CN103589646B - 一种木霉菌株及其用途和厚垣孢子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木霉菌株，该木霉菌株为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的一个菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：5812。本发明还提供了如上所述的木霉菌株在防治植物病害中的用途。本发明还提供了一种厚垣孢子的制备方法，该方法包括：将如上所述的木霉菌株进行液体深层发酵以产生厚垣孢子。本发明还提供了如上所述的制备方法得到的厚垣孢子。通过上述技术方案，本发明能够显著地提高木霉菌防治病害的效果。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种木霉菌株、该木霉菌株的用途和一种厚垣孢子以及该厚垣孢子的制备方法。
背景技术
木霉菌(Trichoderma spp.)属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的腐生真菌，是真菌类中最有潜力的植物病害生物防治菌株，可用来防治多种植物真菌性病害。常见的木霉属种类有哈茨木霉（T.harzianum）、哈氏木霉（T.hamatum）、多孢木霉（T.polysporum）、康氏木霉（T.koningii）、拟康氏木霉（T.pseudokoningii）、绿色木霉（T.viride）和长枝木霉（T.longibrachiatum）等。在众多种类中，绿色木霉和哈茨木霉在植病防治防治效果方面表现尤为突出，是目前生产上主要应用的菌株。
木霉菌在其生长周期内可以产生三种繁殖体，包括菌丝体、厚垣孢子和分生孢子。木霉菌的分生孢子形成于瓶形小梗上，分生孢子近球形，椭圆形，或短倒卵形，壁光滑或细胞壁上明显而微小粗糙突起，浅色或无色，大小约3.5×3.2μm。木霉菌常常形成厚垣孢子，在基内菌丝上间生，或者在营养菌丝侧枝的尖端端生，圆形或椭圆形，无色至浅黄色或绿色，大小约9.5×11.5μm，表面光滑，细胞壁加厚，无性生殖产生，通常有耐不良环境条件的能力。厚垣孢子是木霉菌重要的繁殖体形式。木霉属厚垣孢子在土壤中存活能力要优于分生孢子，至少能存活20月。
土传病害是我国目前农业生产中的主要病害之一，特别是在保护地、多年连作地，土传病害常常导致严重减产，甚至毁苗绝收。木霉菌能够增加作物根际有益微生物的菌群数量，改善作物根际的微生物菌群结构，起到防治病害的作用，但是防治病害的效果仍有待提高。
发明内容
本发明的目的是提高木霉菌防治病害的效果，提供一种具有更好的防治病害效果的木霉菌菌株。
为了实现上述目的，本发明提供一种木霉菌株，该木霉菌株为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的一个菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：5812。
本发明还提供了如上所述的木霉菌株在防治植物病害中的用途。
本发明在授权专利“木霉菌液体深层发酵产厚垣孢子的方法”（ZL200610057339.0）的基础上，使用了特定的木霉菌株，从而提供了该菌株厚垣孢子的制备方法，该方法包括：将如上所述的木霉菌株进行液体深层发酵以产生厚垣孢子。
本发明还提供了如上所述的制备方法得到的厚垣孢子。
通过上述技术方案，本发明能够显著地提高木霉菌防治病害的效果，例如，相对于购自中国农业微生物保藏管理中心的商品牌号为ACCC30371哈茨木霉菌种，本发明的木霉菌种能够将棉花黄萎病的病情指数降低25%以上。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的木霉菌株的分类命名为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），于2012年2月27日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC：5812。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种木霉菌株，该木霉菌株为哈茨木霉（Trichodermaharzianum）的一个菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：5812。
其中，本发明提供的木霉菌株的生理状态为菌丝体、厚垣孢子和分生孢子中的至少一种。
本发明还提供了如上所述的木霉菌株在防治植物病害中的用途。本发明提供的木霉菌株可以对常规的其它木霉菌能够防治的植物病害均起到有效防治的作用。优选地，本发明提供的木霉菌株对土传植物病害具有更好的防治效果；特别优选地，本发明提供的木霉菌株对棉花黄萎病、棉花枯萎病、水稻立枯病和香蕉枯萎病具有更好的防治效果。即，优选所述土传植物病害为棉花黄萎病、棉花枯萎病、水稻立枯病和香蕉枯萎病中的至少一种。
本发明还提供了该菌株厚垣孢子的制备方法，该方法包括：将如上所述的木霉菌株进行液体深层发酵以产生厚垣孢子。
其中，所述液体深层发酵的操作可以按照常规的液体深层发酵方法进行，优选情况下，所述液体深层发酵的操作包括如下步骤：（1）接种步骤，在所述接种步骤中，将如上所述的木霉菌株的分生孢子和/或菌丝体接种到液体培养基中；（2）发酵步骤，在所述发酵步骤中，将接种了木霉菌株分生孢子和/或菌丝体的液体培养基在发酵罐中进行发酵。
其中，所述的木霉菌株的分生孢子和/或菌丝体可以使用常规的斜面培养法获得，例如，可以将如上所述的木霉菌株的菌丝体接种在PDA培养基（含有马铃薯180-220g/L，葡萄糖18-22g/L，琼脂10-25g/L）上，在27-29℃下培养5-7天，即可得到大量附着在培养基上的分生孢子和/或菌丝体，可以将斜面培养结束的培养基挖块以得到用于接种的分生孢子和/或菌丝体。其中，也可以将斜面培养结束的培养基挖块并接种于液体培养基中扩大培养，得到扩大培养的分生孢子和/或菌丝体，将扩大培养的分生孢子和/或菌丝体作为用于接种的菌丝体和/或菌丝体。
其中，所述发酵的条件可以为常规的液体深层发酵条件，优选情况下，所述发酵的条件包括：发酵第0-40小时的发酵温度为27.5-28.5℃；发酵第40小时以后的发酵温度为25.5-26.5℃；发酵第0-10小时的通气量为1:0.55-0.65体积:(体积·分钟)；发酵第10-40小时的通气量为1:0.9-1.1体积:(体积·分钟)，发酵第40小时以后的通气量为1:0.55-0.65体积:(体积·分钟)；搅拌速度为175-185rpm。
其中，所述液体培养基可以为常规的适用于木霉菌的液体深层发酵的培养基，如ZL200610057339.0中所记载的培养基，优选情况下，所述液体培养基含有由以下重量百分比混合得到的物料：2-3.5%的淀粉、1-2%的酵母粉、4-8%的玉米浆、0.1-0.5%的CaCO3、0.01-0.02%的Zn2+、0.01-0.03%的Mg2+和余量的水。
其中，为了进一步提高厚垣孢子的产量，所述发酵的条件还包括：在发酵第60-63小时，相对于每100升的发酵液，补加0.45-0.55kg的淀粉。
其中，所述发酵进行的总时间可以为进行木霉菌发酵常规采用的时间，优选情况下，在发酵的第100-120小时左右结束发酵，此时，90%以上的菌丝体都形成了厚垣孢子，因而可以进一步提高厚垣孢子的产量。
其中，结束发酵以后，可以通过过滤、离心和干燥等方法从结束发酵的发酵液中分离得到厚垣孢子，也可以直接将结束发酵的发酵液作为含有厚垣孢子的产品使用。
本发明还提供了根据如上所述的制备方法得到的厚垣孢子。
本发明提供的木霉菌株，可以菌丝体、厚垣孢子和分生孢子中的至少一种生理状态用于防治病害。优选情况下，使用所述木霉菌株的厚垣孢子来防治病害。
其中，防治病害的操作可以按照常规的利用木霉菌防治病害的操作进行，例如，可以将所述木霉菌株的厚垣孢子直接施用于土壤来防治病害，优选地，将所述木霉菌株的厚垣孢子与粪肥颗粒混合后施用于土壤来防治病害。
其中，所述粪肥颗粒可以为常规使用的各种粪肥颗粒，例如将200-400kg的鸡粪、600-800kg的腐殖酸和200-600kg的水混合，并接种除臭菌种90-110g后在15-40℃下发酵除臭9-11天，然后滚筒造粒和干燥后得到的直径4-5mm的粪肥颗粒。其中，所述除臭菌种可以为常规使用的、能商购得到的各种用于除臭的菌种。例如，可以使用购自河南宝融生物科技有限公司的BM菌剂-发酵剂或购自郑州基业生物工程有限公司的速腐剂。其中，除臭菌种的重量是以干重计算的。
其中，将所述木霉菌株的厚垣孢子与粪肥颗粒混合的操作可以为常规的混合操作，为了提高混合后的物料的均匀性和储藏性能，优选情况下，将所述木霉菌株的厚垣孢子与粪肥颗粒混合的操作可以包括：将900-1100kg的粪肥颗粒、0.8-1.2kg的本发明的木霉菌种的厚垣孢子和1-3kg的糖稀在不高于60℃的温度下进行包衣，得到包衣产物。所得到的包衣产物具有较好的均匀性和储藏性能。其中，优选情况下，每克包衣产物中的厚垣孢子数量不少于105个。
其中，将所述木霉菌株的厚垣孢子与粪肥颗粒混合后得到的物料施用于田间时，以厚垣孢子的量计算，施用量可以在很大范围内变化，例如可以为5×104至2×105个厚垣孢子/平方米。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，将汁与2g葡萄糖、1.5g琼脂和水配成100ml，装瓶灭菌后冷却得到PDA培养基。
将195kg的淀粉、130kg的酵母粉、325kg的玉米浆、19.5kg的CaCO3、2.4kg的ZnSO4（以使Zn2+为0.015重量%）、6.5kg的MgSO4（以使Mg2+为0.02重量%），加水至6.5m3，混匀并灭菌，得到液体培养基。
将保藏号为CGMCC NO：5812的哈茨木霉菌株接种于PDA培养基，28℃下培养6天；将接种并培养后的PDA培养基挖块接种于摇瓶液体培养基中（100ml液体培养基接种PDA培养基生长的菌苔1cm2），在28℃和转速200rpm的条件下，培养24小时，作为发酵种子罐接种体；将培养好的摇瓶接种体接入灭菌后的种子罐培养基中（接种量2%（v/v）），在28℃和转速180rmp的条件下，培养24小时，成为发酵种子；将发酵种子接入发酵罐培养基中进行控制发酵（接种量10%（V/V））。发酵罐中的发酵条件为：发酵第0-40小时的发酵温度为28℃；发酵第40小时以后的发酵温度为26℃；发酵第0-10小时的通气量为1:0.6体积:(体积·分钟)；发酵第10-40小时的通气量为1:1体积:(体积·分钟)，发酵第40小时以后的通气量为1:0.6体积:(体积·分钟)；搅拌速度为180rpm。
在发酵罐的发酵过程中进行补料。即于发酵第62小时时，相对于每100升的发酵液，补加0.5kg的淀粉。
发酵第110小时时，90%以上菌丝都形成厚垣孢子，发酵液变稀，将此时的发酵液压滤并将收集压滤得到的滤物，得到厚垣孢子。将该厚垣孢子进行显微形态观察，证实该厚垣孢子具有典型的哈茨木霉的厚垣孢子形态。
将300kg的鸡粪、700kg的腐殖酸和330kg的水混合，并接种除臭菌种（购自河南宝融生物科技有限公司的BM菌剂-发酵剂）100g后在15-40℃下发酵除臭10天，然后滚筒造粒和干燥后得到的直径4.5mm的粪肥颗粒。
将900-1100kg本实施例得到的粪肥颗粒、0.8-1.2kg的本实施例得到的哈茨木霉的厚垣孢子和1-3kg的糖稀在不高于60℃的温度下进行包衣，得到包衣产物。
对比例1
采用实施例1的方法制备包衣产物，不同的是，所用的哈茨木霉菌种为购自中国农业微生物保藏管理中心的商品牌号为ACCC30371的哈茨木霉菌种。
测试实施例1
将实施例1和对比例1得到的包衣产物分别作为微生物有机肥1和微生物有机肥2，以厚垣孢子的量计算，施用量为1×105个厚垣孢子/平方米，将无机化肥（每亩施尿素21kg，过磷酸钙52kg，硫酸钾11kg）作为常规施肥，按照文献（利用木霉菌防治棉花黄萎病，植物保护学报，第30卷，2003年第3期，284-288页）中的方法，于2010年在新疆石河子地区，对比了微生物有机肥1、微生物有机肥2和常规施肥对棉花黄萎病的防治效果、对棉花产量的影响和对棉花品质影响，结果如表1-3所示。结果证明，本发明的哈茨木霉菌种能够显著地提高木霉菌防治病害的效果。
表1 微生物有机肥对棉花黄萎病的防治作用
表2：微生物有机肥对棉花产量的影响
表3：微生物有机肥对棉花品质影响，绒长（cm）
| 施肥 | 平均（10次测量） |
| 微生物有机肥1 | 33.95 |
| 微生物有机肥2 | 32.5 |
| 常规施肥 | 29.5 |
测试实施例2
将实施例1和对比例1得到的包衣产物分别作为微生物有机肥1和微生物有机肥2，以厚垣孢子的量计算，施用量为5×104个厚垣孢子/平方米，将无机化肥作为常规施肥，按照文献（GB/T 17980.92-2004，杀菌剂防治棉花黄、枯萎病）中的方法，对比了微生物有机肥1、微生物有机肥2和常规施肥对棉花枯萎病的防治效果，其中微生物有机肥1与微生物有机肥2相比，棉花枯萎病的病情指数平均下降了28%，微生物有机肥1与常规施肥相比，棉花枯萎病的病情指数平均下降了52%。结果证明，本发明的哈茨木霉菌种能够显著地提高木霉菌防治病害的效果。
测试实施例3
将实施例1和对比例1得到的包衣产物分别作为微生物有机肥1和微生物有机肥2，以厚垣孢子的量计算，施用量为2×105个厚垣孢子/平方米，将无机化肥作为常规施肥，按照文献（哈茨木霉与多菌灵复合使用对水稻苗期立枯病的防治，浙江大学学报（农业与生命科学版），第35卷，第65-70页）中的方法，对比了微生物有机肥1、微生物有机肥2和常规施肥对水稻苗期立枯病的防治效果，其中微生物有机肥1与微生物有机肥2相比，水稻苗期立枯病的相对防效平均提高了11%，微生物有机肥1与常规施肥相比，水稻苗期立枯病的相对防效平均提高了40%。结果证明，本发明的哈茨木霉菌种能够显著地提高木霉菌防治病害的效果。
测试实施例4
将实施例1和对比例1得到的包衣产物分别作为微生物有机肥1和微生物有机肥2，以厚垣孢子的量计算，施用量为4×105个厚垣孢子/平方米，将无机化肥作为常规施肥，按照文献（生物农药“蔬得康”对香蕉枯萎病的防治试验，江苏农业科学，第39卷，第199-201页）中的方法，对比了微生物有机肥1、微生物有机肥2和常规施肥对香蕉枯萎病的防治效果，其中微生物有机肥1与微生物有机肥2相比，香蕉枯萎病的相对防效平均提高了15%，微生物有机肥1与常规施肥相比，香蕉枯萎病的相对防效平均提高了50%。结果证明，本发明的哈茨木霉菌种能够显著地提高木霉菌防治病害的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种木霉菌株，该木霉菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：5812。
2.权利要求1所述的木霉菌株在防治植物病害中的用途，其中，所述植物病害为棉花黄萎病、棉花枯萎病、水稻立枯病和香蕉枯萎病中的至少一种。
3.一种厚垣孢子的制备方法，该方法包括：将权利要求1所述的木霉菌株进行液体深层发酵以产生厚垣孢子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述液体深层发酵的操作包括如下步骤：
(1)接种步骤，在所述接种步骤中，将权利要求1所述的木霉菌株的分生孢子和/或菌丝体接种到液体培养基中；
(2)发酵步骤，在所述发酵步骤中，将接种了所述木霉菌株的分生孢子和/或菌丝体的液体培养基在发酵罐中进行发酵，所述发酵的条件包括：发酵第0-40小时的发酵温度为27.5-28.5℃；发酵第40小时以后的发酵温度为25.5-26.5℃；发酵第0-10小时的通气量为1:0.55-0.65体积:(体积·分钟)；发酵第10-40小时的通气量为1:0.9-1.1体积:(体积·分钟)，发酵第40小时以后的通气量为1:0.55-0.65体积:(体积·分钟)；搅拌速度为175-185rpm。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述液体培养基含有由以下重量百分比混合得到的物料：2-3.5％的淀粉、1-2％的酵母粉、4-8％的玉米浆、0.1-0.5％的CaCO3、0.01-0.02％的Zn2+、0.01-0.03％的Mg2+和余量的水。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其中，所述发酵的条件还包括：在发酵第60-63小时，相对于每100升的发酵液，补加0.45-0.55kg的淀粉。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的制备方法得到的厚垣孢子。
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