CN109536433A - 哈茨木霉高活性孢子粉制备方法 - Google Patents

哈茨木霉高活性孢子粉制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明为哈茨木霉高活性孢子粉制备方法，包括：将哈茨木霉菌株进行逐级扩大发酵，从一级种、二级种、三级种的制备生产，到采用分阶液体发酵法生产高浓度哈茨木霉厚垣孢子发酵液，然后对所得发酵液进行浓缩，并添加不同的功能助剂及填料进行干燥处理，得到哈茨木霉高活性孢子粉。本发明使得哈茨木霉厚垣孢子有效活菌数达到2×109cfu/g及以上，具有高活性、货架期长、萌发率高、快速适应土壤环境等优点。

Description

哈茨木霉高活性孢子粉制备方法
技术领域
本发明涉及一种哈茨木霉厚垣孢子发酵技术及高活菌数孢子粉制备方法。
背景技术
哈茨木霉具有多种生防及促生性能，其效果好、环保安全，越来越受到市场欢迎。而哈茨木霉孢子具有耐贮存、便于运输、易于施用等特点，因此，为实现哈茨木霉的商品化，制备高浓度、高活性、低成本哈茨木霉孢子粉成为制剂开发的重点。
哈茨木霉有两种孢子形式，一种是菌丝侧枝上生出的分生孢子，另一种是菌丝直接分裂而来的厚垣孢子。目前，市场上商业化的哈茨木霉产品多为分生孢子制剂，分生孢子容易培养，产量大，但分生孢子抗逆能力差，制剂货架期短，田间应用效果不稳定；而厚垣孢子抗逆性强、存活期长、易于加工贮存、田间应用效果稳定并显著高于其分生孢子制剂，但不易培养，商品化的木霉菌厚垣孢子制剂在国内外非常少。
常用的哈茨木霉孢子粉制备方法，一是将哈茨木霉固体培养物风干或烘干，粉碎后，通过过筛或风力分级等不同方式收集；二是直接水洗、过滤、低温干燥等方法进行哈茨木霉孢子收集。这些收集方法各有优缺点，若采用第一种方法，培养物烘干和干燥的总次数为n，最终得到孢子数量比起始培养物减少了10 n次方倍；若采用第二种方法，虽然保证了产物孢子存活率，但工艺繁琐，干燥时间较长，能耗较高，成本大幅增加，削弱了产品的市场竞争能力。
发明内容
本发明目的在于提供一种 制备工艺简单，成本低，产物孢子存活率高的本发明的哈茨木霉高活性孢子粉制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种哈茨木霉高活性孢子粉制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）一级种制备，是将哈茨木霉接种到固体平板培养基上，待菌丝布满培养皿，完成一级种制备；
（2）二级种制备，是将一级种接种到制备好的液体培养基中，摇床培养，完成二级种制备；
（3）三级种制备，是将二级种接种到液体培养基中，发酵罐培养，完成三级种制备；
（4）哈茨木霉厚垣孢子发酵，是将三级种接种到厚垣孢子液体培养基中，发酵罐分两阶段培养，完成哈茨木霉厚垣孢子发酵培养；
所述哈茨木霉厚垣孢子发酵第一个阶段培养24～48h后，补充微量元素，调整发酵液pH、培养温度、进气量等液体发酵参数，进入第二个阶段发酵培养，培养24～48h后完成哈茨木霉厚垣孢子发酵。
步骤（1）中，固体平板培养基为马丁氏（Martin）培养基，其组成成分为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，1%孟加拉红水溶液3.3mL/L，琼脂18～20g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌20min，培养条件为：培养温度为28～30℃；培养时间为4～7d。
步骤（1）中，固体平板培养基为PDA培养基，其组成成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18～20g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌30min，培养条件为：培养温度为28～30℃；培养时间为4～7d。
步骤（1）中，固体平板培养基为马丁培养基，其组成成分为：磷酸二氢钾1g/L，葡萄糖10 g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨5 g/L，1%孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂18～20g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌20min，培养条件为：培养温度为28～30℃；培养时间为4～7d。
步骤（2）、（3）中所述液体培养基，其组成成分为：10～40 g/L燕麦粉，蔗糖0.5～10g/L，磷酸二氢钾0.5～5 g/L，硫酸镁0.5～5 g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌20min。
步骤（2）中，接种量为用直径为5～10mm打孔器在一级种子上打孔，每100mL 液体培养基接种5～15块培养物，培养条件为：培养温度为28～30℃，转速60～120rpm/min，培养时间为24～72h。
步骤（3）中，接种量为每1L液体培养基，按体积比5～15%接种二级种；培养条件为：培养温度为28～30℃；转速60～120rpm/min，通气量为0.05～0.1MPa，培养时间为24～48h。
步骤（4）中，厚垣孢子液体培养基，其组成成分为：10～40 g/L燕麦粉、10～30 g/L黄豆粉、蔗糖5～20 g/L、磷酸二氢钾0.5～5 g/L、硫酸镁0.5～5 g/L中的3～5种，后补水定溶至1L，121℃高压灭菌30min，接种量为每1L厚垣孢子液体培养基，按体积比5～20%接种三级种。第一阶段培养条件为：培养温度为28～30℃；转速60～120rpm/min，通气量为0.05～0.1MPa，培养时间为24～48h，第一阶段结束后，每1L培养物加入无机盐母液，使得每升培养物含0.001～0.01 g氯化锰、0.01～0.05 g硫酸锌、0.001～0.01 g氯化铁中的1～3种，并加入适量0.5～1mol/L盐酸调整pH至6～4，第二阶段培养条件为：培养温度为20～27℃；转速140～200rpm/min，通气量为0.1～0.2MPa，培养时间为24～48h。
将步骤（4）发酵液制备成菌体浓缩液，采用微孔滤膜-过滤或微孔滤膜-离心脱水的方式制得高活性孢子粉，微孔滤膜孔径选用1～10μm。
将步骤（4）发酵液制备成菌体浓缩液，在浓缩液中加入一定比例的耐热冻干保护剂、润湿分散悬浮剂、填料等，搅拌均匀后进行喷雾干燥或低温真空冷冻干燥，制得高活性孢子粉，所述耐热冻干保护剂为海藻糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇、蛋白胨、吐温20、甘氨酸、谷氨酸钠、可溶性淀粉、棉子糖、半乳糖、果糖、蔗糖、二甲基亚枫中的1～3种；所述润湿分散悬浮剂为羧甲基纤维素钠、萘磺酸盐甲醛缩合物、木质素磺酸钠、聚乙烯醇、吐温85、脱脂奶粉中的1～3种；所述填料为白炭黑、草炭、高岭土、轻质碳酸钙、凹凸棒土、硅藻土、滑石粉中的1～2种。喷雾干燥工艺参数为：进口温度85～150℃，出口温度为60～95℃，频率为3～12HZ；低温真空冷冻干燥工艺参数为：预冻温度-100～ -50℃，预冻时间为1～5h，冻干厚度1～3cm，冻干时间28～40h。
本发明有如下优点：
制备工艺简单，成本低，产物孢子存活率高，杂菌率低，细度高，可生产高品质哈茨木霉制剂。哈茨木霉厚垣孢子有效活菌数达到2×109cfu/g及以上，具有高活性、货架期长、萌发率高、快速适应土壤环境等优点。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
1、制备一级种：
（1）制备PDA平板：取40g削皮马铃薯煮沸30min后，过滤得到马铃薯汁，加入葡萄糖4g，琼脂3.6g，补水定溶至200mL，121℃灭菌30min，灭菌后，倒入事先已灭菌的培养皿中，冷却备用；
（2）一级种制备：在无菌操作条件下，将哈茨木霉接种到PDA平板上，30℃培养5d。
2、制备二级种：
（1）培养基制备：取70g燕麦粉，1.8g蔗糖，1.8g磷酸氢二钾，2.1g硫酸镁，加水定容至3.5L，121℃灭菌20min；
（2）二级种制备：在无菌操作条件下，用孔径为6mm打孔器，在制备好的一级种平板上打孔，按7块/100mL接种量，接种到制备好的培养基中，摇床培养，培养温度30℃，转速120rpm/min, 培养时间50 h。
3、制备三级种：
（1）培养基制备：取700g燕麦粉，18g蔗糖，17.5g磷酸氢二钾，21g硫酸镁，熬成糊状后装入50L液体发酵罐，加入适量水，使灭菌冷却后发酵罐内所装培养终体积为31.5L，121℃灭菌20min；
（2）三级种制备：在无菌操作条件下，接种制备好的3.5L二级种，培养温度30℃，转速80rpm/min, 通气量0.06MPa，培养时间24h。
4、哈茨木霉厚垣孢子发酵：
（1）培养基制备：取8kg燕麦粉，5.3kg黄豆粉，3kg蔗糖，250g磷酸氢二钾，280g硫酸镁，熬成糊状后装入500L液体发酵罐，加入适量水，使灭菌冷却后发酵罐内所装培养终体积为315L，121℃灭菌30min；
（2）第一阶段发酵：在无菌操作条件下，接种制备好的35L三级种，培养温度30℃，转速80rpm/min, 通气量0.06MPa，培养时间24h；
（3）第二阶段发酵：加入已过滤除菌的100g/L氯化锰溶液4mL、200g/L硫酸锌溶液18mL、200g/L氯化铁溶液15mL，并加入1mol/L盐酸调整pH至5.7，培养温度调整至21℃，转速调整至160rpm/min，通气量调整至0.17 MPa，继续培养36h；
5、发酵液浓缩：
用10μm的微孔过滤膜对发酵液进行过滤，收集浓缩液备用。
6、高活性孢子粉制备：
每升浓缩液加入葡聚糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，50 g/L羧甲基纤维素钠，0.2 g/L聚乙烯醇，1 g/L吐温85，高岭土100 g/L，搅拌均匀后，进行低温真空冷冻干燥，干燥工艺参数为，预冻温度-98℃，预冻时间为1.5h，冻干厚度2.5cm，冻干时间40h。冻干完成后得到哈茨木霉高活性孢子粉，有效活菌数4.5×109cfu/g。
实施例2：
1、制备一级种：
（1）制备马丁氏平板：取1g蛋白胨，2g葡萄糖，0.2g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，1%孟加拉红水溶液0.66mL，琼脂3.6g，补水定溶至200mL，121℃灭菌20min，灭菌后，倒入事先已灭菌的培养皿中，冷却备用；
（2）一级种制备：在无菌操作条件下，将哈茨木霉接种到马丁氏平板上，28℃培养5d。
2、制备二级种：
（1）培养基制备：取78g燕麦粉，1.4g蔗糖，1.6g磷酸氢二钾，6g硫酸镁，加水定容至2L，121℃灭菌30min；
（2）二级种制备：在无菌操作条件下，用孔径为10mm打孔器，在制备好的一级种平板上打孔，按5块/100mL接种量，接种到制备好的培养基中，摇床培养，培养温度28℃，转速70rpm/min, 培养时间40h。
3、制备三级种：
（1）培养基制备：取360g燕麦粉，8.5g蔗糖，9g磷酸氢二钾，7g硫酸镁，熬成糊状后装入20L液体发酵罐，加入适量水，使灭菌冷却后发酵罐内所装培养终体积为12L，121℃灭菌20min；
（2）三级种制备：在无菌操作条件下，接种制备好的2L二级种，培养温度28℃，转速110rpm/min, 通气量0.06MPa，培养时间24h。
4、哈茨木霉厚垣孢子发酵：
（1）培养基制备：取1.5kg黄豆粉，2.5kg蔗糖，600g磷酸氢二钾，熬成糊状后装入200L液体发酵罐，加入适量水，使灭菌冷却后发酵罐内所装培养终体积为126L，121℃灭菌30min；
（2）第一阶段发酵：在无菌操作条件下，接种制备好的14L三级种，培养温度30℃，转速80rpm/min, 通气量0.1MPa，培养时间30h；
（3）第二阶段发酵：加入已过滤除菌的100 g/L氯化锰溶液13.5mL、200 g/L氯化铁溶液2.7mL，并加入1mol/L盐酸调整pH至4.3，培养温度调整至27℃，转速调整至150rpm/min，通气量调整至0.2MPa，继续培养40h；
5、发酵液浓缩：
用8μm的微孔过滤膜对发酵液进行过滤，收集浓缩液备用。
6、高活性孢子粉制备：
每升浓缩液加入谷氨酸钠10 g/L，可溶性淀粉90 g/L ，20 g/L 果糖，5 g/L脱脂奶粉，3 g/L木质素磺酸钠，萘磺酸盐甲醛缩合物，白炭黑20 g/L，凹凸棒土70 g/L ，搅拌均匀后，进行喷雾干燥，干燥工艺参数为，进口温度145℃，出口温度为95℃，频率为10HZ；喷雾干燥完成后得到哈茨木霉高活性孢子粉，有效活菌数2.1×109cfu/g。
实施例3：
1、制备一级种：
（1）制备马丁氏平板：取1g蛋白胨，2g葡萄糖，0.2g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，1%孟加拉红水溶液0.66mL，琼脂3.6g，补水定溶至200mL，121℃灭菌20min，灭菌后，倒入事先已灭菌的培养皿中，冷却备用；
（2）一级种制备：在无菌操作条件下，将哈茨木霉接种到马丁氏平板上，28℃培养5d。
2、制备二级种：
（1）培养基制备：取9g燕麦粉，7g蔗糖，0.35g磷酸氢二钾，0.04g硫酸镁，加水定容至0.7L，121℃灭菌30min；
（2）二级种制备：在无菌操作条件下，用孔径为6mm打孔器，在制备好的一级种平板上打孔，按8块/100mL接种量，接种到制备好的培养基中，摇床培养，培养温度29℃，转速90rpm/min, 培养时间72h。
3、制备三级种：
（1）培养基制备：取167g燕麦粉，130g蔗糖，10g磷酸氢二钾，52g硫酸镁，熬成糊状后装入20L液体发酵罐，加入适量水，使灭菌冷却后发酵罐内所装培养终体积为13L，121℃灭菌20min；
（2）三级种制备：在无菌操作条件下，接种制备好的0.7L二级种，培养温度29℃，转速90rpm/min, 通气量0.08MPa，培养时间40h。
4、哈茨木霉厚垣孢子发酵：
（1）培养基制备：取4.8kg燕麦粉，560g磷酸氢二钾，76g硫酸镁，熬成糊状后装入200L液体发酵罐，加入适量水，使灭菌冷却后发酵罐内所装培养终体积为127L，121℃灭菌30min；
（2）第一阶段发酵：在无菌操作条件下，接种制备好的13L三级种，培养温度29℃，转速90rpm/min, 通气量0.8MPa，培养时间40h；
（3）第二阶段发酵：加入已过滤除菌的200 g/L硫酸锌溶液30mL、200 g/L氯化铁溶液2mL，并加入0.8mol/L盐酸调整pH至5.9，培养温度调整至22℃，转速调整至200rpm/min，通气量调整至0.17MPa，继续培养28h；
5、发酵液浓缩：
用6μm的微孔过滤膜离心脱水对发酵液进行处理，收集浓缩液备用。
6、高活性孢子粉制备：
每升浓缩液加入甘氨酸50 g/L ，棉子糖90 g/L ，0.3 g/L聚乙烯醇，40 g/L脱脂奶粉，硅藻土80 g/L，轻质碳酸钙10 g/L ，搅拌均匀后，进行喷雾干燥，干燥工艺参数为，进口温度90℃，出口温度为65℃，频率为4HZ；喷雾干燥完成后得到哈茨木霉高活性孢子粉，有效活菌数3.2×109cfu/g。

Claims (10)

1.一种哈茨木霉高活性孢子粉制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）一级种制备，是将哈茨木霉接种到固体平板培养基上，待菌丝布满培养皿，完成一级种制备；
（2）二级种制备，是将一级种接种到制备好的液体培养基中，摇床培养，完成二级种制备；
（3）三级种制备，是将二级种接种到液体培养基中，发酵罐培养，完成三级种制备；
（4）哈茨木霉厚垣孢子发酵，是将三级种接种到厚垣孢子液体培养基中，发酵罐分第一、二阶段培养，完成哈茨木霉厚垣孢子发酵培养；
所述哈茨木霉厚垣孢子发酵第一阶段培养24～48h后，补充微量元素，调整发酵液pH、培养温度、进气量等液体发酵参数，进入第二个阶段发酵培养，培养24～48h后完成哈茨木霉厚垣孢子发酵。
2.根据权利要求1所述的制的备方法，其特征在于，步骤（1）中，固体平板培养基为马丁氏（Martin）培养基，其组成成分为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，1%孟加拉红水溶液3.3mL/L，琼脂18～20g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌20min，培养条件为：培养温度为28～30℃；培养时间为4～7d。
3.根据权利要求1所述的制的备方法，其特征在于，步骤（1）中，固体平板培养基为PDA培养基，其组成成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18～20g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌30min，培养条件为：培养温度为28～30℃；培养时间为4～7d。
4.根据权利要求1所述的制的备方法，其特征在于，步骤（1）中，固体平板培养基为马丁培养基，其组成成分为：磷酸二氢钾1g/L，葡萄糖10 g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨5 g/L，1%孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂18～20g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌20min，培养条件为：培养温度为28～30℃；培养时间为4～7d。
5.根据权利要求1所述的制的备方法，其特征在于，步骤（2）、（3）中所述液体培养基，其组成成分为：10～40 g/L燕麦粉，蔗糖0.5～10 g/L，磷酸二氢钾0.5～5 g/L，硫酸镁0. 5～5 g/L，最后补水定溶至1L，121℃高压灭菌20min。
6.根据权利要求5所述的制的备方法，其特征在于，步骤（2）中，接种量为用直径为5～10mm打孔器在一级种子上打孔，每100mL 液体培养基接种5～15块培养物，培养条件为：培养温度为28～30℃，转速60～120rpm/min，培养时间为24～72h。
7.根据权利要求5所述的制的备方法，其特征在于，步骤（3）中，接种量为每1L液体培养基，按体积比接种5～15%的二级种；培养条件为：培养温度为28～30℃；转速60～120rpm/min，通气量为0.05～0.1MPa，培养时间为24～48h。
8.根据权利要求1所述的制的备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述厚垣孢子液体培养基，其组成成分为：10～40 g/L燕麦粉、10～30 g/L黄豆粉、蔗糖5～20 g/L、磷酸二氢钾0.5～5 g/L、硫酸镁0.5～5 g/L中的3～5种，后补水定溶至1L，121℃高压灭菌30min，接种量为每1L厚垣孢子液体培养基，按体积比接种5～20%的三级种，第一阶段培养条件为：培养温度为28～30℃；转速60～120rpm/min，通气量为0.05～0.1MPa，培养时间为24～48h，第一阶段结束后，每1L培养物加入无机盐母液，使得每升培养物含0.001～0.01 g氯化锰、0.01～0.05 g硫酸锌、0.001～0.01 g氯化铁中的1～3种，并加入适量0.5～1mol/L盐酸调整pH至6～4，第二阶段培养条件为：培养温度为20～27℃；转速140～200rpm/min，通气量为0.1～0.2MPa，培养时间为24～48h。
9.根据权利要求1所述的制的备方法，其特征在于，将步骤（4）发酵液制备成菌体浓缩液，采用微孔滤膜-过滤或微孔滤膜-离心脱水的方式制得高活性孢子粉，微孔滤膜孔径选用1～10μm。
10.根据权利要求1所述的制的备方法，其特征在于，将步骤（4）发酵液制备成菌体浓缩液，在浓缩液中加入一定比例的耐热冻干保护剂、润湿分散悬浮剂、填料等，搅拌均匀后进行喷雾干燥或低温真空冷冻干燥，制得高活性孢子粉，所述耐热冻干保护剂为海藻糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇、蛋白胨、吐温20、甘氨酸、谷氨酸钠、可溶性淀粉、棉子糖、半乳糖、果糖、蔗糖、二甲基亚枫中的1～3种；所述润湿分散悬浮剂为羧甲基纤维素钠、萘磺酸盐甲醛缩合物、木质素磺酸钠、聚乙烯醇、吐温85、脱脂奶粉中的1～3种；所述填料为白炭黑、草炭、高岭土、轻质碳酸钙、凹凸棒土、硅藻土、滑石粉中的1～2种，喷雾干燥工艺参数为：进口温度85～150℃，出口温度为60～95℃，频率为3～12HZ；低温真空冷冻干燥工艺参数为：预冻温度-100～ -50℃，预冻时间为1～5h，冻干厚度1～3cm，冻干时间28～40h。
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