CN106520572B - 一种香椿内生真菌56-50及其次级代谢产物、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株香椿内生真菌56‑50，该真菌为半知菌类、丝孢菌纲、丝孢菌目、暗色丝孢菌、链格孢属、苹果链格孢Alternaria mali；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月30日，保藏号：CGMCC No.12980。本发明首次从香椿植物茎中分离得到一株内生真菌Alternaria mali，该菌次级代谢产物对铜绿假单胞菌和变形杆菌具有较好的抑制作用。本发明所述的制备香椿内生真菌56‑50(Alternaria mali)次级代谢产物的方法简单易行，成本低。

Description

一种香椿内生真菌56-50及其次级代谢产物、制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种香椿内生真菌56-50及其次级代谢产物、制备方法和应用。

背景技术

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿假单胞菌可造成死亡。

变形杆菌也是一种条件致病菌，广泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐败有机物及人或动物的肠道内，能引起多种感染。常见感染有呼吸道感染、腹泻、尿路感染、腹膜炎、中耳炎、乳突炎、心内膜炎、脑膜炎入败血症，还可引起食物中毒。

铜绿假单胞菌和变形杆菌等细菌感染者常用抗生素治疗，如庆大霉素、阿莫西林等。但随着这些抗真菌药物的广泛应用，导致了大量耐药菌株的出现，这就给临床治疗带来很大的困难和挑战，急需研制新型的抗真菌药物。

由于植物体内天然活性物质含量较低，提取工艺复杂，以及植物资源往往受地理环境和生态条件等因素的影响，亟需新的研发策略发现新型天然药物。

植物内生真菌则弥补了传统植物提取天然活性物质的局限。根据共生理论，植物内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，同时植物内生真菌作为微生物，具有生长速度快、发酵生产周期短、易于工业化发酵等特点，从而使植物内生真菌成为寻找和发现各种天然生物活性物质的新资源。许多源于植物内生真菌的次生代谢产物被鉴定出具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、杀虫以及酶抑制剂等多种生物学活性。植物内生真菌所产生的结构新颖、活性多样的化合物为新型抗真菌药物的发现提供了重要的先导化合物和新的药物作用靶点，成为天然活性产物和新药开发的重要来源。

发明内容

为克服现有铜绿假单胞菌和/或变形杆菌感染治疗难题，本发明的目的旨在提供一种香椿内生真菌56-50及其次级代谢产物、制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种香椿内生真菌56-50，该真菌为半知菌类、丝孢菌纲、丝孢菌目、暗色丝孢菌、链格孢属、苹果链格孢Alternaria mali；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月30日，保藏号：CGMCC No.12980，分类命名：苹果链格孢Alternaria mali。

本发明提供了两种制备香椿内生真菌56-50的次级代谢产物的方法，具体如下：

方法一，步骤如下：

（1）菌株发酵：

将保藏号为CGMCC No.12980的香椿内生真菌56-50接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，25-28℃、150-180rpm摇床发酵培养6-8d；

（2）菌株次级代谢产物的制备：

将步骤（1）所得菌株56-50的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取数次，合并萃取液，浓缩制备得到香椿内生真菌56-50的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准。

方法二，步骤如下：

（1）菌株发酵：

将保藏号为CGMCC No.12980的香椿内生真菌56-50接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，室温静置发酵培养25-30d；

（2）菌株次级代谢产物的制备：

将步骤（1）所得菌株56-50的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；发酵液用等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，合并萃取液，真空浓缩至干，得到发酵液的乙酸乙酯层萃取物；菌丝体用80v%的丙酮水溶液浸泡提取，反复提取数次，合并提取液，真空浓缩至不含丙酮后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，然后合并萃取液并且真空浓缩至干，得到菌丝体的乙酸乙酯层萃取物；最后合并发酵液与菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，即得香椿内生真菌TS8的次级代谢产物。

利用上述两种制备方法制备的香椿内生真菌56-50的次级代谢产物。

所述香椿内生真菌56-50的次级代谢产物在降解铜绿假单胞菌和/或变形杆菌中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明首次从香椿植物茎中分离得到一株内生真菌56-50 (Alternariamali)，该菌的次级代谢产物具有抑制细菌活性作用，对铜绿假单胞菌和变形杆菌具有较好的抑制作用；

（2）所述的制备香椿内生真菌56-50 (Alternaria mali) 次级代谢产物的方法简单易行，成本低。

附图说明

图1为实施例1香椿内生真菌56-50的菌株形态特征，其中a为菌落形态，b为孢子形态。

图2为实施例1香椿内生真菌56-50的18S rDNA基因片段扩增图谱，其中1为18SrDNA基因片段扩增产物，2为DNA Ladder Mix Marker。

图3为实施例1香椿内生真菌56-50的ITS rDNA基因片段扩增图谱，其中1为DNALadder Mix Marker，2为ITS rDNA基因片段扩增产物。

图4为实施例1香椿内生真菌56-50菌株基于18S基因序列构建的系统进化树。

图5为实施例1香椿内生真菌56-50菌株基于ITS基因序列构建的系统进化树。

图6为实施例1香椿内生真菌56-50次级代谢产物的抑菌圈。

图7为实施例2香椿内生真菌56-50次级代谢产物的抑菌圈。

具体实施方式

下面结合具体实施例进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施例的限制。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中：

供试香椿材料：采自河南省郑州市中牟县田庄村河南省农业科学院香椿示范基地。

供试菌株：购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) ACCC10500和豪氏变形杆菌(Proteus hauseri) ACCC10497。

PDA平板培养基和/或PDA斜面培养基的重量百分比组成为：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂2%，余量为水，pH 6.0；PDA液体发酵培养基的重量百分比组成为：土豆20%、葡萄糖1%、麦芽糖2%、甘露醇2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、味精0.5%，余量为水，pH 6.0。

营养肉汁培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl 0.5%，余量为水，pH 7.0。

营养肉汁琼脂培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl0.5%，琼脂2%，余量为水，pH 7.0。

胰化酪蛋白大豆肉汁培养基的重量百分比组成为：TSB 3%，余量为水，pH自然。

胰化酪蛋白大豆肉汁琼脂培养基的重量百分比组成为：TSB 3%，琼脂2%，余量为水，pH自然。

实施例1

1. 香椿内生真菌的分离与筛选

在无菌操作条件下，将香椿茎依次经过75v%乙醇、有效氯1wt%次氯酸钠、75v%乙醇各浸泡1min，然后用无菌水漂洗3次，无菌吸水纸干燥；用灭菌后的剪刀将其剪成8mm小段，放在PDA平板培养基上，每板4根，于28℃恒温培养至茎末端长出菌丝，将菌丝转移到新的PDA平板培养基上划线培养，5d 后分离纯化得到单个菌落，然后转移到PDA斜面培养基试管中，28℃恒温培养5d 后，即获得香椿内生真菌56-50，4℃冰箱保存，备用，并于2016年9月30日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.12980。

2. 香椿内生真菌的鉴定

2.1 菌株形态特征观察

将4℃冰箱保存的香椿内生真菌56-50接种在PDA平板培养基上，置于28℃培养，分别在1、4及8天观察其培养特征和颜色变化。挑取菌落边缘菌丝，制作水浸片，在光学显微镜下观察菌丝体、孢子、孢子梗等。

2.2 菌株18S、ITS rDNA序列及其系统发育学分析

2.2.1 基因组DNA的提取

将4℃冰箱保存的香椿内生真菌56-50转接到PDA平板培养基上，28℃培养5天。基因组DNA的提取采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8259)，严格按照说明书操作。提取的基因组DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳检测(150 V，100mA 20 min)，4℃保存备用，或于-20℃中长期保存。

2.2.2 18S rDNA和ITS基因片段的PCR扩增

18S区域的扩增选择真核生物18S rDNA的通用扩增引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)，PCR反应条件：预变性94℃ 4min，变性94℃ 45s，退火55℃ 45s，延伸72℃ 1min，共30个循环，最后修复延伸72℃ 10min。

ITS区域的扩增选择真核生物ITS rDNA的通用扩增引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3’)，PCR反应条件：预变性94℃ 4min，变性94℃ 45s，退火55℃ 45s，延伸72℃ 1min，共30个循环，最后修复延伸72℃10min。

PCR扩增反应所用试剂购自上海生工有限公司，采用25μL的反应体系，包括ddH₂O19.8µl，PCR Buffer(10×, Mg⁺ plus) 2.5µl，dNTP(各2.5mM) 1µl，Primer-F(10µM) 0.5µl，Primer-R(10µM) 0.5µl，DNA 0.5µl，Taq polymerase 0.2µl。

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后4℃保存备用。

2.2.3 目的DNA序列测序和系统发育学分析

将18S rDNA和ITS rDNA的PCR产物交由上海生工有限公司进行测序。获得序列后，在NCBI中进行Blast比对，下载与供试菌株序列同源性相近的菌株序列利用ClustalX软件进行序列的多重比对，利用MEGA7.0软件N-J方法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，自展数为1000。

3. 菌株小量发酵

将4℃冰箱保存的香椿内生真菌56-50接种到PDA平板培养基上，28℃培养箱活化培养4d，然后接种到盛有200mL PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，28℃、150rpm摇床发酵培养7d。

4. 菌株次级代谢产物的制备

菌株发酵完成后，香椿内生真菌56-50的发酵培养液先用匀浆搅拌机搅碎，再用布氏漏斗抽滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取3次，合并萃取液，浓缩，制备得到香椿内生真菌56-50的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准。

5. 离体抑菌活性测定

采用琼脂扩散法中的管碟法。

5.1 香椿内生真菌56-50的次级代谢产物用无水乙醇溶解配成20mg/mL质量浓度的溶液，作为供试样液。

5.2 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)接种于营养肉汁培养基中，30℃培养12h，获得菌悬液。

5.3 将营养肉汁琼脂培养基在121℃下高压灭菌30min，冷却至约40-50℃后，在净化工作台上将无菌培养基倒入90mm无菌培养皿中，培养基凝固后，吸取200µL菌悬液置于培养皿中央，用涂布棒涂布均匀，然后用灭菌镊子在培养皿中放入无菌牛津杯，在其中加入200µL供试样液（平行3次），于30℃培养12h后观察并测定抑菌圈的直径。同时作溶剂和阳性对照实验，其中，阳性对照为1mg/mL链霉素。

6. 结果

6.1 菌株形态特征

菌落形态特征：菌株56-50在PDA平板培养基上培养1d，可产生零星的放射状白色菌丝，4d后菌落直径为6.0cm，绒毛状或棉絮状，具明显的同心轮纹，中央为墨绿色，外部淡黄色至灰绿色，菌落平坦，表面具少量稀疏的白色气生菌丝（图1a），8d后菌落布满培养皿。

孢子形态特征：分生孢子顶生，暗褐色，近卵形；分生孢子梗单生，深褐色，具明显的隔膜（图1b）。

6.2 菌株的18S、ITS序列及其系统发育学分析

18S和ITS rDNA基因片段的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，如图2、3所示，扩增产物分别为1300bp和500bp左右的特异性扩增条带，大小与期望值相符。18S和ITS rDNA基因片段的PCR扩增产物由上海生工有限公司进行测序，测序结果，分别如序列表SEQ IDNo.1和序列表SEQ ID No.2所示，表明：该菌株的18S和ITS rDNA基因序列长度分别为1322bp和541bp。

将PCR扩增获得的18S rDNA序列（SEQ ID No.1）在NCBI中进行BLAST分析，结果表明，菌株56-50的18S rDNA序列与链格孢属Alternaria sp.的18S序列同源性最高，相似性达100%。利用ClastalX与Mega5.0软件，基于18S rDNA序列构建系统发育树，见图4，从系统进化树上可以看出，每一个属分别形成一个独立的分枝，菌株56-50与Alternaria sp.(KT192438.1)和Alternaria sp.(GQ253348.1)处于同一分枝，亲缘关系最近，判断该菌株为链格孢属。

将PCR扩增获得的ITS rDNA序列（SEQ ID No.2）在NCBI中进行BLAST比对，结果表明，该序列与Alternaria mali的ITS序列同源性很高，相似性达100%。基于ITS rDNA序列构建系统发育树，见图5，从系统发育树可以看出每一个种分别形成一个独立的分枝，菌株56-50与Alternaria mali(EU732731.1)聚为一枝，表现出非常近的亲缘关系。

综合菌落形态、显微形态特征以及18S和ITS rDNA基因序列分析结果，将香椿内生真菌56-50鉴定为半知菌类、丝孢菌纲、丝孢菌目、暗色丝孢菌、链格孢属、苹果链格孢Alternaria mali。

6.3 抑菌活性

如图6所示，香椿内生真菌菌株56-50的次级代谢产物对铜绿假单胞菌的抑菌圈为23.25±1.60 mm，大于1mg/mL阳性对照链霉素的抑菌圈(17.52±0.99 mm)。所以该菌株次级代谢产物对铜绿假单胞菌具有较好的抑制作用。

实施例2

与实施例1基本相同，区别在于：本实施例按照以下主要步骤完成菌株次级代谢产物的发酵、制备及抑菌活性测定。

1-2步骤同实施例1。

3.菌株小量发酵：

将4℃冰箱保存的香椿内生真菌56-50接种到PDA平板培养基上，28℃培养箱活化培养4d，然后接种到盛有200mL PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，室温静置发酵培养7d。

4.菌株次级代谢产物的制备：

菌株发酵完成后，菌株56-50的发酵培养液先用匀浆搅拌机搅碎，然后布氏漏斗抽滤，得到发酵液和菌丝体；发酵液用等量乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，合并发酵液的乙酸乙酯层萃取物，真空浓缩至干，即得到发酵液的乙酸乙酯层萃取物；菌丝体用80v%的丙酮水溶液（即丙酮在水溶液中占的体积分数为80%）浸泡提取，反复3次，合并提取液，真空浓缩至不含丙酮后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，重复3次，然后合并乙酸乙酯萃取液并且真空浓缩至干，即得到菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，最后合并得到发酵液与菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，即为香椿内生真菌56-50的次级代谢产物。

5.活性测定

采用琼脂扩散法中的管碟法。

5.1香椿内生真菌56-50的次级代谢产物用无水乙醇溶解配成20mg/mL质量浓度的溶液，作为供试样液。

5.2豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)接种于胰化酪蛋白大豆肉汁培养基中，30℃培养12h，获得菌悬液。

5.3 将胰化酪蛋白大豆肉汁琼脂培养基在121℃下高压灭菌30min，冷却至约45℃后，在净化工作台上将无菌培养基倒入90mm无菌培养皿中，培养基凝固后，吸取200µL菌悬液置于培养皿中央，用涂布棒涂布均匀，然后用灭菌镊子在培养皿中放入无菌牛津杯，在其中加入200µL供试样液（平行3次），于30℃培养12h后观察并测定抑菌圈的直径。同时作溶剂和阳性对照实验，其中，阳性对照为1mg/mL链霉素。

6.结果

如图7所示，香椿内生真菌菌株56-50的次级代谢产物对豪氏变形杆菌的抑菌圈为25.14±3.18 mm，而1mg/mL阳性对照链霉素的抑菌圈仅为19.03±1.66 mm。所以该菌株次级代谢产物对豪氏变形杆菌具有比较显著的抑制作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种香椿内生真菌56-50及其次级代谢产物、制备方法和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1322

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tgtcgcatta taccgtgaaa ctgcgaatgg ctcattaaat cagttatcgt ttatttgata 60

ataccttact acttggataa ccgtggtaat tctagagcta atacatgctg aaaatcccga 120

cttcggaagg gatgtgttta ttagataaaa aaccaatgcc cttcggggct ttttggtgat 180

tcatgataac tttacggatc gcatagcctt gcgctggcga cggttcattc aaatttctgc 240

cctatcaact ttcgatggta aggtattggc ttaccatggt ttcaacgggt aacggggaat 300

tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag gaaggcagca 360

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<210> 2

<211> 541

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

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taatggatgc tagacctttg ctgatagaga gtgcgacttg tgctgcgctc cgaaaccagt 120

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caccaagcaa agcttgaggg tacaaatgac gctcgaacag gcatgccctt tggaatacca 240

aagggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacactact 300

tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt 360

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tggtgggcga acccaccaag gaaacaagaa gtacgcaaaa gacaagggtg aataattcag 480

caaggctgta accccgagag gttccagccc gccttcatat ttgtgtaatg atccctccgc 540

a 541

Claims (5)

1.一种香椿内生真菌56-50，其特征在于：该真菌为半知菌类、丝孢菌纲、丝孢菌目、暗色丝孢菌、链格孢属、苹果链格孢（Alternaria mali），并于2016年9月30日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.12980。

2.一种制备香椿内生真菌56-50的次级代谢产物的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）菌株发酵：

将保藏号为CGMCC No.12980的香椿内生真菌56-50接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，25-28℃、150-180rpm摇床发酵培养6-8d；

（2）菌株次级代谢产物的制备：

将步骤（1）所得菌株56-50的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取数次，合并萃取液，浓缩制备得到香椿内生真菌56-50的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准。

3.一种制备香椿内生真菌56-50的次级代谢产物的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）菌株发酵：

将保藏号为CGMCC No.12980的香椿内生真菌56-50接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，室温静置发酵培养25-30d；

（2）菌株次级代谢产物的制备：

将步骤（1）所得菌株56-50的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；发酵液用等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，合并萃取液，真空浓缩至干，得到发酵液的乙酸乙酯层萃取物；菌丝体用80v%的丙酮水溶液浸泡提取，反复提取数次，合并提取液，真空浓缩至不含丙酮后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，然后合并萃取液并且真空浓缩至干，得到菌丝体的乙酸乙酯层萃取物；最后合并发酵液与菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，即得香椿内生真菌TS8的次级代谢产物。

4.一种利用如权利要求2或3所述制备香椿内生真菌56-50的次级代谢产物的方法制备的香椿内生真菌56-50的次级代谢产物。

5.一种如权利要求4所述香椿内生真菌56-50的次级代谢产物在抑制铜绿假单胞菌和/或变形杆菌中的应用。