枯草芽孢杆菌属的同源性为99％，因此推断Baisha2C菌株属于枯草芽孢杆菌属。

3、生防菌的生理生化鉴定

(1)吲哚试验

①培养基配制：取1％胰蛋白胨水溶液，调pH 7.2-7.6，分装于试管中，高度为试管的1/3-1/4，121℃灭菌21min；

②待培养基冷却后，取10μL供试菌株新鲜种子液接种于胰蛋白胨液体培养基；

③28℃培养，分别于2d、4d后观察结果；

④每次观察时，沿管壁慢慢加入3-5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面出现红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可在培养液中加入乙醚约1mL，充分震荡，静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂，在乙醚和试剂液层界面出现红色，即为阳性反应。

结果均无红色产生，结果如表1所示，故分析生防菌在吲哚为生理生化指标 情况下为阴性。

表1 吲哚试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

(2)甲基红试验 

①培养基配制：蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2，分装于试管中，121℃灭菌21min；

②用液体LB培养基摇培菌株16h；

③取10μL供试菌株新鲜种子液接种于上述试管中，置于28℃恒温培养24h；

④在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色表示甲基红试验为阳性反应，黄色为阴性反应。

结果显示生防菌Kg1、Baisha 2C为阴性，其余生防菌均为阳性。

表2 甲基红试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

(3)柠檬酸盐生长试验

①培养基配制：分别取NaCl 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄H₂PO₄0.5g，柠檬酸钠2.0g，琼脂18.0g，0.04％酚红水溶液10mL；蒸馏水补充至1000.0mL，调pH为7.0，然后加入指示剂，分装试管；

②121℃灭菌21min，摆斜面；

③挑取新鲜培养的供试菌株单菌落在斜面上划线接种，28℃培养3-7d；

④观察实验结果：培养基变蓝色或桃红色为阳性，否则为阴性。

除接生防菌Kg1不变色以外，接其他生防菌均变为桃红色,其余生防菌株为阳 性如表3所示；

表3 柠檬酸盐生长试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

(4)酪氨酸水解 

①培养基配制：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水补充至1000.0mL，121℃灭菌21min；

②取0.5g酪氨酸加入10mL水中，灭菌后，添加至100mL LB培养基中，混匀后倒平板；

③点接生防菌，28℃培养箱中培养24h、48h后观察；

④观察结果：菌落边缘有透明现象说明能够水解，为阳性。

有部分菌落边缘有透明现象，说明能够水解；其中生防菌Kg1、Baisha2C、Kg4菌落边缘有透明的现象，生防菌Kg13菌落边缘没有透明的现象；如表4所示：

表4 酪氨酸水解试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

(5)最适碳源利用测定

①选取可溶性淀粉、胱氨酸、抗坏血酸、脯氨酸、精氨酸、麦芽糖、酪氨酸、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、甘氨酸、鼠李糖、果糖、草酸、苏氨酸、半乳糖、等碳源利用测定；

②基本培养基：(NH₄)₂SO₄2.0g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，蒸馏水补充至1000.0mL，pH 6.5，分装于试管中(每支试管4mL)，121℃灭菌21min；

③将所得碳源配制成5％的水溶液，灭菌后加入试管中，使其终浓度为1％；

④取供试菌株种子液10μL分别加到不同碳源中，并设置空白对照，然后在28℃，200r/min条件下，摇培40h；

⑤若出现明显浑浊，说明该碳源可以被利用；若无，则需从中取出10μL，转接到相应的新的碳源试管中，同样条件下，连续培养3次；如果仍无浑浊，则证明此碳源不适合被供试菌株利用。

实验结果如下：

可利用碳源有：山梨醇、鼠李糖、维生素C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、甘露醇、麦芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖；

不可利用碳源有：精氨酸、草酸、甘氨酸。

(6)最适生长温度的测定

①LB培养基配置：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水补充至1000.0mL，分装于试管，121℃灭菌21min后冷却；

②将菌株分别接入试管中，分别置于4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、99℃摄氏度下培养10min(40℃温度培养12h)；

③划线培养：分别将上述不同温度下的菌株进行划线，37℃培养24小时，分别观察其生长情况。

对生防菌的生长温度进行测定，结果如下：

表5 最适生长温度的测定结果

注：“+”为能生长，“-”为不能生长。

(7)拮抗菌耐盐性测定

培养24h后，取出观察各试管中菌株的生长状况，结果如下：

表6 生防菌耐盐性测定结果

注：“+”为菌株生长，“-”为不生长。 

由表6可以看出，除菌株Kg1只能在盐浓度为0-7％时生长，其余4种拮抗菌在盐浓度为0-10％均能生长，且在盐浓度为0的环境中生长状况最佳，在实验范围内，随盐浓度的增加其生长趋势逐渐减弱，直至盐浓度为12％及以后，生防菌不再生长。

(8)接触酶试验 

①用液体培养基摇培菌株16h；

②接种环蘸取培养16h的新鲜菌液，涂在在已滴有3％过氧化氢水溶液的玻片上；

③观察结果：有气泡产生为阳性，无气泡为阴性。

接种环蘸取培养16h的新鲜菌液，涂在已滴有3％过氧化氢水溶液的玻片上，均有气泡产生；显示接触酶实验结果均为阳性。

表7 接触酶试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

(9)氧化酶试验 

①用液体LB培养基摇培菌株16h；

②在干净培养皿里放一张滤纸，滴加1％二甲基对苯撑二胺盐酸盐水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿；

③用接种环取培养16h的新鲜菌液，涂抹在湿润的滤纸上；

④观察结果：在10s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，10-60s现红色者为延 迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。

结果显示：在涂抹菌苔后的60S内均未产生颜色的变化；全部显示阴性。

表8 氧化酶试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

实施例3

生防菌Baisha2C对抗生素的敏感性研究

1)培养基

LB固体培养基。 

2)试剂

氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、链霉素、四环素、红霉素、利福平、头孢霉素。

3)方法

用滤纸片法测定枯草芽孢杆菌K13对不用抗生素的敏感性，用打孔器制备直径7毫米的滤纸片，高温灭菌。在溶化后冷却至50摄氏度～55摄氏度的LB固体培养基中加入1毫升供试菌株种子液，摇匀后倒平板，将灭菌后的滤纸片置于平板中，然后在滤纸上添加抗生素溶液，添加量相当于氨苄青霉素Amp 50微克每毫升、卡那霉素Kana 50微克每毫升、氯霉素Chl 50微克每毫升、链霉素Str 50微克每毫升、四环素Tet 50微克每毫升、红霉素Ery 50微克每毫升、利福平Rif 50微克每毫升、头孢霉素Cef 50微克每毫升。放置于28摄氏度恒温培养箱内培养，分别于24小时、48小时观察结果。

4)实验结果

表9 抗生素抗性实验结果

注：“+”为出现抑菌圈，“-”为不出现抑菌圈。

实施例4

生防菌Baisha2C对植物病原真菌的抑制效果

在事先备好的PDA平板中央，接种直径为6mm的供试病原菌菌块，同时在距PDA平板中心25mm的对称两点处接种待测细菌，每株菌重复3次，28℃恒温倒置培养，3d后观察抑菌状况。

以上所披露的仅为本发明的较佳实施例，不能以此来限定本发明的权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一株生防菌Baisha2C，其特征在于，所述的生防菌为枯草芽孢杆菌，保藏号为：CGMCC No.10963。

2.一种权利要求1所述生防菌Baisha2C的培养基，其特征在于，所述培养基为LB培养基或者YEP培养基。

3.权利要求1所述的生防菌Baisha2C在防治植物真菌病害中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述植物真菌病害由镰孢炭疽菌、胶孢炭疽菌或镰刀菌引起。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述植物真菌病害为甘蔗赤腐病、胡椒枯萎病和橡胶炭疽病的一种或几种。

6.一种生物防治剂，含有权利要求1所述的生防菌或其发酵液。

7.权利要求6所述的生物防治制剂在防治植物真菌病害的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述植物真菌病害由镰孢炭疽菌、胶孢炭疽菌或镰刀菌引起。

9.一种植物土传病害的生物防治方法，其特征在于，向具有真菌病害的植物施用权利要求1的生防菌或权利要求6的生物防治剂。